人工細胞構筑途徑研究進展

賀亞青， 郭振振， 劉巧玲

(湖南大學 生物學院， 長沙 410082)

人工細胞具有類似生物細胞的結構，并表現出生物細胞的一些關鍵特征和功能[1]。在人工仿生系統(tǒng)研究方面，人工細胞具有更容易控制和更穩(wěn)定的特點，被用于研究細胞特性和模擬細胞功能。人工細胞可通過自上而下和自下而上兩種途徑構筑[2](圖1)。自上而下的途徑起始于一個生物體，主要是通過減少或簡化活細胞的基因組來構建最小的細胞。在理論上，最小的細胞擁有最少數量的基因來完成最基本的生命功能，此方法旨在簡化細胞，從而有利于研究和調節(jié)復雜的生命過程。相比之下，自下而上法則利用非生命組分的人工模塊作為原材料來構建生命系統(tǒng)?；谌斯つK的可操控性和可設計性，采用自下而上的方法構筑人工細胞操作簡單，可重復性好。因此，受到生物、化學、材料等研究領域相關研究人員的廣泛關注。在這篇綜述中，主要從自上而下和自下而上兩種途徑介紹人工細胞的構建，以期為人工細胞的研究提供參考依據。

圖1 人工細胞的構筑途徑

1 人工細胞的概述

細胞是生物體內最基本的生命系統(tǒng)，是生物體結構和功能的基本單位和功能單元，與生物大分子一起完成生命的各項活動，它是最基本的“生命基石”?，F代細胞生物學不滿足于僅僅研究細胞的結構、功能和工作原理。該研究已擴展到許多新的領域，如生命起源、細胞工程技術、藥物傳遞系統(tǒng)和生物傳感器等。然而，隨著細胞生物學的迅速發(fā)展，由于生物細胞固有的復雜性和易碎性而出現很多急需解決的問題，例如在體外容易喪失活性或死亡。為了有效地克服這些問題，同時具備模擬生物細胞的功能，1957年，Chang[3]首次提出人工細胞的概念，此后很多研究者致力于人工細胞的研究，期望能夠構筑具有生命功能的最簡細胞，同時擁有比天然細胞更容易操縱和更穩(wěn)定的特點。人工細胞應該具有多種細胞結構，并能表現出一些活體生物細胞的關鍵特性，如區(qū)域化、自我繁殖和能量供應等。在理想情況下，人工細胞應該具有與活細胞相似的結構和性質，具有3個主要成分來執(zhí)行生命的基本功能：1)一種穩(wěn)定的半透膜，包裹細胞成分，保護它們免受外界環(huán)境的破壞，同時允許選擇性的物質和能量交換；2)攜帶遺傳信息，控制細胞動態(tài)并賦予細胞進化能力的生物大分子(DNA或RNA)；3)為細胞提供能量，保證自我維持、自我更新和自我處理信息的一系列代謝途徑的能量供應。目前，合成這些成分、構筑細胞結構、實現細胞的功能，以期能夠將復雜的細胞結構和功能在體外通過人工設計來實現是當前人工細胞的研究熱點。

2 人工細胞構建途徑

2.1 自上而下的構建途徑

自上而下地構建人工細胞主要是通過減少或簡化活細胞的基因組來構建“最簡單”細胞,理論上擁有最少數量的基因即能發(fā)揮最基本的生命功能。1995年，Fraser等[4]發(fā)現寄生的生殖支原體只有517個基因，但是卻擁有DNA復制、轉錄和翻譯、DNA修復、細胞運輸和能量代謝所需的基因，這是已知最簡單的生物體。如此小的基因組激發(fā)了科學家把非必需基因敲除，并保證細胞的存活率，以期得到僅擁有必需基因的“最簡單細胞”。

