灘涂濕地中全程硝化菌隨季節(jié)和深度變化的分布特性

戴 紅， 蔣秋悅， 全哲學(xué)

(復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，上海 200438)

硝化作用作為連接固氮和反硝化作用的中間過程，是生態(tài)系統(tǒng)氮循環(huán)過程的重要環(huán)節(jié)[1]。傳統(tǒng)的硝化作用分為2個(gè)過程[2]，包括將氨氧化為亞硝酸鹽的過程(由氨氧化菌來完成)和將亞硝酸鹽氧化為硝酸鹽的過程(由亞硝酸氧化菌來完成)。Costa等[4]提出了全程硝化菌(complete ammonia oxidizer, comammox)存在的可能性，即1個(gè)微生物可通過氨氧化和亞硝酸氧化單獨(dú)完成原來由氨氧化菌和亞硝酸氧化細(xì)菌協(xié)同完成的過程，以獲得更多的能量。全程硝化菌的發(fā)現(xiàn)[3]打破了之前硝化作用需要由兩種不同的微生物來完成的理論，填補(bǔ)了生物地球化學(xué)氮循環(huán)中的關(guān)鍵過程，引起了社會(huì)的廣泛關(guān)注。因此，研究全程硝化菌在生態(tài)系統(tǒng)中的多樣性和貢獻(xiàn)，是氮循環(huán)機(jī)制研究和硝化微生物研究的重要基礎(chǔ)。目前，已經(jīng)獲得純培養(yǎng)的全程硝化菌是在深層石油井地下水管內(nèi)的生物膜上[4]發(fā)現(xiàn)的Nitrospirainopinata。在水產(chǎn)養(yǎng)殖系統(tǒng)的滴濾池[5]樣品的厭氧除氮反應(yīng)器中，也獲得了2種全程硝化菌的富集培養(yǎng)物候選種Nitrospiranitrificans和候選種Nitrospiranitrosa，這些已報(bào)道的全程硝化菌在氨氧化過程的核心功能酶氨氧化單加氧酶基因amoA的系統(tǒng)發(fā)育樹中形成一個(gè)簇(clade A)[4-5]；在采自地下水樣品的宏基因組中[5]，檢測(cè)到了形成另一個(gè)簇(clade B)的全程硝化菌。此外，在飲用水系統(tǒng)[6]、地下水快速砂濾器[7]和農(nóng)業(yè)土壤[8]的宏基因組分析中也檢測(cè)到了全程硝化菌。這些研究表明，全程硝化菌在人造環(huán)境和自然生態(tài)系統(tǒng)中廣泛分布。目前，檢測(cè)不同環(huán)境樣品中全程硝化菌的方法有多種，包括利用宏基因組學(xué)方法研究全程硝化菌與其他氨氧化菌的分布比例[9]，根據(jù)全程硝化菌的amoA序列設(shè)計(jì)新的特異性引物檢測(cè)全程硝化菌[10]，以及利用高簡(jiǎn)并引物兩步PCR擴(kuò)增方法[11]和部分巢式PCR擴(kuò)增方法[12]分析環(huán)境樣品中的全程硝化菌的群體結(jié)構(gòu)和多樣性。這些方法的建立為研究環(huán)境樣品中全程硝化菌的多樣性和分布奠定了重要基礎(chǔ)。灘涂濕地作為連接陸地和海洋的生態(tài)系統(tǒng)，在全球物質(zhì)循環(huán)中起著重要的作用[13]。每年大量營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)通過長(zhǎng)江涌入灘涂河口地區(qū)，其中除了硝酸鹽還包括相當(dāng)多的銨和有機(jī)氮等，這些營(yíng)養(yǎng)物通常被認(rèn)為是氮轉(zhuǎn)化，尤其是硝化作用主要基質(zhì)[14-16]。除了遠(yuǎn)海環(huán)境外，全程硝化菌在各種生態(tài)環(huán)境中都被檢測(cè)到，在灘涂生態(tài)系統(tǒng)中的分布在前期研究中已有報(bào)道[12]。之前利用設(shè)計(jì)的高簡(jiǎn)并引物兩步PCR擴(kuò)增的方法，分析了4個(gè)季節(jié)中長(zhǎng)江口不同深度的灘涂沉積物內(nèi)全程硝化菌和氨氧化細(xì)菌的分布特點(diǎn)[17]，結(jié)果表明，與氨氧化細(xì)菌相比，春季表層(0～1 cm)和淺表層沉積物(1～5 cm)以及秋季深層沉積物(5～10 cm)中的全程硝化菌的比例相對(duì)較高。但此分析的缺陷在于，設(shè)計(jì)的引物不能覆蓋全程硝化菌的clade B類型，且高簡(jiǎn)并引物對(duì)clade A.2不能完全覆蓋[12]。本次研究結(jié)合可覆蓋環(huán)境中全程硝化菌的所有類型的部分巢式PCR擴(kuò)增方法和高通量測(cè)序方法，分析了長(zhǎng)江河口灘涂沉積物在不同季節(jié)和不同深度的全程硝化菌的群落結(jié)構(gòu)，研究了全程硝化菌的生態(tài)分布特點(diǎn)與環(huán)境因子的關(guān)系，這對(duì)認(rèn)識(shí)灘涂生態(tài)系統(tǒng)氮循環(huán)過程中全程硝化菌的貢獻(xiàn)具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 分別于2014年的1月、4月、8月和10月在長(zhǎng)江河口的崇明東灘灘涂地區(qū)采集樣品，以冬(W)、春(Sp)、夏(Su)、秋(A)代表不同月份。在相距50 m的區(qū)域內(nèi)分別設(shè)立了3個(gè)重復(fù)樣點(diǎn)(A、B和C)，按照5點(diǎn)采樣法，對(duì)每個(gè)樣點(diǎn)的3個(gè)不同深度采樣：表層(0～1 cm)、淺表層(1～5 cm)和深層(5～10 cm)，以數(shù)字0、1和5分別命名。樣品混勻，冰盒保存，用于理化性質(zhì)測(cè)定和DNA的提取。

