雞糞堆肥發(fā)酵過程微生物數(shù)量與溫度及酶變化的相關(guān)性研究

敖 靜, 李 楊, 劉曉輝, 高曉梅, 孫玉祿

(遼寧省微生物科學(xué)研究院,遼寧 朝陽 22000)

畜禽糞便堆肥發(fā)酵是一種較為常用的固體廢棄物資源化處理手段，自然堆肥存在周期長、氣味大、發(fā)酵不完全等問題，需要人工添加腐熟劑提高堆肥發(fā)酵效率。堆肥發(fā)酵的本質(zhì)實際上是微生物繁殖代謝有機物的過程[1]，在這個過程中，大量微生物和酶參與，將有機物分解利用轉(zhuǎn)化為無機態(tài)養(yǎng)分[2]。溫度也是堆肥過程中反應(yīng)堆肥進(jìn)程的重要參數(shù)，一般堆肥發(fā)酵都要經(jīng)過起火、高溫、降溫、二次升溫、降溫等階段，在不同階段，微生物種類和活躍程度也有所不同，發(fā)酵過程中各種酶的變化趨勢可以反映部分微生物的活躍趨勢以及發(fā)酵程度[3]。微生物對有機物的分解代謝能力取決于酶的活性，不同的微生物分泌的酶的種類不同，堆肥底物越豐富多樣，所需要的酶系統(tǒng)就越復(fù)雜[4]。因此，對堆肥過程中微生物數(shù)量和溫度及酶的變化進(jìn)行研究，有利于了解堆肥的生化過程，為進(jìn)一步了解堆肥發(fā)酵中微生物的作用，更好地控制堆肥發(fā)酵工藝，以及微生物菌劑的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗原料 雞糞由遼寧省朝陽市興和牧業(yè)有限公司提供；杏鮑菇菌糠由遼寧省微生物科學(xué)研究院提供。各營養(yǎng)成分含量見表1。

1.1.2 培養(yǎng)基(g/L) ①NA培養(yǎng)基：牛肉膏3.0，蛋白胨10.0，NaCl 5.0，瓊脂粉18，蒸餾水1 L，pH 7.0～7.2。②PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200，葡萄糖20，瓊脂粉18，蒸餾水1 L，pH自然。③高氏1號培養(yǎng)基：可溶性淀粉20，K2HPO40.5，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01，KNO31.0，MgSO40.5，NaCl 0.5，瓊脂粉18，蒸餾水1 L，pH 7.2～7.4。

1.2 方法

1.2.1 堆肥測溫及取樣 將杏鮑菇菌糠粉碎成渣，按15%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的比例添加到雞糞中，將物料堆置在通風(fēng)的溫室大棚內(nèi)，堆成高約1 m，直徑約1.5 m的圓垛，堆體無需覆蓋。每天分別在10：00和15：00進(jìn)行兩次測溫，將溫度計插入堆料中央處15～20 min，測定3次，取平均值作為堆料溫度。分別在發(fā)酵第3、6、9、12、15、18、21、24、27 和30天取樣。采取多點混合法，分別在堆體的上、中、下三個部位取樣，并充分混合，新鮮樣品直接測定或冰箱4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 堆肥過程中微生物數(shù)量測定 采用NA培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基和高氏1號培養(yǎng)基，分別對細(xì)菌、真菌和放線菌進(jìn)行培養(yǎng)[5]。采用平板計數(shù)法進(jìn)行菌數(shù)測定。

