MRI活體示蹤PEG/PEI-SPIO標(biāo)記脂肪源性干細(xì)胞移植治療AD大鼠模型

杜 磊，雷正賢，湯間儀，馬偉瓊，譚智霖，廖炎輝，王雅杰，謝 琦*

(1.廣州市第一人民醫(yī)院 華南理工大學(xué)附屬第二醫(yī)院南沙醫(yī)院醫(yī)學(xué)影像科，廣東 廣州 510180；2.香港大學(xué)深圳醫(yī)院放射科，廣東 深圳 518000；3.廣州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院放射科，廣東 廣州 510800；4.惠州市中心人民醫(yī)院放射科，廣東 惠州 516001)

干細(xì)胞移植是治療阿爾茨海默病(Alzheimer disease, AD)的探索途徑，活體動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)干細(xì)胞移植后在AD宿主體內(nèi)的分布、遷移及分化等是分子影像學(xué)研究方向。本研究通過觀察聚乙二醇/聚乙烯亞胺修飾超順磁性氧化鐵(polyethylene glycol/polyethyleneimine modified superparamagnetic iron oxide, PEG/PEI-SPIO)標(biāo)記的脂肪源性干細(xì)胞(adipose derived stem cells, ADSC)移植后AD模型大鼠腦內(nèi)MR活體示蹤成像，探討MRI活體示蹤干細(xì)胞移植治療AD的可行性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及AD模型制作 SPF級(jí)SD雌性大鼠100只，體質(zhì)量(200±20)g，2月齡，購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[許可證號(hào)：SCX(粵)2013-0002]。隨機(jī)選擇80只，參照文獻(xiàn)[1-2]方法永久性結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈，術(shù)后飼以含250 ppm Cu2+去礦物質(zhì)水3個(gè)月，制成AD模型，最終存活并建模成功48只；對(duì)其余20只分離但不結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈，術(shù)后正常飼養(yǎng)，最終16只存活(假手術(shù)組)。

1.2 ADSC移植 參照文獻(xiàn)[3-5]方法獲取ADSC并傳至第3代進(jìn)行鑒定，將PEG/PEI-SPIO[6]加入第3代ADSC共孵育12 h，普魯士藍(lán)染色提示PEG/PEI-SPIO對(duì)SD大鼠ADSC細(xì)胞內(nèi)鐵標(biāo)記率達(dá)95%，細(xì)胞形態(tài)無明顯改變，可用于移植實(shí)驗(yàn)。

將48只模型大鼠隨機(jī)分標(biāo)記組、非標(biāo)記組和磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline, PBS)組，每組16只，分別于側(cè)腦室內(nèi)注入3 μl含105個(gè)PEG/PEI-SPIO標(biāo)記或未標(biāo)記ADSC懸液及PBS。對(duì)假手術(shù)組不予特殊處理。

1.3 相關(guān)指標(biāo)觀察

1.3.1 行為學(xué)測(cè)定 ADSC移植后第7、14、21、28天，分別于4組中隨機(jī)取4只大鼠行Morris水迷宮測(cè)試，并記錄逃避潛伏時(shí)間[7]，測(cè)定空間學(xué)習(xí)記憶能力。

1.3.2 MRI 完成上述測(cè)試后行頭部MR掃描。采用Siemens Vrio Tim 3.0T MR掃描儀，7 cm腕關(guān)節(jié)線圈，參照文獻(xiàn)[2]方法定位、麻醉，行軸位掃描。參數(shù)：TSE T1W，TR 600 ms，TE 12 ms，F(xiàn)OV 70 mm×60 mm，矩陣256×233，層厚3.0 mm；TSE T2W，TR 3 700 ms，TE 109 ms，F(xiàn)OV 70 mm×60 mm，矩陣256×256，層厚3.0 mm；GRE T2*W，TR 520 ms，TE 20 ms，F(xiàn)OV 70 mm×60 mm，矩陣256×206，層厚3.0 mm；T2 mapping，TR 1 100 ms，TE 1 16.0 ms、TE 2 32 ms、TE 3 48 ms、TE 4 64 ms，F(xiàn)OV 70 mm×70 mm，矩陣256×206，層厚3.0 mm；GRE SWI，TR 120 ms，TE 45 ms，F(xiàn)OV 80 mm×40 mm，矩陣256×243，層厚0.7 mm。于T2 mapping圖像海馬、顳頂葉皮質(zhì)、小腦區(qū)勾畫ROI，使雙側(cè)盡量相近并測(cè)量其T2值，取平均值為最終結(jié)果。

