腺病毒肺炎患兒細(xì)胞免疫及炎癥因子表達(dá)及其對病情判斷的臨床意義①

張慧玲 徐曉曉 張晨美

(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院PICU，杭州 310052)

腺病毒肺炎(adenovirus pneumonia,AP)的發(fā)病機(jī)制尚未闡明，目前認(rèn)為其與腺病毒本身及誘發(fā)機(jī)體炎癥反應(yīng)和免疫機(jī)制有關(guān)，其引起的肺部和全身炎癥反應(yīng)較其他病毒更重，可發(fā)展為多臟器功能衰竭[1]。支氣管和細(xì)支氣管周圍及管壁、肺泡壁、肺泡間隔和肺泡腔內(nèi)有中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等炎癥細(xì)胞浸潤，可導(dǎo)致相關(guān)炎癥因子IFN-γ、IL-6、TNF-α等表達(dá)上調(diào)[2]。另有資料顯示炎癥性應(yīng)激反應(yīng)嚴(yán)重者可破壞彈力纖維、軟骨和平滑肌，引發(fā)免疫功能下降[3]。研究證實(shí)炎癥因子表達(dá)水平越高，病情越重、免疫抑制程度越明顯，提示這些因子和免疫指標(biāo)的表達(dá)差異可用于判斷病情發(fā)展和預(yù)后[4]。本研究通過對比重癥AP(severe AP,SAP)和非SAP患兒細(xì)胞免疫及炎癥因子表達(dá)差異和相關(guān)性，探討預(yù)測AP嚴(yán)重程度的高敏感性指標(biāo)。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1一般資料 回顧性分析2017年6月～2019年6月于我院住院治療的102例AP患兒臨床資料，其中SAP患兒43例，非SAP患兒59例。研究經(jīng)醫(yī)學(xué)倫理會批準(zhǔn)，所有患兒家屬知情同意。納入標(biāo)準(zhǔn)：①參照《兒童肺炎支原體肺炎診治專家共識(2015年版)》確診為肺炎，且通過直接免疫熒光法檢測腺病毒(adenovirus,ADV)陽性[5]；②年齡2個月～10歲；③近期未服用糖皮質(zhì)激素或免疫制劑；④依從性特別差或中途要求退出者；⑤臨床研究過程中出現(xiàn)嚴(yán)重合并癥或并發(fā)癥者需進(jìn)行其他治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并腦血管、肝腎和造血系統(tǒng)等嚴(yán)重危及生命的原發(fā)性疾病者；②血標(biāo)本采集困難或標(biāo)本不正確；③合并免疫系統(tǒng)疾病或惡性腫瘤；④合并其他病原學(xué)陽性；⑤營養(yǎng)不良或生命體征不平穩(wěn)。43例SAP肺炎患兒中男性22例、女性21例，平均年齡(3.02±0.11)歲，合并呼吸道合胞病毒感染14例、肺炎支原體感染12例、流感嗜血桿菌感染8例、肺炎鏈球菌感染6例、嗜麥芽窄食單胞菌3例；59例非SAP患兒中男性31例、女性28例，平均年齡(2.97±0.20)歲，合并呼吸道合胞病毒感染19例、肺炎支原體感染16例、流感嗜血桿菌感染10例、肺炎鏈球菌感染12例、嗜麥芽窄食單胞菌2例。組間性別、年齡、感染類型基線資料分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，后續(xù)數(shù)據(jù)有可比性。

1.1.2藥物、試劑與儀器 阿昔洛韋(廣東彼迪藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字H44021367，0.1 g/支)；0.9%氯化鈉溶液(四川科倫藥業(yè)股份有限公司，國藥準(zhǔn)字H20056626，規(guī)格250 ml)，丙種球蛋白(上海生物制品研究所，國藥準(zhǔn)字S10970081，300 mg/瓶/盒)；人Th1/Th2亞群檢測試劑盒、FACSCalibur流式細(xì)胞儀(美國BD公司)；抗CD3、CD4、CD8單克隆抗體(Sino Biological Inc)。

