GTPBP4基因沉默介導(dǎo)EGFR/PI3K/AKT信號(hào)通路對(duì)順鉑誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞凋亡的調(diào)控機(jī)制

鄧淑文 夏紅星 (南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院疼痛科，衡陽 421002)

胃癌是起源于胃黏膜上皮的惡性腫瘤，胃癌晚期患者的5年生存率較低，因此研究胃癌發(fā)生發(fā)展過程中潛在的分子機(jī)制對(duì)尋找有效的治療方案十分重要[1,2]。人GTP結(jié)合蛋白4 (GTP binding protein,GTPBP4)是GTPBPs家族成員，主要位于人染色體10p15-p14區(qū)域，是長(zhǎng)度為12 285的線性DNA序列，與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)[3]。研究發(fā)現(xiàn)敲低GTPBP4基因表達(dá)能夠顯著抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)，GTPBP4在結(jié)直腸癌中表達(dá)顯著上調(diào)，與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)[4,5]。Li等[6]關(guān)于胃癌的實(shí)驗(yàn)表明，GTPBP4在胃癌組織和細(xì)胞中表達(dá)顯著增強(qiáng)，通過調(diào)節(jié)p53活性促進(jìn)胃癌進(jìn)展。眾多信號(hào)通路與胃癌進(jìn)展相關(guān)，本研究進(jìn)一步探討GTPBP4與胃癌發(fā)病的關(guān)系，并探討其在胃癌中的具體調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 人胃黏膜上皮細(xì)胞株和胃癌細(xì)胞株均購(gòu)自中科院上海生命科學(xué)研究院；RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)自Invitrogen；順鉑購(gòu)自山東齊魯制藥；TRIzol試劑盒購(gòu)自Gibco；RT-PCR試劑盒購(gòu)自大連寶生物；PCR引物序列由華大基因合成；BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自Sigma；Western blot抗體購(gòu)自Abcam；MTT溶液、Matrigel基質(zhì)膠購(gòu)自北京索萊寶；Annexin V-FITC/PI雙染試劑盒購(gòu)自貝博生物；MTX-211 EGFR/PI3K/AKT通路特異性抑制劑購(gòu)自Selleck。

1.2方法

1.2.1GTPBP4基因沉默及過表達(dá)重組質(zhì)粒構(gòu)建 采用NCBI查詢?nèi)薌TPBP4 mRNA序列(KJ8985 11.1)，BLOCK-iTTMRNAi Designer網(wǎng)站在線設(shè)計(jì)GTPBP4的shRNA序列(5′-CACCGGATGTGCACAGTGATCAAGACGAATCTTGATCACTGTGCACATC-C-3′)。參照GenBank基因序列，采用Primer 5.0設(shè)計(jì)GTPBP4引物(F：5′-TCGTTGATGTCTGTGAG-CTTC-3′，R：3′-GGTGCTTCTAGACAGTTGTTCA-5′)，并分別在上下游引物加上EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)。經(jīng)酶切后連接至基因片段，轉(zhuǎn)至DH 5α大腸桿菌克隆，DNA試劑盒提取重組載體，-80℃保存。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)及分組轉(zhuǎn)染 將人胃癌細(xì)胞株MGC-803、NCI-N87、SGC-7901、MKN-45及正常人胃黏膜上皮細(xì)胞株GES-1培養(yǎng)于RPMI1640培養(yǎng)基。qRT-PCR和Western blot檢測(cè)各細(xì)胞株GTPBP4表達(dá)，篩選胃癌細(xì)胞中GTPBP4表達(dá)量最高的細(xì)胞株。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期胃癌細(xì)胞株并分為6組：Blank組(不做處理)、陰性對(duì)照組(轉(zhuǎn)染含無關(guān)序列的重組質(zhì)粒)、GTPBP4 shRNA組(轉(zhuǎn)染含GTPBP4 shRNA的重組質(zhì)粒)、GTPBP4過表達(dá)組(轉(zhuǎn)染含GTPBP4 片段的重組質(zhì)粒)、EGFR/PI3K/AKT inhibitor組(針對(duì)EGFR和PI3K基因靶點(diǎn)的EGFR/PI3K/AKT通路抑制劑 MTX-211處理細(xì)胞)、Combined treatment組(EGFR/PI3K/AKT通路抑制劑聯(lián)合GTPBP4 shRNA處理)。轉(zhuǎn)染時(shí)將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于6孔板，調(diào)整細(xì)胞密度為2×105個(gè)/孔，按照Lipofectamine 2000試劑盒說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48 h后取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，給予順鉑處理并進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3半數(shù)抑制濃度(IC50)測(cè)定 取100 μl細(xì)胞(2 × 105個(gè)/ml)接種于96孔板，給予順鉑(1 mg/ml,生理鹽水溶解)刺激。RPMI1640培養(yǎng)液稀釋順鉑至終濃度分別為1、2、4、8、16、32、64 μg/ml，100 μl/孔，各濃度設(shè)4個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照孔，加入等量不含順鉑的培養(yǎng)液。培養(yǎng)48 h后加入MTT溶液 (5 mg/ml)，20 μl/孔，孵育4 h后加入150 μl DMSO，振蕩10 min。全自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm 處吸光度。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(%)=(1-A實(shí)驗(yàn)組/A對(duì)照組)×100%。計(jì)算順鉑對(duì)胃癌細(xì)胞MKN-45的IC50。

