外泌體miRNA作為癌癥早期診斷標(biāo)志物的研究進展①

余昌敏 張 丹 閔 明 王婷婷 張繼東

(遵義醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)教研室，遵義 563000)

癌癥是嚴(yán)重威脅人類生命的疾病之一，多種癌癥在早期沒有任何癥狀。大部分癌癥晚期患者的5年存活率較低，難以治愈，給患者家屬帶來極大的痛苦。此外，癌癥的高治療費用也給普通家庭帶來極大的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)。目前，臨床對癌癥的早期診斷存在困難，急需一種能夠用于早期癌癥診斷的生物標(biāo)志物，實現(xiàn)癌癥的早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療，減輕患者痛苦，降低治療費用，提高患者生存率及幸福指數(shù)。

1 外泌體簡介

外泌體是直徑約為30～100 nm的囊性小泡，可以從尿液、唾液、血液、羊水、母乳等體液中獲取[1,2]。研究發(fā)現(xiàn)，外泌體借助其內(nèi)容物(包括蛋白質(zhì)、核酸、脂類等生物活性分子)參與人體多種重要生理活動。在外泌體中發(fā)現(xiàn)了4萬余種蛋白質(zhì)、5 000 余種核酸及近千種脂類，其中蛋白質(zhì)包括參與外泌體跨膜轉(zhuǎn)運四跨膜蛋白超家族CD63、CD9等、融合的flotillin以及多囊泡胞內(nèi)體相關(guān)蛋白,核酸包括DNA、RNA、mRNA、miRNA、非編碼RNA(noncoding RNA，ncRNA)等[3-5]。

當(dāng)機體被疾病侵襲時，血液、組織液中的外泌體大量增多，其內(nèi)容物借助于囊泡的保護，從而避免被體液中的酶降解[6]。因此通過檢測體液中增加的、未被酶降解的外泌體的表達(dá)水平，可用于癌癥早期診斷。與直接可在血液中檢測到的蛋白質(zhì)、核酸相比，外泌體具有更高的敏感性、特異性及穩(wěn)定性，因此外泌體比傳統(tǒng)的血清學(xué)標(biāo)記物在癌癥早期診斷中更有意義[7]。近年關(guān)于外泌體作為診斷早期癌癥的潛在生物標(biāo)志物的研究備受關(guān)注，其中關(guān)于外泌體miRNA的研究較多。故本文將從外泌體的2個重要內(nèi)容物miRNA和蛋白質(zhì)作為癌癥早期診斷標(biāo)志物的研究進展進行綜述。