1.3.3 標(biāo)本處理與分析 完成MR掃描后各組取3只動(dòng)物，以心臟灌流致死后，將鼠腦置于4%多聚甲醛中固定24 h，自視交叉紋狀體到海馬及小腦層面切片、石蠟包埋；另取1只脫頸處死，取海馬、皮質(zhì)、小腦凍存。①檢測(cè)鐵含量：采用普魯士藍(lán)染色，參照測(cè)量T2值ROI層面取大鼠相應(yīng)部位切片4張，在高倍鏡下(×400)隨機(jī)于雙側(cè)海馬、顳頂葉皮質(zhì)、小腦各選取3個(gè)視野觀察藍(lán)染顆粒數(shù)量，以Image-Pro Plus 6.0軟件獲得灰度值作為鐵含量；②AD生物標(biāo)志物蛋白表達(dá)：采用免疫組織化學(xué)染色法，一抗為抗Tau抗體、抗β淀粉樣蛋白抗體，以Image-Pro Plus 6.0軟件分析灰度值；③神經(jīng)巢蛋白(neuroepithelial stem cell protein, Nestin)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)蛋白表達(dá)：采用Western blot法，一抗為抗Nestin抗體、抗BDNF抗體，以Alpha軟件分析目標(biāo)帶光密度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)分析軟件。計(jì)量資料均符合正態(tài)分布，以±s表示。多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。

P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 逃避潛伏時(shí)間 細(xì)胞移植后第7、14、21、28天，標(biāo)記組、非標(biāo)記組、PBS組逃避潛伏時(shí)間均較假手術(shù)組延長(P均<0.05)，標(biāo)記組與非標(biāo)記組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)；標(biāo)記組和非標(biāo)記組第28天逃避潛伏時(shí)間均較PBS組縮短(P均<0.05)。其他時(shí)間點(diǎn)標(biāo)記組、非標(biāo)記組、PBS組間逃避潛伏時(shí)間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，見表1。

表1 各組大鼠ADSCs移植后不同時(shí)間點(diǎn)逃避潛伏時(shí)間比較(±s，n=4)

表1 各組大鼠ADSCs移植后不同時(shí)間點(diǎn)逃避潛伏時(shí)間比較(±s，n=4)

組別逃避潛伏時(shí)間(s)移植后第7天移植后第14天移植后第21天移植后第28天標(biāo)記組29.08±2.76*24.89±2.27*25.26±0.94*19.48±0.86*#非標(biāo)記組29.66±1.45*25.32±3.77*25.30±3.66*19.06±1.71*#PBS組29.45±3.59*25.50±4.21*25.20±1.31*25.16±2.41*假手術(shù)組16.83±0.7816.17±0.6016.71±1.1116.29±1.45F值108.78435.26252.87167.816P值<0.001<0.001<0.001<0.001

注：*：與假手術(shù)組比較，P<0.05；#：與PBS組比較，P<0.05

2.2 T2值 各序列圖像4組大鼠各腦區(qū)均見散在斑點(diǎn)狀低信號(hào)(圖1～4)。標(biāo)記組海馬區(qū)T2值移植后第14、21、28天較第7天縮短，且較其余3組均縮短(P均<0.05)；顳頂葉皮質(zhì)區(qū)各時(shí)間點(diǎn)T2值較其余3組縮短(P均<0.05)，第21、28天T2值較第7、14天縮短(P均<0.05)；各組間、各時(shí)間點(diǎn)間小腦區(qū)T2值差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。移植后第7、14天，標(biāo)記組顳頂葉皮質(zhì)區(qū)T2值較海馬及小腦縮短(P均<0.05)，第21、28天海馬區(qū)T2值較顳頂葉皮質(zhì)及小腦縮短(P均<0.05)。各腦區(qū)各時(shí)間點(diǎn)非標(biāo)記組、PBS組、假手術(shù)組間T2值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。