1.2.4qRT-PCR檢測(cè)基因相對(duì)表達(dá)水平 采用TRIzol試劑盒一步法提取總RNA，取3 μg總RNA，采用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。按照SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒說明書進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)，以GAPDH為內(nèi)參。引物序列見表1。2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.5Western blot檢測(cè)蛋白相對(duì)表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，將200 μl含蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液加入培養(yǎng)孔。細(xì)胞離心后采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，50 μg/孔行SDS-PAGE凝膠電泳。轉(zhuǎn)膜，脫脂牛奶封閉后加入GTPBP4、Bax、Bcl-2、EGFR、PI3K、AKT、p-PI3K和p-AKT兔抗人一抗，4℃孵育過夜，TBST沖洗后加入山羊抗兔二抗IgG，37℃孵育1 h，TBST沖洗，加入ECL反應(yīng)液反應(yīng)1 min，觀察結(jié)果。蛋白相對(duì)表達(dá)量為目標(biāo)條帶與內(nèi)參條帶灰度值比值。

表1 引物序列

1.2.6MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖活力 轉(zhuǎn)染后1～5 d取順鉑處理的胃癌細(xì)胞，20 μl/孔加入5 g/L MTT溶液培養(yǎng)4 h，100 μl/孔加入DMSO，充分振蕩。酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm處吸光度，繪制生長(zhǎng)曲線。

1.2.7Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 采用MEM培養(yǎng)基稀釋Matrigel膠，取100μl充分混勻的Matrigel膠加入Transwell小室上室，室溫放置2 h。轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞以DMEM培養(yǎng)基重懸，稀釋至3×105個(gè)/ml，將100 μl細(xì)胞懸液加入下室，同時(shí)加入600 μl含10%血清的DMEM培養(yǎng)基。連續(xù)培養(yǎng)24 h后行結(jié)晶紫染色并在光學(xué)顯微鏡下拍照，計(jì)算跨膜細(xì)胞數(shù)。隨機(jī)選取3～5個(gè)視野,ImageJ軟件計(jì)算下室被結(jié)晶紫染色的細(xì)胞數(shù)。

1.2.8流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 采用Annexin V-FITC/PI雙染試劑盒檢測(cè)MKN-45細(xì)胞凋亡情況。PBS洗滌細(xì)胞，2 000 r/min離心5 min，加入500 μl結(jié)合緩沖液，調(diào)整細(xì)胞密度為4×105個(gè)/ml，加入5 μl Annexin V-FITC并混勻，避光室溫孵育10 min。加入5 μl PI混勻，5 min內(nèi)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)波長(zhǎng)480、530 nm處檢驗(yàn)FITC，>575 nm處檢測(cè)PI。