在自上而下的構建途徑中，用合成的基因替換生物細胞的原始基因深受研究者的青睞。目前這種方法還沒在人工真核細胞中實現，但是關于一些原始生物如病毒和細菌的構筑已經取得成功。2002年，Cello等[5]從頭合成了全長脊髓灰質炎病毒DNA(cDNA)。然后用T7RNA聚合酶將合成的cDNA轉錄為高傳染性病毒RNA。隨后，發(fā)現在未感染細胞的細胞質提取物中，病毒RNA能夠復制和翻譯，表達具有與自然病毒相似的生理和病理特性。該病毒DNA的成功合成為通過自上而下途徑構筑人工細胞提供了方向。2008年，Gibson等[6]在兩株已被破譯的Mycoplasmamycoides亞種capri GM12上設計了名為“M.mycoidesJCVI-syn1.0”的基因組序列。該基因組與原始基因組有一定的差異，有些基因被改變、增加或刪除。為了測試所設計的基因是否能夠表達與原基因組相同的性狀，2010年，他們將這些基因經過化學合成后導入酵母中，然后植入到山羊支原體細胞中，結果能表現M.mycoides的性狀，并且可以自我復制[7]。2016年，Hutchison等[8]對先前的設計進行改進，在保留必要基因的情況下，經過3個周期的設計、合成和測試，產生了JCVI-syn3.0(531個堿基對，473個基因)，其基因組比自然界中任何自主復制細胞的基因組都要小。JCVI-syn3.0保留了幾乎所有參與大分子合成和加工的基因，這大大推動了人們利用自上而下途徑構筑最簡單人工細胞的進程。此外，構筑的基因組為創(chuàng)造具有自我復制能力的新生物提供了必要的遺傳信息，不僅有助于理解細胞的最小單元，而且還提供了多種新功能，具有潛在的應用前景。

盡管利用自上而下的途徑取得了這些重要進展，但是，由于基因組的復雜性，以及敲除基因實驗較繁瑣，利用自上而下的途徑設計、改造和創(chuàng)造更完善的人工細胞還有很多問題需要解決。

2.2 自下而上的構建途徑

鑒于細胞的復雜性，在人工細胞構筑方面并不主要著眼于重建一個完整功能的人工細胞，而是將細胞的功能進行細分，分開來重構。研究者設計了自下而上的構筑途徑，該途徑不是從現有生物體開始的，而是使用非生命物質分模塊構建人工細胞，此途徑的依據是最原始的生命來自于非生命物質的進化。此外，該途徑可以將非生物世界和生物世界聯系起來，有助于探索生命的起源。在此從區(qū)室化、生長和分化、信息交流及能量供應這4個模塊來介紹人工細胞的自下而上構筑途徑，如圖2所示。