1.1.2 主要試劑 Axygen膠回收試劑盒(天根生化科技北京有限公司)，PowerSoil DNA提取試劑盒(Mo Bio Laboratories，USA)，Ex Taq premix酶(TaKaPa，Japan)，牛血清蛋白(BSA)。

1.1.3 儀器與設(shè)備 多用途水平電泳儀(BG-subMIDI，南北儀器有限公司)，PCR儀(MG96+，上海賽默生物科技發(fā)展有限公司)，便攜式pH計(jì)(Bante211，上海班特儀器有限公司)，超凈工作臺(tái)(VD-850，蘇州江東精密儀器有限公司)，0.22 μm濾膜(生工生物工程(上海)股份有限公司)，高速離心機(jī)(Pico17，上海凌儀生物科技有限公司)，微量移液槍(EF100，賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司)，渦旋振蕩器(Vortex-genie2，USA)，離子色譜儀(ICS-1000，Dionex，Sunnyvale，CA)，碳氮分析儀(Flash EA 1112Series，Thermo，Italy)。

1.2 方法

1.2.1 理化性質(zhì)檢測(cè) 樣品的理化性質(zhì)數(shù)據(jù)參考文獻(xiàn)[17]。具體方法如下：樣品50 ℃烘干過夜，加入2 mol/L KCl溶液30 ℃震蕩孵育1 h[18]，取上清0.22 μm濾膜過濾，濾液用于硝酸根離子檢測(cè)，比色法檢測(cè)銨濃度[19]，使用Bante211便攜式pH計(jì)測(cè)量上清液的pH值。烘干的樣品經(jīng)研磨過100目篩，取40 mg使用碳氮分析儀檢測(cè)總碳(TC)和總氮(TN)含量。