2 外泌體用于癌癥早期診斷的研究進展

2.1肺癌與外泌體 肺癌分為非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)和小細(xì)胞肺癌(small cell lung cancer，SCLC)，其中NSCLC占肺癌總數(shù)的80%以上，其死亡率居高不下，部分原因是晚期肺癌的生存率較低，若早期能及時發(fā)現(xiàn)，做到早診斷、早治療，可顯著降低其死亡率[8,9]。Jin等[10]報道稱NSCLC患者的血漿外泌體let-7b-5p、miR-24-3p和miR-486-5p水平比健康志愿者高，而外泌體let-7e-5p的水平顯著降低。為進一步評估外泌體miRNAs對NSCLC的早期診斷價值，該團隊聯(lián)合檢測60例未確診的NSCLC患者血漿中4種外泌體let-7b-5p、let-7e-5p、miR-23a-3p和miR-486-5p的差異表達(dá)，最終鑒別出43例NSCLC患者。因此，研究NSCLC的無創(chuàng)、高敏感性診斷方法可提高非小細(xì)胞肺癌的早期診斷和預(yù)后。但鮮有研究報道外周血中的外泌體miRNA可用于鑒別早期NSCLC中的腺癌(adenocarcinoma，AC)和鱗狀細(xì)胞癌(squamous cell carcinoma，SCC)。該研究發(fā)現(xiàn)AC患者的血漿外泌體miR-181-5p和miR-361-5p是SCC患者的10～20倍，SCC患者血漿中外泌體miR-320b的表達(dá)水平是AC患者的20倍以上，miR-10b-5p表達(dá)水平較健康志愿者顯著下降。聯(lián)合檢測外泌體miR-181b-5p、miR-361b-5p、miR-10b-5p和miR-320b水平，可進一步從43例NSCLC患者中鑒別出31例AC患者和11例SCC患者。miRNAs有望成為早期NSCLC診斷的高敏感性、高特異性的非侵入性生物標(biāo)志物。Kanaoka等[11]研究發(fā)現(xiàn)血漿外泌體miR-451a在早期NSCLC患者中的表達(dá)水平明顯高于健康志愿者，且外泌體miR-451a的表達(dá)與肺癌分期顯著相關(guān)。此外，在對NSCLC患者和健康志愿者的血清進行ELISA檢測時發(fā)現(xiàn)，a2-HS-糖蛋白(alpha-2-HS-glycoprotein，AHSG)、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白(extracellular matrix protein 1，ECM1)2種外泌體蛋白的表達(dá)在患者與健康志愿者間具有顯著差異。與健康志愿者相比，NSCLC患者(P<0.000 1)或早期NSCLC患者(P=0.003 9)血清中外泌體AHSG水平明顯升高，同時外泌體ECM1的表達(dá)升高，AUC為0.656(95%CI：0.528～0.785)，敏感性為75%，特異性為56.6%。研究發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合2個新的生物標(biāo)志物AHSG和ECM1檢測早期NSCLC時，AUC為0.739(95%CI：0.621～0.858)，敏感性為87.5%、特異性為54.3%，顯著提高了NSCLC診斷的敏感性[12]。綜上可知外泌體AHSG、ECM1對早期NSCLC診斷具有重要意義。臨床常用癌胚抗原CEA作為癌癥診斷的標(biāo)志物，將CEA 與ECM1、AHSG聯(lián)合用于早期NSCLC診斷，對提高診斷敏感性和特異性有重要價值。Poroyko等[13]在NSCLC患者的血清中發(fā)現(xiàn)7個外泌體miRNAs(hsa-miR-451a、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-363-3p、hsa-miR-660-5p、hsa-miR-15b-5p、hsa-miR-25-3p和hsa-miR-16-2-3p)的表達(dá)水平與健康志愿者具有顯著差異，且7個外泌體miRNAs的特異性均≥87.50%，敏感性均≥83.33%，AUC均≥0.88，說明血清外泌體有成為NSCLC早期診斷生物標(biāo)志物的潛力，但化療后的NSCLC患者血清樣本中無特異性的miRNA可用于鑒別治療前、后的NSCLC患者和健康志愿者。而肺癌患者血清中的3個miRNAs(hsa-miR-331-5p、hsa-miR-451a和hsa-miR-363-3p)依靠幾乎100%的敏感性和特異性鑒別出未經(jīng)過任何治療的SCLC患者和NSCLC患者。說明血清外泌體miRNAs不僅具有診斷早期肺癌的潛力，還具有鑒別NSCLC和SCLC的潛力。