圖1 假手術(shù)組大鼠顱腦MRI A～D及E～H分別為大腦和小腦T1WI、T2WI、T2*WI、SWI，均見散在斑點(diǎn)狀低信號(hào)(箭)

圖2 標(biāo)記組大鼠顱腦MRI A～D及E～H分別為大腦和小腦T1WI、T2WI、T2*WI、SWI，均見散在斑點(diǎn)狀低信號(hào)(箭)

圖3 非標(biāo)記組大鼠顱腦MRI A～D及E～H分別為大腦和小腦T1WI、T2WI、T2*WI、SWI，均見散在斑點(diǎn)狀低信號(hào)(箭)

圖4 PBS組大鼠顱腦MRI A～D及E～H分別為大腦和小腦T1WI、T2WI、T2*WI、SWI，均見散在斑點(diǎn)狀低信號(hào)(箭)

2.3 腦標(biāo)本檢測(cè)指標(biāo)

2.3.1 鐵含量 4組大鼠各腦區(qū)均見散在藍(lán)染顆粒。相同時(shí)間點(diǎn)標(biāo)記組各腦區(qū)鐵含量均較其余3組增高(P均<0.05)。標(biāo)記組移植后第14、21、28天海馬區(qū)鐵含量均較第7天增高，且第21、28天均較其余部位增高(P均<0.05)；皮質(zhì)區(qū)第7、14天鐵含量均較第21、28天增高，且均較其余部位增高(P均<0.05)；小腦區(qū)不同時(shí)間點(diǎn)鐵含量差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。各腦區(qū)各時(shí)間點(diǎn)非標(biāo)記組、PBS組、假手術(shù)組間鐵含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。

2.3.2 Aβ、Tau蛋白表達(dá) 4組大鼠各腦區(qū)均見散在棕色陽染細(xì)胞。標(biāo)記組、非標(biāo)記組、PBS組皮質(zhì)區(qū)移植后第7天、小腦區(qū)第21天Aβ蛋白表達(dá)，海馬區(qū)第21天及皮質(zhì)區(qū)第7、21、28天Tau蛋白表達(dá)，均較同時(shí)間點(diǎn)假手術(shù)組增加(P均<0.05)。組間各時(shí)間點(diǎn)海馬區(qū)Aβ蛋白表達(dá)、小腦區(qū)Tau蛋白表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。

2.3.3 Nestin、BDNF蛋白表達(dá) 海馬和皮質(zhì)區(qū)標(biāo)記組、非標(biāo)記組各時(shí)間點(diǎn)BDNF蛋白表達(dá)及第14、21天Nestin蛋白表達(dá)均較PBS組增加(P均<0.05)，其余組間BDNF、Nestin蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)；小腦區(qū)各時(shí)間點(diǎn)4組間Nestin、BDNF蛋白表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。

3 討論

3.1 干細(xì)胞及示蹤劑選擇 ADSC與間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSC)相似[8]，且具有易獲得、對(duì)機(jī)體損傷小、易于誘導(dǎo)分化等優(yōu)點(diǎn)，適用于自體細(xì)胞移植治療。為獲得良好示蹤效果，MRI活體示蹤技術(shù)所用磁性標(biāo)記物需不影響細(xì)胞活性且可被細(xì)胞良好吸收、內(nèi)化。SPIO常用于干細(xì)胞標(biāo)記[9-11]，但未經(jīng)修飾的SPIO顆粒和細(xì)胞膜表面均帶負(fù)電荷，不能有效標(biāo)記干細(xì)胞。張寶林等[6]以PEG為溶劑，以乙酰丙酮合鐵為鐵源，加入PEI對(duì)SPIO進(jìn)行修飾，使其表面帶正電荷，可有效標(biāo)記表面帶負(fù)電荷的ADSC，并已經(jīng)驗(yàn)證[3,5,12]。本研究Morris水迷宮結(jié)果顯示，各時(shí)間點(diǎn)標(biāo)記組與非標(biāo)記組逃避潛伏時(shí)間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示移植PEG/PEI-SPIO標(biāo)記ADSC未對(duì)AD模型鼠學(xué)習(xí)和記憶行為產(chǎn)生顯著影響，在活體上驗(yàn)證了其安全性。