1.2.2 DNA提取 樣品的DNA提取按PowerSoil DNA提取試劑盒說明書進(jìn)行，1%的凝膠電泳檢測(cè)，-20 ℃冰箱保存。

1.2.3 部分巢式PCR擴(kuò)增 利用部分巢式PCR[12]對(duì)全程硝化菌的amoA基因進(jìn)行擴(kuò)增。第一輪PCR使用的引物為A189Y和為區(qū)分不同樣品在5′端包含8個(gè)堿基barcode 的C576r[12]，擴(kuò)增體系為50 μL，反應(yīng)體系：無菌水20 μL，上下游引物(10 μmol/L)各1 μL，Ex Taq premix 25 μL，牛血清蛋白(20 mg/mL)2 μL，DNA模板1 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，52 ℃退火50 s，72 ℃延伸50 s，20個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。第二輪PCR使用的引物為CA209和為區(qū)分不同樣品在5′端包含8個(gè)堿基barcode 的C576r[12]，擴(kuò)增體系為50 μL，利用的DNA模板是第一輪的PCR產(chǎn)物，反應(yīng)體系：無菌水15 μL，上下游引物(10 μmol/L)各2 μL，Ex Taq premix 25 μL，BSA(20 mg/mL)2 μL，DNA模板4 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，50 ℃退火50 s，72 ℃延伸50 s，20個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

1.2.4 高通量測(cè)序 第二輪PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)，對(duì)目的長(zhǎng)度片段(約400 bp)割膠回收，用Qubit 2.0熒光計(jì)濃度檢測(cè)，均量混合不同樣品，構(gòu)建文庫(kù)，在Illumia Miseq系統(tǒng)上進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理與分析 下機(jī)后的數(shù)據(jù)參照Xia等[12]的方法，使用QIIME軟件[20]進(jìn)行分析。處理過程如下：切除序列中的barcode序列，對(duì)測(cè)序序列進(jìn)行質(zhì)控和兩端拼接，根據(jù)切下的8個(gè)堿基的barcode序列對(duì)樣品進(jìn)行區(qū)分，隨后進(jìn)行嵌合體的識(shí)別和去除。嵌合體識(shí)別參考修改后的銅結(jié)合單加氧酶家族(CuMMO)相關(guān)的數(shù)據(jù)庫(kù)[11]，以此數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)作為參考序列，對(duì)大于250 bp長(zhǎng)度核苷酸序列以90%的相似度進(jìn)行可分類操作單元(OTU)的分類，并用于不同環(huán)境樣品中不同全程硝化菌的比例分析。去除總序列數(shù)小于4條的OTU，選擇剩余的每個(gè)OTU的代表序列，利用FunGene數(shù)據(jù)庫(kù)(http://Fungene.cme.msu.edu)中的FrameBot工具對(duì)其進(jìn)行氨基酸翻譯，通過MEGA 5.0軟件[21]利用Neighbor-Joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，參考序列選擇Jiang等[17]文章中的序列，根據(jù)參考序列的分類信息，確定OTU的分類信息。根據(jù)理化性質(zhì)，在CANOCO 5.0中進(jìn)行冗余分析(RDA)，以確定環(huán)境參數(shù)與全程硝化菌類型之間的相互關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 全程硝化菌的amoA基因的OTU分類

基于高通量數(shù)據(jù)分析的結(jié)果，共獲得79 532個(gè)全程硝化菌的amoA基因序列，將獲得的amoA基因序列以90%的閾值劃分OTU，選擇占比大于1%的18個(gè)主要OTU，取其代表序列與已知的參考序列，使用Neighbor-Joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[17]。如圖1所示，環(huán)境樣品中的全程硝化菌在系統(tǒng)發(fā)育樹上可以明顯分為clade A.1、clade A.2和clade B。clade A.1單獨(dú)形成一簇，其bootstrap值為92%；clade A.2單獨(dú)形成一簇，其bootstrap值為66%；clade A.1和clade A.2聚類為clade A，其bootstrap值為99%，表明clade A.1和clade A.2相對(duì)于clade B，其親緣關(guān)系更為接近；clade B單獨(dú)聚類，bootstrap值為99%。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果，clade A.1主要以O(shè)TU1和OTU3為主，OTU1與之前報(bào)道的Candidatusnitrospiranitrosa相接近，OTU3則與scaffold HN-bin3[22]接近，clade A.1的其他幾個(gè)OTU代表序列則與Candidatusnitrospiranitrificans接近。全程硝化菌clade A.2主要以O(shè)TU2、OTU4和OTU5為主，在系統(tǒng)發(fā)育樹上都與scaffold HN-bin1[22]接近,全程硝化菌cladeB類型在系統(tǒng)發(fā)育樹上只有1個(gè)OUT17(1.10%)，占比較低。

