參附強(qiáng)心丸對(duì)2型心腎綜合征模型大鼠腎臟的保護(hù)作用及HIF-VEGF-Notch信號(hào)通路的影響

趙 巍 劉學(xué)政 張明珠 李曉涵 支 勇② (天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津 300000)

伴隨著社會(huì)整體老齡化的發(fā)展，心臟和腎臟疾病的發(fā)病率逐年上升[1]。荷蘭學(xué)者Bongartz[2]在2005年提出“心腎綜合征”，其主要特征為腎功能不全并且伴隨心力衰竭。近年來(lái)，心腎綜合征的發(fā)病率顯著上升，但臨床上尚無(wú)有效治療手段，患者死亡率較高，從而使得心腎綜合征備受關(guān)注。心腎綜合征疾病的血流動(dòng)力學(xué)紊亂、腎臟功能受損導(dǎo)致體內(nèi)尿毒癥毒素的聚積，最終引發(fā)心臟以及腎臟共同衰竭，因此抑制心肌以及腎臟纖維化，改善心臟及腎臟功能是心腎綜合征的防治重點(diǎn)[3-5]。相關(guān)研究報(bào)道，參附強(qiáng)心丸可以通過(guò)調(diào)控腎素原受體從而抑制心腎細(xì)胞凋亡，達(dá)到保護(hù)心臟以及腎臟的作用[6]。此外，參附強(qiáng)心丸對(duì)腹主動(dòng)脈縮窄致慢性心衰大鼠心肌 Bcl-2 表達(dá)上調(diào)起到抗心衰以及抑制大鼠心肌纖維化的作用[7]。但是參附強(qiáng)心丸對(duì)于心腎綜合征腎臟功能的影響以及通路研究報(bào)道較少。因此，本研究采用相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的手術(shù)方法構(gòu)建 2 型心腎綜合征大鼠模型[8]，模擬臨床2型心腎綜合征病理特點(diǎn)，探討參附強(qiáng)心丸對(duì) 2型心腎綜合征大鼠腎臟功能的影響并闡述其相關(guān)的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 參附強(qiáng)心丸(天津中新藥業(yè)集團(tuán)達(dá)仁堂制藥廠，生產(chǎn)批號(hào)：2018062438)；SPF級(jí)SD大鼠購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0011；IS試劑盒購(gòu)自上海美軒生物科技有限公司；Ucr試劑盒購(gòu)于上海晶抗生物工程有限公司；Scr試劑盒以及BUN試劑盒購(gòu)于江蘇菲亞生物科技有限公司；ECL Plus 超敏發(fā)光液、RPMI1640培養(yǎng)基、考馬斯亮藍(lán)試劑購(gòu)自北京索萊寶公司；TRIzol試劑盒購(gòu)自invitrogen公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；RIPA裂解液Ⅰ、HIF一抗、VEGF一抗、Notch1一抗以及GAPDH一抗購(gòu)于英國(guó)Abcam公司；山羊血清以及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。倒置顯微鏡(日本 OLYMPUS)；高速離心機(jī)(Eppendorf，德國(guó))；多功能酶標(biāo)儀(Thermo Fisher，美國(guó))； ABI 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀( ABI，美國(guó))；轉(zhuǎn)膜儀及電泳儀(北京六一儀器廠)；冷凍冷藏兩用冰箱(Siemens，德國(guó))。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物建模、分組及給藥 采用3%的戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，待大鼠麻醉后固定大鼠，下氣管插管，并使用呼吸機(jī)輔助呼吸，沿胸骨左緣第3到4肋間切開皮膚、鈍性分離肌肉組織以暴露心臟，對(duì)左冠狀動(dòng)脈前降支進(jìn)行結(jié)扎，誘發(fā)心梗。2周后采用同樣方法麻醉大鼠，沿腹中線切開，切除右腎以及左腎動(dòng)脈前上支、前下支、背支結(jié)扎的5/6腎切除術(shù)，從而誘發(fā)腎功能不全。取10只大鼠在同樣的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行心包膜及腎包膜撕開并不結(jié)扎或者切除的假手術(shù)，作為對(duì)照組(假手術(shù)對(duì)照組)。將造模成功的30只大鼠隨機(jī)分為3組：模型組(心腎綜合征組)、參附強(qiáng)心丸治療組(心腎綜合征+參附強(qiáng)心丸)、卡托普利組(心腎綜合征+卡托普利)，每組10只。本研究中采用灌胃方式給藥，參附強(qiáng)心丸治療組給藥劑量按照大鼠體重計(jì)算(3.3 g/kg)，卡托普利組(2.3 mg/kg)。假手術(shù)組以及模型對(duì)照組給予等量生理鹽水。