1.2.3 堆肥過程中酶測定 ①纖維素酶測量(硝基水楊酸比色法[6])：稱取0.50 g堆料樣品于150 mL 的錐形瓶中，加入1%羧甲基纖維素鈉溶液20 mL、磷酸鹽緩沖液5 mL(pH值5.3～5.6)、甲苯1.5 mL，37 ℃培養(yǎng)72 h，過濾，濾液定容至25 mL，取1 mL濾液在540 mm處測光密度(A)，設(shè)置空白對照組。以培養(yǎng)72 h的1 g堆肥樣生成的葡萄糖mg數(shù)表示纖維素酶活性(單位：mg/(g·d)。②脲酶測定(靛酚藍(lán)比色法[7])：稱取堆料樣品5.00 g于100 mL的容量瓶中，加入甲苯1 mL，靜置15 min，然后加入尿素10 mL(10%)、檸檬酸鹽溶液(pH 6.7)20 mL，緩慢搖晃至液體混合均勻，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，然后37 ℃蒸餾水稀釋定容，過濾，取2 mL濾液，加入10 mL蒸餾水，4 mL苯酚鈉，3 mL次氯酸鈉，充分震蕩，靜置20 min，稀釋至50 mL。1 h內(nèi)578 nm處測A值，設(shè)置空白對照組。尿酶活性以24 h后100 g土壤中NH3-N的mg數(shù)表示(單位：mg/(g·d))。③蔗糖酶測定(硝基水楊酸比色法[8])：稱取0.50 g堆料樣品于150 mL的錐形瓶中，加入15 mL蔗糖溶液(18%)、5 mL磷酸鹽緩沖液、5滴甲苯，緩慢搖晃至液體混合均勻，38 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，過濾，取1 mL濾液于比色管中，加入3 mL水楊酸，水浴鍋沸水加熱，待溶液呈現(xiàn)黃色停止加熱并冷卻，蒸餾水定容至50 mL，在580 nm處測定A值，設(shè)置空白對照組。以堆制24 h的1 g堆肥樣品所生成的葡萄糖mg數(shù)表示蔗糖酶活性(單位：mg/(g·d))。④過氧化氫酶測定(高錳酸鉀滴定法[9])：稱取0.50 g堆料樣品于150 mL的錐形瓶中，加入蒸餾水40 mL、H2O250 mL(3%)，密封處理后震蕩25 min，加入H2SO45 mL(1.5 mL/L)，過濾，取25 mL過濾液，0.02 mol/L KMnO4溶液滴定至微紅色，設(shè)置空白對照組。過氧化氫酶活性以單位堆肥樣品所消耗的0.02 mol/L KMnO4溶液的mL數(shù)表示(單位:mL/(g·25 min))。

1.2.4 分析方法 使用軟件IBM SPSS Statistics 21進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 堆肥過程中微生物數(shù)量與堆體溫度的相關(guān)性

在堆肥發(fā)酵過程中，細(xì)菌是數(shù)量最多的微生物，堆肥初期嗜溫細(xì)菌數(shù)量較多，在這個階段提供細(xì)菌生長繁殖的營養(yǎng)物質(zhì)主要是易分解的糖類[10]。隨著發(fā)酵的繼續(xù)，堆體溫度逐漸升高，細(xì)菌主要以嗜熱的芽胞桿菌屬為主，最低生長溫度為30～45 ℃，具有多樣性的生理特性[11]。隨著嗜熱細(xì)菌的活性降低，堆體溫度也逐漸下降，嗜溫細(xì)菌又重新發(fā)揮作用，繼續(xù)利用剩余的營養(yǎng)物質(zhì)，直到發(fā)酵過程結(jié)束。由圖1可以看出，堆肥發(fā)酵初期細(xì)菌數(shù)量為8.23×109cfu/g，隨著發(fā)酵的繼續(xù)，菌數(shù)逐漸增加， 6 d時菌數(shù)最高達(dá)16.8×109cfu/g。當(dāng)發(fā)酵到12 d后，菌數(shù)有所下降，18 d發(fā)酵二次升溫，菌數(shù)有所增加，隨后又逐漸減少。細(xì)菌數(shù)量變化規(guī)律為增加、減少、增加、減少、穩(wěn)定。

圖1 細(xì)菌數(shù)量與堆體溫度的變化曲線Fig.1 Change curve of the number of bacteria and the temperature in the composting material

真菌生長溫度為30～50 ℃，在發(fā)酵過程中對纖維素的分解起到一定作用[12-13]。由圖2可以看出，真菌菌數(shù)的變化與溫度關(guān)系密切，隨著溫度升高，菌數(shù)也隨之增加，發(fā)酵達(dá)到高溫階段嗜熱真菌起主要作用。當(dāng)發(fā)酵9 d時，真菌數(shù)量達(dá)到峰值14.3×104cfu/g，12 d后，菌數(shù)有所減少，當(dāng)發(fā)酵第二次升溫時，真菌菌數(shù)略有增加，之后開始下降直到發(fā)酵結(jié)束，可培養(yǎng)真菌菌數(shù)約為4.3×104cfu/g。

圖2 真菌數(shù)量與堆體溫度的變化曲線Fig.2 Change curve of the number of fungus and the temperature in the composting material

放線菌大多數(shù)為好氧菌，在堆肥發(fā)酵初期，與其競爭的其他微生物較少，所以發(fā)酵初期放線菌菌數(shù)較多[14]，由圖3 可以看出，6 d時菌數(shù)開始增加，9 d時達(dá)到峰值22.3×106cfu/g，之后隨著發(fā)酵的繼續(xù)，放線菌數(shù)開始下降。