圖1 全程硝化菌amoA基因的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic analysis of the comammox amoA geneOTU后括號(hào)中的百分比值表示每個(gè)OTU在所有樣品的全程硝化菌amoA基因序列中所占比例。系統(tǒng)發(fā)育樹中僅顯示占比大于1%的18個(gè)主要OTU的代表序列,節(jié)點(diǎn)附近只顯示> 50%的bootstrap值Percents in brackets of the operational taxono mic units (OTUs) indicate the proportion of each OTU in the representative comammox amoA gene sequences. Only 18 OTUs with a ratio greater than 1% of the total comammox amoA gene sequences are shown in the phylogenetic tree. Only>50% bootstrap values are displayed near the nodes

不同樣品中OTU的分布比例如圖2所示，選擇占比大于1%的主要OTU進(jìn)行分析，結(jié)果表明，在不同季節(jié)及深度的沉積物樣品中, clade A的比例明顯高于clade B。其中clade A.1和clade A.2的分布比例隨季節(jié)及深度的變化而變化，OTU1作為clade A.1主要的OTU，除夏季表層(Su0，0～1 cm)樣品以外，在其余季節(jié)和不同深度樣品中均占主導(dǎo)。屬于clade A.1的OTU7則在冬季淺表層(W1，1～5 cm)、春季深層(Sp5，5～10 cm)和夏季表層(Su0，0～1 cm)沉積物中有所分布。OTU7在夏季表層(Su0，0～1 cm)沉積物中分布最多，占該沉積物樣品中所有amoA序列的31.97%。整體而言，clade A.1在夏季各沉積物樣品中比例最高。

OTU2和OTU4作為clade A.2主要的OTU，OTU2在夏季淺表層(Su1, 1～5 cm)沉積物中的比例明顯高于其他沉積物樣品，而在夏季表層(Su0，0～1 cm)沉積物中比例相對(duì)偏低，OTU4則與其相反。整體而言，clade A.2在夏季沉積物樣品中比例偏低，但在冬季淺表層沉積物(W1，1～5 cm)樣品中比例最低，秋季深層沉積物(A5，5～10 cm)樣品中比例次之。

不同季節(jié)及深度的沉積物樣品中，全程硝化菌clade B比例很低，只有OTU17是clade B的主要OTU，OTU17在冬季各沉積物樣品中比例最高，并隨著“冬-秋-春-夏”季節(jié)變化其所占比例逐漸降低，冬季淺層(W0，0～1 cm)沉積物中OTU17的比例略高于淺表層和深層沉積物。

2.2 灘涂沉積物中全程硝化菌的分布

基于不同季節(jié)和不同深度的沉積物樣品中獲得的所有amoA基因序列形成柱狀圖，全程硝化菌不同類型的分布如圖3所示，全程硝化菌clade A.1在冬季淺表層沉積物(W1，1～5 cm)中分布最多，占比61.94%；在春秋兩季深層沉積物(5～10 cm)和夏季所有沉積物樣品中比例均高于clade A.2和clade B；在淺表層沉積物(1～5 cm)中，冬夏兩季clade A.1比例較高；在深層沉積物(5～10 cm)樣品中，春秋兩季clade A.1比例偏高，clade A.2則與其相反。

全程硝化菌clade B存在于秋冬兩季沉積物中，在兩季的不同深度沉積物中，clade B的比例有所差異。clade B在秋季淺表層和冬季淺層沉積物中比例偏高。

2.3 灘涂沉積物中全程硝化菌與環(huán)境因子的相關(guān)性研究

從測(cè)序結(jié)果中抽取全程硝化菌的序列，通過RDA分析研究全程硝化菌與各種環(huán)境因素的相關(guān)性。如圖4所示，夏季沉積物樣品都聚類在RDA圖右上方，其余三季表層沉積物(0～1 cm)樣品分布在RDA圖下方，淺表層沉積物(1～5 cm)樣品聚類在RDA圖右下方，深層沉積物(5～10 cm)樣品整體上分布在RDA圖左上方，表明除夏季以外，全程硝化菌在其余季節(jié)不同深度的沉積物中的群落組成較為接近。RDA圖顯示了銨濃度、硝酸鹽濃度、pH、總碳含量(TC)和總氮含量(TN)與不同季節(jié)和沉積物及其深度的全程硝化菌的群落結(jié)構(gòu)相關(guān)性。夏季所有沉積物樣品中全程硝化菌與總碳含量(TC)呈負(fù)相關(guān)，除夏季沉積物樣品外，銨濃度與其余三季淺表層沉積物(1～5 cm)樣品中全程硝化菌的群落呈負(fù)相關(guān)，硝酸鹽濃度和pH與其余三季表層沉積物(0～1 cm)樣品中全程硝化菌的群落呈負(fù)相關(guān)，而總氮含量(TN)則與其余三季深層沉積物(5～10 cm)全程硝化菌群落呈負(fù)相關(guān)。