2.2胰腺癌與外泌體 胰腺癌進展迅速，早期檢出率較低，預(yù)后差，生存率極低[14,15]。胰腺癌以血清生物標(biāo)志物和影像學(xué)診斷為主，早期診斷較難。腫瘤標(biāo)志物糖類抗原19-9(carbohydrate antigen 19-9，CA19-9)是FDA批準(zhǔn)的檢測胰腺導(dǎo)管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC)的生物分子，但在慢性胰腺炎(chronic pancreatitis，CP)患者中也有可能檢測到CA19-9高表達(dá)，因此CA19-9的特異性和敏感性不高[16]。外泌體作為一種新型生物標(biāo)志物，有望用于胰腺癌的早期診斷。最常見的胰腺癌是PDAC[17]。Nakamura等[18]發(fā)現(xiàn)早期PDAC患者的胰液樣本中外泌體miR-21和miR-155表達(dá)水平顯著高于CP患者，但直接存在于胰液樣本中的miR-21和miR-155的表達(dá)水平在PDAC和CP患者中無明顯差異。該團隊還發(fā)現(xiàn)用外泌體miR-21 和miR-155以及胰液細(xì)胞學(xué)(pancreatic juice cytology，PJC)鑒別PDAC患者和CP患者的精確度分別為83%、89%和74%，多種PJC檢測結(jié)果呈假陰性的PDAC患者通過檢測胰液外泌體miR-21和miR-155的表達(dá)水平確診，外泌體miR-21和miR-155分別與PJC聯(lián)合診斷早期PDAC，其敏感性均為93%，特異性均為88%，精確度均為91%。表明包括胰液外泌體miR-21、miR-155在內(nèi)的外泌體miRNAs可能是診斷早期PDAC的生物標(biāo)志物。在血漿中，PDAC患者的外泌體miR-196a水平明顯高于健康對照組，且miR-196a在PDAC患者的外泌體中高度富集[19]。有研究報道外泌體miR-10b、 miR-21、miR-30c、 miR-181a 在早期PDAC患者中高表達(dá)，miR-let7a低表達(dá)，單獨比較PDAC患者與健康對照組的miRNAs，ROC曲線顯示外泌體miR-10b、miR-21、miR-30c、miR-181a和miR-let7a的AUC值較高，提示miRNAs在PDAC早期診斷時具有高敏感性和高特異性。而行PDAC切除術(shù)后，升高的外泌體miR-10b、miR-21、miR-30c和miR-181a會降低到正常水平[16]。表明患者血漿外泌體miRNAs水平的變化對PDAC的早期診斷具有重要意義。Melo等[20]研究發(fā)現(xiàn)胰腺癌患者血清中外泌體糖原1 (glypican-1，GPC1)明顯高于健康對照組，雖然外泌體GPC1與胰腺癌分期無關(guān)，但其在鑒別胰腺癌與非胰腺癌時具有高敏感性和特異性，在胰腺癌的早期檢測中具有良好的應(yīng)用前景。

2.3結(jié)腸癌與外泌體 研究發(fā)現(xiàn)血清外泌體miR-622在早期結(jié)腸癌患者中高表達(dá)，但對晚期結(jié)腸癌患者的鑒別敏感性下降，而血清外泌體miR-139-3p的表達(dá)水平在結(jié)腸癌早、晚期診斷中均具有較高的敏感性和特異性，ROC分析顯示血清miR-139-3p的AUC為0.993 5，高于血液癌胚抗原CEA在結(jié)腸癌早期中的AUC 0.751 5[21]。在比較結(jié)腸癌患者和健康對照組血清外泌體的表達(dá)水平時，共鑒定出39種異常表達(dá)的外泌體miRNAs，其中外泌體miR-486-5p和miR-4180-5p表達(dá)顯著上調(diào)[22]。提示血清外泌體miRNAs對結(jié)腸癌早期的診斷具有重要價值。在研究50名早期結(jié)腸癌患者和50名健康志愿者的血漿外泌體miRNA時，發(fā)現(xiàn)患者血漿外泌體miR-125a-3p的表達(dá)水平明顯高于健康志愿者，ROC曲線顯示外泌體miR-125a-3p水平可用于早期結(jié)腸癌預(yù)測[23]。Krawczyk等[24]通過定量聚合酶鏈反應(yīng)測定56例結(jié)腸癌早期患者和70例健康志愿者血漿標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)血漿外泌體miR-506和miR-4316在早期結(jié)腸癌患者中表達(dá)水平顯著升高，且miR-506和miR-4316表達(dá)不依賴于結(jié)腸癌患者的性別、年齡、疾病分期和腫瘤定位。此外，有研究指出，與健康志愿者相比，結(jié)腸癌患者血漿中外泌體細(xì)胞角蛋白19(cytokeratin 19，CK19)、腫瘤相關(guān)糖蛋白72(tumor associate glycoprotein-72，TAG72) 、腫瘤標(biāo)志物糖類抗原125(carbohydrate antigen 125，CA125)的表達(dá)水平均升高，其中血漿外泌體蛋白CK19表達(dá)水平的升高對結(jié)腸癌早期的診斷具有指導(dǎo)意義[25]。