圖2 自下而上途徑構筑人工細胞區(qū)室化、生長和分化、信息交流和能量供應示意圖

2.2.1 區(qū)室化

所有已知的細胞都有質膜將細胞內物質與外界環(huán)境隔離，實現區(qū)室化。盡管生物細胞膜非常復雜且難以模仿，但人工細胞膜隔間有望具備一些天然細胞膜的關鍵特征。在人工細胞的構筑中，常利用脂質體、脂肪酸囊泡、多聚體等作為膜隔間來實現細胞的區(qū)室化。這些膜隔間的研究歷程已有報道[9]，這里主要比較它們作為人工細胞膜隔間的優(yōu)缺點。脂質體由磷脂分子自發(fā)地組裝成可緊密形成充滿水的雙層球形囊泡[10]。通常使用微流控技術生產和操縱脂質體，以重構脂質體內的功能性生物機制[11]。脂質體是一種沒有修飾的細胞膜簡化模型，具有較好的生物相容性。脂質體中存在和細胞膜相似動態(tài)遷移率，這使脂質體成為構筑人工細胞的膜隔間。但是，由于缺乏膜蛋白，脂質體比細胞膜更薄，封裝效率低。脂肪酸是一種重要的兩親性分子，它具有飽和或不飽和的疏水脂質尾部和親水的羧酸頭部。由Gebicki等最先提出一種不飽和脂肪酸在弱堿環(huán)境中能自組裝形成囊泡[12]。脂肪酸囊泡中缺乏特定結構的跨膜蛋白，對一些陽離子的通透性明顯高于脂質體，但是較高的通透性損害了對封裝物質的保護能力，營養(yǎng)物質和廢物可以被動流入和流出。脂肪酸囊泡可以經過多輪基本的生長-分裂循環(huán)，但是，脂肪酸在存在少量二價陽離子(如Mg2+)的情況下會沉淀，而Mg2+在轉錄翻譯中必不可少，所以嚴重限制了其封裝進行轉錄翻譯機制的物質。此外，脂肪酸抑制許多酶的活性，如DNA和RNA聚合酶。這兩種效應都阻礙了它們成為構筑人工細胞的主要膜隔間。多聚體是兩親性大分子嵌段共聚物合成的類似于囊泡形態(tài)的膜隔間[13]，最常用的單體是二嵌段共聚物(由一個親水域和一個疏水域組成)和三嵌段共聚物(兩個親水域被一個疏水域分開)，多嵌段、接枝和超支化共聚物也可以作為合成多聚體的單體[14]。多聚體相對于脂質體的一個主要優(yōu)勢是有更廣泛的構建模塊可供選擇，這有助于調整諸如厚度、穩(wěn)定性和滲透性等性能。但是多聚體與細胞膜成分相差較大，生物相容性低，這限制了多聚體成為人工細胞膜隔間。本課題組利用羧基富勒烯與各種貼壁細胞孵育，都能制備出巨型細胞膜囊泡[15]，其具有較好的生物相容性，同時也保留了膜的特性，以及對外源分子的表面修飾和封裝適應性，有望成為人工細胞構筑的膜隔間。

2.2.2 生長和分裂

新細胞的產生最終來自于現有細胞的生長和分裂。在這個過程中，膜隔間必須能夠生長、變形和最終分裂以及在時間和空間上進行全面調節(jié)。參與細胞生長和分裂的成分可以在體外重組，這增強了對其生物學功能的理解，也激發(fā)了人工細胞的合成。

細胞生長必須考慮膜的生長，膜生長最簡單的方法是自發(fā)地將合成的成分插入到預先形成的囊泡膜中。脂肪酸囊泡被認為可能是生物出現前的膜隔間，其生長和分裂受外部環(huán)境的驅動[9]。這些隔間是動態(tài)的，可以通過在已有的隔間中自發(fā)加入新的脂肪酸分子來生長[16]，甚至通過使用二肽催化劑來促進兩親體的募集[17]。在脂質體系統(tǒng)中，純化蛋白的簡化通路被重新構建[18]。替代性的非酶方法已利用基本的脂類化學和化學催化劑從兩親性前體生成磷脂膜[19]。然而，這兩種方法都不能合成含有不同磷脂的多樣性細胞膜。最近，通過結合有純化的蛋白質的合成磷脂，可以有效地整合到膜中，增加囊泡的大小和復雜性，解決了這一問題。

在人工細胞的構筑中使用的膜隔間應具備模擬自然細胞的膜形變，從而產生膜分裂。膜形態(tài)可以通過改變脂質或多腔室的外部環(huán)境來控制[20]，例如通過改變鹽濃度[21]、增加膜的生長[19]和使用滲透沖擊[22]。膜分裂系統(tǒng)可由體外重組的純化蛋白組成，Dynamins是一種GTP酶，它與脂質膜的外表面結合，促進囊泡的形成，其聚合作用可能由BAR結構域蛋白輔助[20]。Dynamin蛋白以螺旋結構聚合，導致膜變形成管狀，在GTP酶水解后，蛋白構象發(fā)生變化，進一步壓縮膜，導致分裂。在脂質膜中結合一些蛋白質來模擬膜的復雜性，通過脂質體包裹參與細菌分裂過程的關鍵蛋白(FtsZ和FtsA)，研究了隔膜的形成和膜的收縮。細胞在膜形變和膜分裂的發(fā)生過程中必須要有細胞骨架的參與[23]。細胞骨架使真核細胞具有抵抗變形，運輸細胞內物質并在運動過程中改變細胞形狀的能力[24]。在人工細胞合成方面，脂質囊泡中包裹細胞骨架系統(tǒng)合成的人工細胞能改變細胞的形狀[25]，并且通過滲透原理[26]，還可以調節(jié)人工細胞體積的大小。這有望使人工細胞能夠完成像遷移和有絲分裂這樣復雜的任務。像生命一樣的行為，人工細胞應該有一個自主的和遺傳的手段來改變它們的膜形態(tài)，導致分裂。到目前為止，膜分裂系統(tǒng)主要由體外重組的純化蛋白組成。為了使這些系統(tǒng)可遺傳，最終必須使用封裝的轉錄翻譯系統(tǒng)(IVTT)在內部生成這些組件。