1.2.2生化指標(biāo)檢測(cè) 通過(guò)心尖取血的方法收集各組大鼠的血液標(biāo)本，4℃、5 000 r/min離心10 min，去上清，置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。采用代謝籠對(duì)大鼠尿液進(jìn)行收集，計(jì)算24 h尿液量，各組大鼠尿液標(biāo)本置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。采用相?yīng)試劑盒按照操作說(shuō)明書對(duì)于BUN、IS、Scr以及Ucr水平進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.3HE及Masson染色 各組大鼠經(jīng)心尖取血，開胸、開腹取出腎臟，置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h后脫水、包埋以及切片處理。按標(biāo)準(zhǔn)步驟對(duì)各組切片進(jìn)行HE以及Masson染色。

1.2.4α-SMA及Collagen Ⅰ免疫組化染色 將1.2.3制備的切片按照免疫組化標(biāo)準(zhǔn)步驟，進(jìn)行α-SMA及Collagen Ⅰ染色。采用倒置顯微鏡對(duì)染色結(jié)果進(jìn)行拍照記錄。有棕色細(xì)絲網(wǎng)或顆粒為陽(yáng)性表達(dá)，采用IPWIN60圖像分析軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。

1.2.5qRT-PCR檢測(cè)檢測(cè)腎臟組織HIF-VEGF-Notch信號(hào)通路相關(guān)mRNA表達(dá) 收集各組大鼠腎臟組織，TRIzol試劑盒提取總RNA，檢測(cè)RNA濃度及純度，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)條件：75℃ 預(yù)變性120 s;95℃ 變性 60 s;60℃ 退火 50 s;72℃延伸60 s，共40個(gè)循環(huán)。GAPDH為內(nèi)參，采用ABI 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀對(duì)擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行分析,引物序列見表1。

1.2.6Western blot檢測(cè)腎臟組織HIF-VEGF-Notch信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá) 收集各組大鼠腎臟組織，加入RIPA裂解20 min，離心3 min，收集上清。采用BCA法對(duì)提取蛋白濃度進(jìn)行測(cè)定。將蛋白樣品置于100℃水浴變性3 min，各樣品取15 μg 蛋白，采用SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，室溫條件下封閉1.5 h，加入稀釋的HIF一抗(1：2 000)、VEGF一抗(1∶1 000)、Notch1一抗( 1∶1 000)、GAPDH一抗( 1∶2 500)，4℃搖床孵育過(guò)夜。采用PBST將PVDF膜洗凈并加入HRP標(biāo)記的IgG，孵育后ECL顯影拍照記錄，采用Image J軟件分析條帶灰度值，各目的條帶灰度與相應(yīng)的GAPDH條帶灰度比值作為蛋白相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物序列

2 結(jié)果

2.1參附強(qiáng)心丸對(duì)腎臟相關(guān)功能指標(biāo)的影響 與對(duì)照組比較，模型組大鼠BUN、Scr水平均明顯升高(P<0.01)，IS、Ucr水平明顯降低(P<0.05)；與模型組相比，參附強(qiáng)心丸組大鼠BUN、Scr水平明顯降低(P<0.05)，IS、Ucr水平明顯升高(P<0.05)；參附強(qiáng)心丸組與卡托普利組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖1。

2.2大鼠腎臟組織染色 模型組大鼠腎小管上皮細(xì)胞萎縮程度高于對(duì)照組，參附強(qiáng)心丸組大鼠腎小管上皮細(xì)胞萎縮程度低于模型組大鼠，見圖2。

2.3大鼠腎臟組織α-SMA以及Collagen Ⅰ的表達(dá) 相比于模型組，對(duì)照組大鼠腎臟α-SMA以及Collagen Ⅰ 表達(dá)顯著減少(P<0.01)，參附強(qiáng)心丸組大鼠腎臟與模型組相比α-SMA以及Collagen Ⅰ 表達(dá)降低(P<0.05)，見表2、圖3。

圖1 各組大鼠生化指標(biāo)比較Fig.1 Comparison of biochemical index of rats in each groupNote:*.P<0.05；**.P<0.01；***.P<0.001.

2.4HIF-VEGF-Notch信號(hào)通路相關(guān)mRNA轉(zhuǎn)錄水平 與模型組比較，對(duì)照組大鼠HIF、VEGF以及Notch1的mRNA表達(dá)水平均有顯著升高(P<0.05)；與模型組相比， 參附強(qiáng)心丸組大鼠HIF、VEGF以及Notch1的mRNA表達(dá)明顯升高(P<0.05)；參附強(qiáng)心丸組與卡托普利組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖4。

2.5HIF-VEGF-Notch信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平 與模型組比較，對(duì)照組大鼠HIF、VEGF及Notch1蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，參附強(qiáng)心丸組大鼠HIF、VEGF及Notch1蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05)；參附強(qiáng)心丸組與卡托普利組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖5。

圖2 各組大鼠HE及Masson染色Fig.2 HE and Masson staining of rats in each group

表2 各組大鼠α-SMA及Collagen Ⅰ染色結(jié)果

圖4 HIF、VEGF以及Notch1的mRNA表達(dá)水平Fig.4 mRNA expression levels HIF,VEGF and Notch1Note:Compared with Model,*.P<0.05,**.P<0.01.