2.4乳腺癌與外泌體 乳腺癌嚴(yán)重危害廣大女性身心健康，且呈上升、年輕化趨勢。目前，乳腺癌診斷的金標(biāo)準(zhǔn)仍為病理診斷，因此探尋一種可靠的乳腺癌生物標(biāo)志物用于其早期診斷尤為重要。研究發(fā)現(xiàn)血漿外泌體miR-21、miR-1246和血清外泌體miR-101、miR-372的表達(dá)水平在乳腺癌患者中明顯升高，提示以上外泌體miRNAs可作為診斷早期乳腺癌的潛在生物標(biāo)志物[26,27]。蛋白質(zhì)磷酸化是多種細(xì)胞功能的主要調(diào)控機制，但由于存在活性磷酸酶，蛋白質(zhì)被降解，在體液中很難發(fā)現(xiàn)用于疾病診斷的磷酸化蛋白。而外泌體特殊的結(jié)構(gòu)可保護磷酸化蛋白質(zhì)不被體液中的磷酸酶降解，因此從體液外泌體中分離出的磷酸化蛋白質(zhì)有可能成為鑒別早期癌癥的潛在生物標(biāo)志物。Chen等[28]的報道中提到蛋白質(zhì)磷酸化可能是癌癥早期發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素，該團隊從乳腺癌患者的血漿外泌體中鑒定出100余種磷酸蛋白表達(dá)水平較健康志愿者顯著升高，提示血漿外泌體中的磷酸蛋白有可能成為診斷早期乳腺癌的生物標(biāo)志物。CD82是四跨膜蛋白超家族成員，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，與良性乳腺疾病患者及健康志愿者相比，乳腺癌患者血漿及血清外泌體中CD82表達(dá)明顯增高(P<0.05)，隨乳腺癌分期上升，血清外泌體CD82表達(dá)明顯升高[29]。Li等[30]通過比較32例健康志愿者和32例乳腺癌患者的血液樣本中循環(huán)外泌體miRNAs的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)乳腺癌患者血清中有4個外泌體miRNAs (miR-106a-5p、miR-19b-3p、miR-20b-5p和miR-92a-3p)水平顯著升高，同時發(fā)現(xiàn)3個血漿來源的外泌體miRNAs(miR-106a-3p、miR-106a-5p和miR-92a-2-5p)水平較健康志愿者升高[30]。提示以上7個循環(huán)外泌體miRNAs有望成為乳腺癌早期診斷的生物標(biāo)志物。乳腺癌患者的外泌體miR-106a-5p無論是在血漿還是在血清中的表達(dá)都高于健康志愿者， 提示外泌體miR-106a-5p有可能成為乳腺癌早期診斷的特異性生物標(biāo)志物 。 表1為根據(jù)文章內(nèi)容歸納整理的在癌癥患者和健康志愿者體液中表達(dá)具有顯著差異的外泌體。

表1 癌癥患者與健康體檢者體液中表達(dá)水平有差異的外泌體

3 小結(jié)與展望

綜上，外泌體有望成為癌癥早期診斷的新型生物標(biāo)志物。為加速外泌體對癌癥早期診斷的應(yīng)用，不僅需要提高外泌體提取技術(shù)的敏感性和特異性，還需在較大的癌癥患者群體樣本中進行外泌體研究，以及在不同腫瘤階段和腫瘤亞型的患者中量化miRNAs表達(dá)。在評價這些測量值時，還必須考慮到其隨時間和環(huán)境的變化，特別是包括預(yù)分析和分析因素在內(nèi)的方法必須標(biāo)準(zhǔn)化。如在樣品制備、miRNA提取和定量方面要盡量遵循控制變量原則。在處理數(shù)據(jù)時，如果各實驗室采用不同的內(nèi)源性miRNA量化其數(shù)據(jù)，則數(shù)據(jù)不具有可比性。