3.2 鐵含量分析 MRI示蹤技術(shù)現(xiàn)已廣泛用于活體示蹤[13-14]。腦內(nèi)鐵含量增加與AD特征性神經(jīng)元纖維纏結(jié)和老年斑有關(guān)[15-16]。本研究中標(biāo)記組海馬和皮質(zhì)區(qū)T2值較其余3組縮短，提示將PEG/PEI-SPIO標(biāo)記ADSC在移植入AD模型大鼠腦內(nèi)后分布于海馬和皮質(zhì)，并可通過MR測(cè)量T2值對(duì)其示蹤。標(biāo)記組皮質(zhì)區(qū)移植第7天T2值較其余3組縮短，至第14天T2值最短，而海馬區(qū)自第14天始T2值較其余3組縮短，表明標(biāo)記后干細(xì)胞可能先分布到額顳葉皮質(zhì)區(qū)，而后向海馬區(qū)遷徙；相同時(shí)間點(diǎn)各組小腦T2值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示觀察時(shí)間點(diǎn)內(nèi)移植干細(xì)胞尚未大量遷移到小腦。既往研究[17-18]發(fā)現(xiàn)，在多種細(xì)胞信號(hào)影響下，移植入腦內(nèi)細(xì)胞可定向遷移至病變部位。普魯士藍(lán)染色是顯示組織內(nèi)鐵離子的敏感方法[19-20]，可與MRI結(jié)果相互驗(yàn)證但不能完全對(duì)應(yīng)。

3.3 病理學(xué)評(píng)價(jià) Aβ和Tau蛋白在AD發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，是診斷AD的生物標(biāo)志物[21]。本研究中移植后同組各腦區(qū)不同時(shí)間點(diǎn)Aβ和Tau表達(dá)均未減少，但第28天模型鼠行為學(xué)(逃避潛伏時(shí)間)表現(xiàn)卻有所改善，推測(cè)其原因可能為移植后ADSC在微環(huán)境影響下刺激腦組織，誘導(dǎo)、激活了腦組織內(nèi)源性修復(fù)過程。

Nestin是神經(jīng)干細(xì)胞的重要標(biāo)志物[22]。BDNF是與運(yùn)動(dòng)和感覺神經(jīng)元相關(guān)的重要神經(jīng)營養(yǎng)因子，參與神經(jīng)修復(fù)和保護(hù)[23]。本研究中移植后第14天海馬和皮質(zhì)區(qū)ADSC可能向神經(jīng)元方向分化，移植后ADSC于第7天起B(yǎng)DNF因子表達(dá)增高，推測(cè)其可能促進(jìn)神經(jīng)元修復(fù)。

綜上，PEG/PEI-SPIO可安全有效標(biāo)記ADSC，并能通過MRI活體示蹤其在SD大鼠AD模型腦內(nèi)的分布和遷徙。單次干細(xì)胞移植可有效改善AD模型鼠行為學(xué)表現(xiàn)，但本次觀察時(shí)間點(diǎn)內(nèi)未達(dá)到正常衰老鼠行為學(xué)水平，尚待進(jìn)一步研究。向活體AD模型大鼠腦內(nèi)移植后，ADSC可分化為表達(dá)Nestin、BDNF因子的神經(jīng)元樣細(xì)胞，但并不減少Aβ、Tau蛋白表達(dá)。