2 結(jié)果

2.1GTPBP4在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)情況 與正常人胃黏膜上皮細(xì)胞株GES-1相比， 人胃癌細(xì)胞株中GTPBP4表達(dá)上升(P<0.05)，表明GTPBP4在胃癌細(xì)胞中過表達(dá)。Vimentin蛋白在SGC-7901細(xì)胞中表達(dá)最高，N-cadherin和MMP-2蛋白在MKN-45細(xì)胞中表達(dá)最高(P<0.05)。4種人胃癌細(xì)胞株中，MKN-45細(xì)胞GTPBP4表達(dá)最高(P<0.05)，且上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化程度最高，因此選取MKN-45作為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株，見圖1。

2.2MKN-45細(xì)胞株順鉑誘導(dǎo)濃度確定 隨順鉑濃度升高，MKN-45細(xì)胞抑制率逐漸上升，當(dāng)順鉑濃度為21.36 μg/ml時(shí)，MKN-45細(xì)胞的抑制率接近50%，因此，認(rèn)為順鉑對(duì)MKN-45細(xì)胞的IC50為 21.36 μg/ml。

2.3順鉑下調(diào)胃癌細(xì)胞GTPBP4表達(dá) qRT-PCR和Western blot結(jié)果顯示，順鉑處理后MKN-45細(xì)胞GTPBP4表達(dá)顯著下降(P<0.05)，見圖2。

2.4GTPBP4基因沉默抑制EGFR/PI3K/AKT信號(hào)通路激活 與Blank組相比，GTPBP4 shRNA組、EGFR/PI3K/AKT inhibitor組及Combined treatment組EGFR/PI3K/AKT通路相關(guān)因子表達(dá)顯著降低，且Combined treatment組抑制效果最為顯著(P<0.05)。GTPBP4過表達(dá)組EGFR/PI3K/AKT通路相關(guān)因子表達(dá)顯著提高(P<0.05)，表明該通路被激活。Blank組和NC組各指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖3。

2.5GTPBP4基因沉默通過EGFR/PI3K/AKT信號(hào)通路抑制順鉑誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞增殖活力與Blank組相比，GTPBP4 shRNA組、EGFR/PI3K/AKT inhibitor組及Combined treatment組細(xì)胞活力顯著降低，且Combined treatment組細(xì)胞活力降低最為顯著(P<0.05)，GTPBP4過表達(dá)組細(xì)胞增殖活力顯著增強(qiáng)(P<0.05)。Blank組和NC組各時(shí)間點(diǎn)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖4。

圖1 GTPBP4表達(dá)測(cè)定和胃癌細(xì)胞株篩選Fig.1 Detection of GTPBP4 expression and screening of gastric cancer cell lineNote:Compared with GES-1,*.P<0.05.

圖2 MKN-45細(xì)胞順鉑處理前后GTPBP4表達(dá)Fig.2 GTPBP4 expression in MKN-45 cells before and after treating by cisplatinNote:Compared with before treatment,*.P<0.05;1.Before treatment；2.After treatment.

圖3 各組EGFR/PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)因子表達(dá)

圖4 各組細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞增殖活力Fig.4 Cell proliferative activity in each group at different time pointsNote:Compared with Blank group,*.P<0.05；compared with Combined treatment group,#.P<0.05.

2.6GTPBP4基因沉默介導(dǎo)EGFR/PI3K/AKT信號(hào)通路抑制胃癌細(xì)胞侵襲 與Blank組相比，GTPBP4 shRNA組、EGFR/PI3K/AKT inhibitor組及Combined treatment組細(xì)胞侵襲數(shù)顯著減少，且Combined treatment組減少最為顯著(P<0.05)，GTPBP4過表達(dá)組細(xì)胞侵襲顯著增強(qiáng)(P<0.05)。Blank組和NC組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖5。

2.7GTPBP4沉默可抑制EGFR/PI3K/AKT信號(hào)通路引起順鉑誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞凋亡 與Blank組相比，順鉑處理后GTPBP4 shRNA組、EGFR/PI3K/AKT inhibitor組及Combined treatment組胃癌細(xì)胞凋亡率明顯上升，Bax、Caspase-3表達(dá)上調(diào)，且Combined treatment組上升最為顯著 (P<0.05)，GTPBP4過表達(dá)組凋亡率明顯下降，Bcl-2表達(dá)下調(diào)(P<0.05)。表明GTPBP4基因沉默可促進(jìn)順鉑誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞凋亡。Blank組和NC組細(xì)胞凋亡率及蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖6。