圖3 放線菌數(shù)量與堆體溫度變化曲線Fig.3 Change curve of the number of actinomycetes and the temperature in the composting material

利用SPSS軟件，將細(xì)菌、真菌、放線菌數(shù)量分別與溫度進(jìn)行Pearson擬合，結(jié)果如表2、表3和表4所示，細(xì)菌、真菌數(shù)量與溫度的顯著性差異值分別是0.046和0.034，在置信水平為0.05的條件下，認(rèn)為細(xì)菌、真菌數(shù)量與溫度具有相關(guān)性，即95%的概率認(rèn)為細(xì)菌、真菌菌數(shù)與堆體溫度呈正相關(guān)；放線菌數(shù)量與溫度無顯著相關(guān)性。

2.2 堆肥過程中微生物數(shù)量與酶活的相關(guān)性

纖維素在自然界的存在十分廣泛，但由于其難破壞、難降解的特性，很難被直接利用。堆肥發(fā)酵過程中，大量的酶起著至關(guān)重要的作用，纖維素酶在分解纖維素時起到促進(jìn)作用，可以將纖維素分解成寡糖或單糖，有利于微生物的分解和利用。畜禽糞便中的纖維素既可以為微生物的生命活動提供能源，又可以為其提供碳源，在纖維素酶的水解作用下，纖維素被分解利用，所以可以通過纖維素酶的變化作為堆肥過程碳源利用的表征。在堆肥過程中，纖維素酶由大部分細(xì)菌和真菌產(chǎn)生[14]，研究纖維素酶與菌數(shù)的關(guān)系要看總的微生物數(shù)量，在試驗中，由于真菌和放線菌菌數(shù)相對于細(xì)菌菌數(shù)來說極少，可忽略不計，所有本研究中總菌數(shù)數(shù)據(jù)由細(xì)菌菌數(shù)代替。由圖4可以看出，纖維素酶變化趨勢與總菌數(shù)相近，發(fā)酵至6 d時，總菌數(shù)最多，此時的纖維素酶達(dá)到峰值16.8 mg/(g·d)，隨后開始下降，18 d時隨著菌數(shù)的增加，纖維素酶又呈上升趨勢，之后菌數(shù)降低，發(fā)酵結(jié)束，纖維素酶也降至8.3 mg/(g·d)。

表2 堆肥過程中細(xì)菌數(shù)量與溫度的相關(guān)性

表3 堆肥過程中真菌數(shù)量與溫度的相關(guān)性

表4 堆肥過程中放線菌數(shù)量與溫度的相關(guān)性

圖4 纖維素酶與總菌數(shù)變化曲線Fig.4 Change curve of the cellulase and the total number of bacteria

過氧化氫酶主要存在大多數(shù)細(xì)菌中，是一種末端氧化酶，催化過氧化氫分解成氧和水，在細(xì)胞體內(nèi)起到了關(guān)鍵的生物防護(hù)作用[16]。過氧化氫酶能促進(jìn)過氧化氫對各種化合物的氧化。堆肥的過氧化氫酶活性，與其呼吸強度和微生物活動相關(guān)，在一定程度上反映了堆肥微生物學(xué)過程的強度[17]。由圖5可以看出過氧化氫酶與細(xì)菌菌數(shù)變化趨勢相近，在發(fā)酵初期6 d時達(dá)到峰值，隨后隨著菌數(shù)的下降，過氧化氫酶也逐漸下降，18 d時細(xì)菌菌數(shù)增加，活躍度提高，過氧化氫酶也隨之略有增加，之后繼續(xù)呈下降趨勢。

脲酶是尿素氨基水解酶類的總稱，是一種由簡單蛋白質(zhì)構(gòu)成，具有氨化作用的水解酶。能夠催化尿素分解生成碳酸和兩分子氨，并釋放出NH3和CO2，具有高度專一性[18]。脲酶的活性與氮素代謝密切相關(guān)，脲酶活性反映了堆肥過程中含氮物質(zhì)的礦化過程，是堆肥腐熟度的評價指標(biāo)之一。在堆肥過程中，脲酶由有細(xì)菌、真菌和放線菌產(chǎn)生，研究表明，脲酶的活性與微生物量呈正相關(guān)，由圖6可以看出，脲酶在發(fā)酵初期較高，隨后逐漸下降，這可能是由于高溫期過后，微生物數(shù)量減少導(dǎo)致的。

圖5 過氧化氫酶與細(xì)菌數(shù)變化曲線Fig.5 Change curve of the catalase and the number of bacteria