1.2方法

1.2.1治療方案 參照AP診療共識，SAP組和非SAP組患兒均接受霧化、吸氧、止痛、鎮(zhèn)靜、吸痰止咳、糾正水電解、營養(yǎng)支持和抗菌治療(一部分給予阿昔洛韋，一部分給予抗生素)[6]。阿昔洛韋溶于0.9%氯化鈉溶液靜脈滴注，輸注濃度1～2 mg/ml、劑量10 mg/(kg·d)，頻次1次/d，共7 d，期間檢查外周血象與體溫，二者恢復(fù)正常可停藥。SAP組患兒在常規(guī)治療基礎(chǔ)上根據(jù)醫(yī)囑給予丙種球蛋白0.1～0.2 g/(kg·d)，連續(xù)用藥1～2 d為1個療程；2組患兒均監(jiān)測相關(guān)血清學(xué)指標(biāo)，直至ADV呈陰性或病灶縮小，若疾病進(jìn)展或出現(xiàn)不可耐受不良反應(yīng)可調(diào)整劑量或停藥。

1.2.2觀察指標(biāo)

1.2.2.1炎癥因子 分別于入院時(急性期)和穩(wěn)定期(療程結(jié)束后監(jiān)測患兒體內(nèi)ADV陽性轉(zhuǎn)陰性，并通過肺部胸片觀察肺部陰影顯著減小)抽取兩組患兒靜脈血5 ml，置于含促凝劑的真空采血管中，20 min內(nèi)4℃、2 000 r/min離心20 min，分離血清后置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?；參照人Th1/Th2亞群檢測試劑盒說明書，流式細(xì)胞術(shù)測定血清IFN-γ、IL-6、TNF-α水平。

1.2.2.2細(xì)胞免疫 分別于入院時和穩(wěn)定期按上述方式采靜脈血，參照淋巴細(xì)胞亞群檢測試劑說明書，加入不同熒光物標(biāo)記的抗CD3、CD4、CD8單克隆抗體與待測成分20℃避光孵育15 min，設(shè)定陽性參數(shù)值；流式細(xì)胞術(shù)測定本底參數(shù)，軟件計(jì)算CD3、CD4、CD8比例及CD4/CD8。

1.2.2.3臨床療效 根據(jù)臨床癥狀和胸部影像學(xué)判斷，顯效：無發(fā)熱、咳嗽、呼吸困難等臨床癥狀，肺部啰音及哮鳴音消失，胸部影像學(xué)提示病灶完全或明顯吸收；有效：無發(fā)熱及呼吸困難，咳嗽、肺部及哮鳴音有所減少，胸部影像學(xué)提示病灶有所吸收；無效：上述臨床癥狀、體征及胸部影像學(xué)無改善或加重，甚至死亡；將顯效和有效視為治療有效，將患者分為有效組和無效組，并比較其IFN-γ、IL-6、TNF-α值及CD3、CD4、CD4/CD8水平。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用EpiData3.1軟件校正所有數(shù)據(jù)，采用SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；計(jì)量資料采用配對樣本t檢驗(yàn)；多連續(xù)變量采用非配對t檢驗(yàn)；非正態(tài)分布計(jì)量資料采用秩和檢驗(yàn)；非參數(shù)Mann-Whitney法檢驗(yàn)分級資料；Spearman相關(guān)系數(shù)分析細(xì)胞免疫、炎癥因子相關(guān)性及其與AP臨床癥狀相關(guān)性；對病情發(fā)展有鑒別診斷意義的自變量(P<0.05)均引入二分類Logistic多元回歸方程，分析預(yù)報模型準(zhǔn)確率；ROC曲線比較細(xì)胞免疫、炎癥因子對AP病情的預(yù)測價值；以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1細(xì)胞免疫指標(biāo)、炎癥因子比較 治療前，非SAP組IFN-γ、IL-6、TNF-α水平低于SAP組，CD3、CD4、CD4/CD8水平高于SAP組(P<0.05)；治療后，兩組IFN-γ、IL-6、TNF-α水平低于治療前(P<0.05)，CD3、CD4、CD4/CD8水平高于治療前(P<0.05)；治療后，非SAP組IFN-γ、IL-6、TNF-α水平低于SAP組(P<0.05)，CD3、CD4、CD4/CD8水平高于SAP組(P<0.05)，見表1。