細胞成分的空間組織對于細胞的正常功能和分裂是至關重要的。自底向上的技術不能自我調節(jié)，但卻是創(chuàng)建更復雜的空間組織的第一步。細胞內的濃度梯度和極化不僅保證了資源和遺傳物質平均分裂成兩個子細胞，而且保證了分裂所需的蛋白質機制的正確定位[27]。在將低豐度分子平均分配到子細胞中時，擴散是不可靠的。自然界的解決方案包括通過支架蛋白[28]或使用蛋白ParA/B[29]將物質均勻分布到桿狀細菌的相對兩極。這種現象還沒有被復制到人造隔間中。

2.2.3 信息交流

人工細胞除了具有生長分化還應該具有信息交流的功能，以實現細胞更復雜功能的模擬。構建的人工細胞應該能感知周圍環(huán)境并進行交流，還能根據這些信號調整自己的行為。參與細胞外通信的信號可以延伸到核酸之外，包括小分子、蛋白質和多肽，以及整個囊泡[30]。人工細胞模擬細胞信息處理的途徑發(fā)展很快，從核酸到蛋白質代謝途徑，再到細胞膜上的信號轉導和處理，以期實現對環(huán)境和內部變化做出反應[31-33]。研究者通過合成可以響應信號的門控離子通道，接收信號的受體和能夠攜帶信號的載體[34]。將人工構建的特定膜孔嵌入到隔室膜表面提供額外的調節(jié)[35]，如生成質子梯度[36]或合成多肽孔隙傳導離子和結合阻斷劑[37]。自適應調節(jié)可以通過共價修飾的方式納入這些蛋白質基礎的孔隙中，例如，通過將肽連接到OmpF蛋白上，利用pH值[38]或氧化還原環(huán)境[39]的作用來打開和關閉孔隙。然而，在選擇性信息處理中，細胞使用膜受體來觸發(fā)內部信號級聯。在自底向上的原始細胞中復制這些復雜的級聯還有待實現，但是已經采取了初步步驟將膜受體嵌入到人工表面中。離子通道的行為可以通過合成的疏水性并且可以選擇性地結合和釋放特定離子的離子載體來模擬[40]。通過細胞膜的信號轉導導致對信號的控制釋放也已經實現[41]。在不同的原始細胞群體中，通過信號擴散并開啟內部級聯反應，模擬兩個人工細胞群體間的通信[42]。模擬其他形式的類似生命交流，以實現在人工環(huán)境中調節(jié)復雜的生命活動[43]。細胞膜的自組織信息處理是由細胞膜形狀、細胞骨架動力學和信號轉導三部分的級聯反應，來實現依賴于環(huán)境的運動和形態(tài)變化。為了實現信號的級聯反應，本課題組利用從活細胞中提取的囊泡封裝一個信號網絡[44]，由不同的模塊組成，能夠依次啟動一系列的下游反應，構建了一個能接收、轉導和響應的人工信號系統(tǒng)。然而，由于真正實現細胞信息交流需要很多復雜的反應來協(xié)同完成，因此，對于人工細胞信息交流功能的模擬還有待更深入的研究。