圖6 脲酶與總菌數(shù)變化曲線Fig.6 Change curve of the urease and the total number of bacteria

雞糞的干物質(zhì)中粗蛋白占31%～33%，在雞糞發(fā)酵過程中，蛋白的分解關(guān)系到堆肥發(fā)酵的腐熟程度和發(fā)酵后的肥料品質(zhì)。蛋白酶是水解酶的一種，其主要由細(xì)菌產(chǎn)生，不僅可以反映蛋白的分解程度，還能體現(xiàn)細(xì)菌的活躍程度[19]。由圖7可以看出，發(fā)酵初期蛋白酶含量較高，隨著發(fā)酵的繼續(xù)前期略有增加為70.9 mg/(g·d)，隨著發(fā)酵的繼續(xù)，總體呈減少趨勢，這可能是蛋白質(zhì)被分解而減少造成的。

利用SPSS軟件進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析，由表5可以看出，纖維素酶與總菌數(shù)的顯著性差異值為0.02，在置信水平為0.05的條件下，認(rèn)為纖維素酶和總菌數(shù)具有相關(guān)性，即95%的概率認(rèn)為纖維素酶和總菌數(shù)呈正相關(guān)；由表6可以看出，過氧化氫酶與細(xì)菌菌數(shù)的顯著性差異值為0.00，在置信水平為0.01的條件下，認(rèn)為過氧化氫酶與細(xì)菌菌數(shù)具有相關(guān)性，即99%的概率認(rèn)為過氧化氫酶與細(xì)菌菌數(shù)呈正相關(guān)。由表7和表8的數(shù)據(jù)得出，脲酶和蛋白酶與菌數(shù)無顯著相關(guān)性

圖7 蛋白酶與細(xì)菌菌數(shù)變化曲線Fig.7 Change curve of the protease and the number of bacteria

表5 堆肥過程中纖維素酶與總菌數(shù)的相關(guān)性

表6 堆肥過程中過氧化氫酶與細(xì)菌菌數(shù)的相關(guān)性

表7 堆肥過程中脲酶與總菌數(shù)的相關(guān)性

表8 肥過程中蛋白酶與細(xì)菌菌數(shù)的相關(guān)性

3 討 論

本研究在雞糞發(fā)酵的不同階段測定了微生物菌數(shù)和堆體溫度及酶活的變化情況，通過曲線直觀地看出細(xì)菌和真菌的菌數(shù)的變化趨勢與堆體溫度變化趨勢相近，利用SPSS軟件進(jìn)行Pearson 相關(guān)性分析得出，細(xì)菌、真菌數(shù)量與堆體溫度的顯著性差異值分別是0.046和0.034，在置信水平為0.05的條件下，認(rèn)為細(xì)菌、真菌數(shù)量與溫度具有相關(guān)性，即95%的概率認(rèn)為細(xì)菌、真菌菌數(shù)與堆體溫度呈正相關(guān)；而通過軟件數(shù)據(jù)分析可以得出，放線菌菌數(shù)與堆體溫度無顯著相關(guān)性，這可能是由于放線菌大多數(shù)為好氧菌，在發(fā)酵初期氧氣充足，菌數(shù)比較高，但由于發(fā)酵進(jìn)程的繼續(xù)，堆體的濃縮效應(yīng)導(dǎo)致堆體內(nèi)部氧氣減少，從而影響了放線菌的數(shù)量。

通過測定纖維素酶、過氧化氫酶、脲酶和蛋白酶，比較多種酶類與微生物菌數(shù)的關(guān)系，由曲線圖可以看出，纖維素酶和過氧化氫酶的變化趨勢與菌數(shù)的變化趨勢相近，通過SPSS分析可知，纖維素酶和總菌數(shù)具有相關(guān)性，95%的概率認(rèn)為纖維素酶和總菌數(shù)呈正相關(guān)，99%的概率認(rèn)為過氧化氫酶與細(xì)菌菌數(shù)呈正相關(guān)；脲酶和蛋白酶與菌數(shù)無顯著相關(guān)性，二者都參與發(fā)酵過程中氮的循還，這兩種酶也與微生物的數(shù)量和活躍度有關(guān)，出現(xiàn)無相關(guān)性的數(shù)據(jù)可能是由于底物在酶促反應(yīng)中減少，導(dǎo)致這兩種酶總體呈下降趨勢。

通過本研究可以了解微生物數(shù)量和酶活在堆肥發(fā)酵過程中的相關(guān)性，可為畜禽糞便堆肥發(fā)酵，有針對性的添加菌劑，為更準(zhǔn)確高效的利用有機廢棄物提供參考。