2.2治療有效組和無效組細(xì)胞免疫指標(biāo)、炎癥因子比較 治療1周后，SAP組治療有效34例，無效9例；非SAP組治療有效53例，無效6例。SAP組和非SAP組患兒治療有效組IFN-γ、IL-6、TNF-α水平低于無效組，CD3、CD4、CD4/CD8水平高于無效組(P<0.05)，見表2。

2.3細(xì)胞免疫、炎癥因子相關(guān)性 CD3與CD4、CD4/CD8均呈顯著正相關(guān)(P<0.05)； IFN-γ與IL-6、TNF-α均呈顯著正相關(guān)(P<0.05)；CD3、CD4、CD4 / CD8與IFN-γ、 IL-6、 TNF-α均呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)，見表3。

表1 細(xì)胞免疫指標(biāo)、炎癥因子比較

表2 治療有效組和無效組細(xì)胞免疫指標(biāo)、炎癥因子比較

表3 細(xì)胞免疫、炎癥因子相關(guān)性

表4 細(xì)胞免疫、炎癥因子與AP臨床癥狀相關(guān)性

2.4細(xì)胞免疫、炎癥因子與AP臨床癥狀相關(guān)性 CD3、CD4、CD4/CD8與AP臨床癥狀呈顯著正相關(guān)(P<0.05)；IFN-γ、IL-6、TNF-α與AP臨床癥狀呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)，見表4。

2.5細(xì)胞免疫、炎癥因子判斷AP病情的敏感性和特異性 利用相關(guān)因子所建立的Logistic回歸模型對所有樣本進(jìn)行診斷測試，以無效預(yù)報為疾病進(jìn)展，有效預(yù)報為病情穩(wěn)定，結(jié)果顯示建立CD3、CD4、CD4/CD8、IFN-γ、IL-6、TNF-α預(yù)測模型對AP患兒近期病情轉(zhuǎn)歸判斷總準(zhǔn)確率為91.18%(93/102)，提示該模型預(yù)報準(zhǔn)確性較高。因此，分別單獨(dú)和聯(lián)合各指標(biāo)構(gòu)建ROC曲線，發(fā)現(xiàn)IFN-γ、IL-6、TNF-α聯(lián)合檢測曲線下面積(AUC) 為0.560～0.810、診斷敏感性為68.87%、特異性為70.01%，高于IFN-γ聯(lián)合IL-6、IFN-γ聯(lián)合TNF-α、IL-6聯(lián)合TNF-α檢測；CD4/CD8單獨(dú)檢測敏感性和特異性高于二聯(lián)或三聯(lián)檢測；將IFN-γ、IL-6、TNF-α聯(lián)合CD4/CD8檢測AUC為0.736～0.925、診斷敏感性為9.63%、特異性為0.33%，高于單獨(dú)檢測或兩兩聯(lián)合檢測(P<0.05)，見表5。

表5 細(xì)胞免疫、炎性因子判斷AP病情判斷的效能指標(biāo)

3 討論

ADV和炎癥性介質(zhì)可引起支氣管和細(xì)支氣管黏膜水腫、充血、壞死脫落，壞死物阻塞管腔，加重疾病發(fā)展；同時引起黏液分泌增加，阻塞管腔，導(dǎo)致氣管及氣道失去正常結(jié)構(gòu)而影響正常T細(xì)胞功能[7,8]。兒科病房相關(guān)資料顯示，AP患兒治療效果與預(yù)后較其他肺炎患兒顯著降低，與ADV病毒復(fù)制快、復(fù)制周期短而短時間內(nèi)引起大量細(xì)胞溶解和死亡有關(guān)[9]。炎癥反應(yīng)失常，局部炎癥迅速分散導(dǎo)致感染加重。Park等[10]構(gòu)建大鼠模型發(fā)現(xiàn)，當(dāng)細(xì)胞炎癥上調(diào)導(dǎo)致感染加重同時，可在外周循環(huán)及肺泡間質(zhì)中發(fā)現(xiàn)大量細(xì)胞因子與炎癥介質(zhì)，且大量輔助性T細(xì)胞表達(dá)水平下降，考慮AP的發(fā)展與炎癥因子、細(xì)胞免疫有關(guān)。