圖5 HIF、VEGF以及Notch的蛋白表達(dá)水平Fig.5 Protein expression levels of HIF,VEGF and Notch1Note:Compared with Model,*.P<0.05,**.P<0.01.

3 討論

心腎綜合征是由于心臟或腎臟的急慢性功能不全而導(dǎo)致另一臟器功能不全的疾病[2]。近年來(lái)，中藥應(yīng)用于心腎綜合征疾病的研究受到眾多研究者的重視，其中復(fù)方制劑更是研究的重點(diǎn)[9,10]。參附強(qiáng)心丸是一種中藥復(fù)方制劑，由人參、豬苓、附子、桑白皮、大黃等作為主要成分研制而成，在強(qiáng)心利水、益陽(yáng)補(bǔ)氣方面具有較好療效。此外，參附強(qiáng)心丸在慢性心力衰竭等心臟疾病治療中應(yīng)用廣泛，可用于改善心臟功能，相關(guān)研究表明，參附強(qiáng)心丸可改善心腎綜合征大鼠心肌纖維化程度，且具有抗心衰作用，提示參附強(qiáng)心丸可以改善心腎綜合征的心臟功能[11，12]。在心腎綜合征疾病治療中參附強(qiáng)心丸對(duì)于腎臟功能的影響以及相關(guān)的通路研究報(bào)道較少，本研究通過(guò)構(gòu)建心腎綜合征大鼠模型探討參附強(qiáng)心丸對(duì)2型心腎綜合征的影響以及其相應(yīng)可能的機(jī)制進(jìn)行探索。

本研究結(jié)果顯示，參附強(qiáng)心丸組BUN、Scr水平顯著低于模型組，IS以及Ucr水平顯著高于模型組。組織纖維化作為心腎綜合征惡性循環(huán)的一個(gè)重要環(huán)節(jié)是研究重點(diǎn)。腎纖維化小鼠腎臟組織高表達(dá)α-SMA以及Ⅰ型膠原[13，14]。參附強(qiáng)心丸組大鼠腎臟組織結(jié)構(gòu)紊亂程度、α-SMA以及Ⅰ型膠原比例顯著低于模型組，以上結(jié)果均表明參附強(qiáng)心丸對(duì)于腎臟有明顯的保護(hù)作用，經(jīng)過(guò)治療后，腎臟功能有明顯恢復(fù)。

研究表明，Notch信號(hào)通路在阿霉素腎病腎小球硬化過(guò)程中被激活高表達(dá)，且在腎臟組織中HIF-VEGF-Notch信號(hào)通路相關(guān)因子表達(dá)升高，提示在心腎綜合征所引發(fā)的腎組織損傷中，該通路可能參與調(diào)節(jié)腎臟功能[15]。HIF-1α是參與細(xì)胞氧代謝調(diào)節(jié)的重要因子之一，可通過(guò)調(diào)節(jié)下游靶基因的表達(dá)從而實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞的糖轉(zhuǎn)運(yùn)、能量的代謝、血管與紅細(xì)胞的生成等的調(diào)控，并且減輕低氧微環(huán)境對(duì)于細(xì)胞造成的損傷[16]。相關(guān)研究證明，在急性腎損傷、單側(cè)腎切除、糖尿病等模型研究中，HIF活化并且高表達(dá)可延緩腎損傷[17]。VEGF作為HIF的下游靶基因，在HIF激活后，VEGF的表達(dá)也會(huì)有顯著升高[18]。研究表明，糖尿病誘發(fā)的腎臟損傷過(guò)程中腎臟組織的VEGF呈現(xiàn)出表達(dá)上升的現(xiàn)象[19,20]。在發(fā)育成熟的正常組織中Notch 受體和配體呈現(xiàn)出低水平表達(dá)，但是在組織受到損傷時(shí)，Notch 受體和配體的活性增強(qiáng)，表現(xiàn)為Notch 基因的表達(dá)水平增高[21]。本研究結(jié)果顯示，參附強(qiáng)心丸組大鼠在HIF、VEGF以及Notch的mRNA與蛋白的表達(dá)水平明顯高于模型組，提示參附強(qiáng)心丸對(duì)于2型心腎綜合征大鼠腎臟的保護(hù)作用可能是通過(guò)促進(jìn)HIF-VEGF-Notch信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，本研究通過(guò)建立心腎綜合征模型大鼠驗(yàn)證了參附強(qiáng)心丸可能通過(guò)促進(jìn)HIF-VEGF-Notch的表達(dá)，從而起到對(duì)心腎綜合征大鼠腎臟的保護(hù)作用。然而，由于心腎綜合征疾病發(fā)病過(guò)程以及藥物治療的作用機(jī)制復(fù)雜，且HIF-VEGF-Notch信號(hào)通路涉及因子眾多，因此對(duì)于這一治療過(guò)程的具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步探索。