圖5 各組細(xì)胞侵襲能力(×200)

圖6 各組細(xì)胞凋亡情況

3 討論

GTPBP4可調(diào)控細(xì)胞的增殖和周期，其在肝癌、結(jié)腸癌中表達(dá)失調(diào)，促進(jìn)胃癌進(jìn)展[6-9]。但GTPBP4調(diào)控胃癌發(fā)病的分子機(jī)制尚未完全明確，本研究從分子生物學(xué)角度出發(fā)，探討基因與下游信號(hào)通路對(duì)胃癌的影響，結(jié)果證實(shí)GTPBP4基因可通過EGFR/PI3K/AKT信號(hào)通路影響胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為。

順鉑是目前晚期胃癌患者的一線化療藥物，與DNA交聯(lián)促進(jìn)DNA雙鏈斷裂從而誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡[10-13]。本研究進(jìn)一步探討順鉑誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡過程中的分子網(wǎng)絡(luò)，對(duì)順鉑處理后胃癌細(xì)胞中GTPBP4表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，相比于處理前，順鉑處理后可顯著抑制胃癌細(xì)胞GTPBP4表達(dá)。EGFR信號(hào)通路是胃癌發(fā)病和進(jìn)展的重要通路，研究表明，敲低ADAM17基因可抑制EGFR信號(hào)通路激活進(jìn)而抑制胃癌細(xì)胞增殖和侵襲[14,15]。PI3K/AKT信號(hào)通路被證實(shí)在胃癌細(xì)胞中顯著激活，抑制該通路激活可促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡[16,17]。本研究對(duì)EGFR/PI3K/AKT通路相關(guān)因子表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，沉默GTPBP4可抑制EGFR/PI3K/AKT通路相關(guān)因子表達(dá)并對(duì)胃癌細(xì)胞進(jìn)行調(diào)控，與既往研究結(jié)論一致。進(jìn)一步證實(shí)EGFR/PI3K/AKT通路的活化情況受GTPBP4基因表達(dá)影響。

對(duì)各組細(xì)胞增殖活力及侵襲情況進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，相比于Blank組，GTPBP4基因沉默組及EGFR/PI3K/AKT通路抑制劑組細(xì)胞增殖及侵襲顯著降低，且聯(lián)合處理效果更為明顯。Caspase-3是介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵蛋白水解酶，也是凋亡執(zhí)行過程中的關(guān)鍵效應(yīng)分子[18-20]。研究發(fā)現(xiàn)沉默Glut1基因能夠促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞中Caspase-3表達(dá)，抑制細(xì)胞增殖分化，促進(jìn)凋亡[21]。另有研究證實(shí)CCNB1基因沉默可調(diào)控胰腺癌細(xì)胞Caspase-3表達(dá)[22]。本研究采用Western blot及qRT-PCR對(duì)各組細(xì)胞凋亡相關(guān)因子進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，沉默GTPBP4或抑制EGFR/PI3K/AKT通路可促進(jìn)Bax及Caspase-3表達(dá)，下調(diào)凋亡抑制因子Bcl-2表達(dá)，進(jìn)一步證實(shí)GTPBP4對(duì)胃癌細(xì)胞增殖凋亡的影響是通過調(diào)控Caspase-3及凋亡相關(guān)因子表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果進(jìn)一步表明，沉默GTPBP4或抑制EGFR/PI3K/AKT通路可進(jìn)一步促進(jìn)順鉑誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞凋亡。

綜上所述，GTPBP4基因沉默可抑制EGFR/PI3K/AKT通路激活進(jìn)而抑制胃癌細(xì)胞增殖、侵襲，促進(jìn)順鉑誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞凋亡，在胃癌診斷及分子靶向治療中具有重要意義。本研究也存在一定局限性，如證實(shí)GTPBP4在胃癌中作用的方法可進(jìn)一步完善，可進(jìn)一步探討影響GTPBP4表達(dá)的上游調(diào)控因子。課題組將進(jìn)一步增加裸鼠荷瘤等實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證GTPBP4的作用，探討影響GTPBP4表達(dá)的上游miRNA等。