T細(xì)胞在整個免疫系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)中起重要調(diào)控作用，AP發(fā)生后，機(jī)體或細(xì)胞內(nèi)高活性分子大量產(chǎn)生，氧化系統(tǒng)與抗氧化系統(tǒng)嚴(yán)重失衡，從而導(dǎo)致組織免疫功能損傷[11]。CD4作為輔助性T細(xì)胞，當(dāng)病毒入侵時可對免疫做出應(yīng)答，指揮身體對抗。CD3可與T細(xì)胞抗原受體相連，參與T細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。CD8作為抑制性T細(xì)胞，特異性免疫中起識別和呈遞抗原作用，可直接殺滅病毒。CD4、CD8 T淋巴細(xì)胞亞群相對比值為輔助性T細(xì)胞和異質(zhì)性T細(xì)胞間的平衡，可直接反映AP患兒身體免疫情況，其水平上調(diào)或下降均說明機(jī)體受損[12]。T細(xì)胞亞群表達(dá)水平直接反映機(jī)體免疫功能，Tang等[13]報道指出，基線資料無差異的AP患兒CD3、CD4、CD8水平不一致可導(dǎo)致預(yù)后不同，T細(xì)胞亞群水平越高，患兒疾病轉(zhuǎn)歸能力越好，提示細(xì)胞免疫對病情發(fā)展有重要價值。鄭麗麗等[14]提出AP患兒急性期和穩(wěn)定期細(xì)胞免疫水平存在顯著差異，提示T細(xì)胞亞群水平與疾病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)急性期SAP組T細(xì)胞亞群水平低于非SAP組，且穩(wěn)定期T細(xì)胞亞群水平均高于急性期，與上述文獻(xiàn)相符，提示細(xì)胞免疫參與AP發(fā)展。為進(jìn)一步探討該作用機(jī)制，分析治療有效組和無效組患兒細(xì)胞免疫功能發(fā)現(xiàn)，無效組患兒CD3、CD4、CD4/CD8水平顯著低于有效組，且CD3、CD4、CD4/CD8水平與AP臨床癥狀呈顯著正相關(guān)，表明細(xì)胞免疫是反映AP患兒病情的獨(dú)立因子。細(xì)胞免疫與細(xì)胞因子具有相關(guān)性，本研究相關(guān)性結(jié)果與既往報道一致[15]。炎癥是機(jī)體對外來刺激產(chǎn)生的一種病理反應(yīng)過程，在這一過程中，輔助性T細(xì)胞失活而使一些細(xì)胞因子大量表達(dá)。如IL-1、IL-6、IL-8、IFN-γ、TNF-α等可促進(jìn)炎癥細(xì)胞聚集、活化和炎癥介質(zhì)釋放，可直接刺激發(fā)熱中樞引起全身發(fā)熱。IL-8同時可趨化中性粒細(xì)胞至炎癥部位，加重炎癥癥狀。在許多炎癥性疾病中都可檢測到上述細(xì)胞因子水平升高，Leyun等[16]給大鼠注射IFN-γ細(xì)胞因子，觀察到炎癥現(xiàn)象，且處理后大鼠細(xì)胞免疫呈抑制狀態(tài)，證明細(xì)胞因子可加重炎癥而降低細(xì)胞免疫。基于上述研究結(jié)果，目前已開始利用細(xì)胞因子抑制劑治療炎癥性疾病并降低細(xì)胞免疫取得顯著效果。本研究結(jié)果顯示，治療后細(xì)胞因子水平顯著下降，說明改善炎癥狀態(tài)對病情惡性進(jìn)展有顯著效果。而細(xì)胞免疫、炎癥因子與AP患兒臨床癥狀顯著相關(guān)，ROC曲線分析顯示其對預(yù)后判斷具有較高敏感性和特異性。

細(xì)胞免疫和炎癥因子均參與AP患兒機(jī)體免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)過程，密切關(guān)注相關(guān)指標(biāo)變化可為判斷疾病進(jìn)展提供依據(jù)。