2.2.4 能量供應

活細胞的一個獨特特征是能夠從它們所處的環(huán)境中吸收能量，并利用這些能量進行生長、運動或繁殖等活動。于是，人工細胞的研究致力于能夠將化學能或光能以耗散的方式轉換到細胞能量來源的系統(tǒng)中，以ATP的形式持續(xù)向人工細胞提供能量，模擬自然細胞的自給自足。細胞系統(tǒng)中，ATP是通過來自營養(yǎng)(細胞呼吸)或光(光合作用)的能量經過呼吸或光合電子傳遞鏈轉化為橫跨細胞膜的質子梯度來產生。光驅動的質子泵細菌視紫紅質和ATP合酶已成功地重組到小的單層囊泡[45]和聚合物囊泡[46]，產生ATP。Otrin等[47]利用接枝共聚物膜和混合接枝共聚物/脂質膜，重組ATP合酶和末端氧化酶，組裝了一個化學能驅動的ATP生成人工模塊。通過將產生ATP的前體物質分裝在基于蛋白質的液滴中能夠模擬光合作用產生能量[48]。模擬光合作用還可以合成其他涉及生物分子能量轉換的小分子，例如NAD(P)H和H2O2[49]。這些都是利用化學能轉化為ATP的過程，真正實現能量再生的報道幾乎沒有。到目前為止，還沒有合成系統(tǒng)能夠從底物(如葡萄糖)轉化成化學能，并通過煙酰胺輔因子循環(huán)耦合ATP再生。因此，自下而上合成系統(tǒng)的能量供應問題基本上沒有得到解決，從生物和化學成分設計合成能量轉換系統(tǒng)仍然是一項非常復雜的任務。為了應對這些問題，有必要對天然細胞能量供應系統(tǒng)進行巧妙的簡化。在未來的研究中可以組裝功能性部件并將其集成到功能模塊中，其中功能部分由膜蛋白或化學催化劑嵌入合適的膜隔間(脂質體或來源于活細胞的囊泡)組成，有望解決能量供應問題。此外，開發(fā)完善的膜隔間，并用ATP酶進行功能化，也可能成為未來的一項重要研究。

3 總結和展望

構筑人工細胞有助于研究細胞生命進程，聯系非生命物質與生命物質，增加生物細胞中缺乏的功能，為生命起源提供可靠的理論。利用自上而下的途徑可以深入了解生命系統(tǒng)的基本過程，從而使人造細胞發(fā)揮作用。利用自下而上途徑構建的人工細胞可以構建細胞結構和模擬部分功能，通過優(yōu)化，這些人工設計的細胞仿生系統(tǒng)有可能替代活細胞的某些功能，將在生命科學研究中發(fā)揮重要作用。自上而下途徑中通過逐個敲除現有生物的基因或者全部替換它們從而達到簡化的目的，操作比較繁瑣。通過自下而上途徑設計的系統(tǒng)只包含執(zhí)行功能所需的最小基因組，更簡單，更可控，可以克服自上而下途徑的限制。

目前的研究進展局限于構筑人工細胞所必需的基本結構和功能，如區(qū)域化、生長和分裂、信息處理和能量轉換等。控制每個納米級組件的時空分布以及解決當前人工細胞平臺的兼容性，以支持生命的所有特征還沒有實現。受熱力學限制，還沒有研究出新陳代謝和能量耗散是以哪種形式來實現真正的生命行為。沒有解決多細胞系統(tǒng)自下而上合成的挑戰(zhàn)，甚至包括組織和整個生物體等更高階的裝配。解決這些問題并非易事，要想成功實現這一復雜目標，就需要有多次且趨同的生物模擬和生物仿生，需要對信號轉導、細胞外的結構和其他超出當前技術研究范圍的生理特性進行精確控制需要多學科的合作并融合多種研究方法。因此，構建具有活細胞功能的人工細胞仍將是這個新興的跨學科研究領域的巨大挑戰(zhàn)。