圖2 全程硝化菌amoA基因的代表性O(shè)TU在四個(gè)季節(jié)不同深度的沉積物中的分布Fig.2 Distribution of the representative operational taxonomic units (OTUs) of the comammox amoA gene in sediments of different depths in four seasons W、 Sp、 Su和 A分別代表冬、春、夏、秋四個(gè)季節(jié)；0、1和5分別代表沉積物的不同深度(分別為0～1、1～5和5～10 cm)；該圖僅顯示占比大于1%的全程硝化菌amoA基因序列的代表性O(shè)TUW，Sp，Su and A represent the four seasons of winter, spring, summer and autumn, respectively；0, 1 and 5 represent the different depths of the sediments (0-1, 1-5 and 5-10 cm respectively)； This figure only shows representative OTUs of the comammox amoA gene sequence with a ratio greater than 1%

圖3 四個(gè)季節(jié)不同深度的沉積物全程硝化菌的分布Fig.3 Distribution of the comammox in sediments at different depths in four seasons樣品名稱縮寫參考圖2，負(fù)誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3)Refer to figure 2 for abbreviations of samples，negative error bars indicate the standard deviation (n=3)

圖4 不同季節(jié)和深度的沉積物樣品中全程硝化菌比例的RDA分析Fig.4 RDA analysis of the proportion of comammox in sediments from different seasons and depths樣品名稱縮寫參考圖2Refer to figure 2 for abbreviations of sample names

3 討 論

全程硝化菌在不同的環(huán)境中廣泛分布。在灘涂生態(tài)系統(tǒng)中，全程硝化菌不同類型的分布特點(diǎn)有利于進(jìn)一步認(rèn)識(shí)灘涂沉積物的氮循環(huán)過程。通過部分巢式PCR擴(kuò)增的方法，檢測(cè)到長(zhǎng)江河口崇明東灘灘涂濕地沉積物中存在的不同類型的全程硝化菌，根據(jù)高通量測(cè)序結(jié)果以及系統(tǒng)發(fā)育樹分析，發(fā)現(xiàn)不同類型的全程硝化菌的分布隨不同季節(jié)及沉積物不同深度的變化而變化。

Jiang等[17]的研究表明，用高簡(jiǎn)并引物兩步PCR方法可以擴(kuò)增環(huán)境樣品中的全程硝化菌amoA序列，但其局限在于設(shè)計(jì)的引物不能覆蓋全程硝化菌clade B類型。本研究利用部分巢式PCR擴(kuò)增方法[12]，可以同時(shí)覆蓋全程硝化菌的clade A和clade B兩個(gè)分枝，有利于全面分析全程硝化菌在灘涂濕地的分布。在不同的環(huán)境中，全程硝化菌 clade A.1和clade A.2的比例不同。有研究報(bào)道全程硝化菌 clade A.1在潮灘沉積物、活性污泥、厭氧污泥和沿海水樣中占主導(dǎo)地位，而clade A.2在煤礦土壤和自來水樣本中占主導(dǎo)地位[12]，clade B則在水稻田土壤及森林土壤中占比更高[23]。根據(jù)部分巢式PCR數(shù)據(jù)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)灘涂沉積物中全程硝化菌clade A占主導(dǎo)地位，clade B只占小部分比例，這個(gè)結(jié)果也進(jìn)一步說明，在灘涂生態(tài)系統(tǒng)中，全程硝化菌clade A可能是主要的貢獻(xiàn)者。

不同季節(jié)對(duì)全程硝化菌群落組成存在較大影響。在夏季樣品中，全程硝化菌clade A.1比例高于clade A.2，而clade B則出現(xiàn)在秋冬兩季沉積物樣品中。推測(cè)不同季節(jié)的溫度可能是影響不同類型全程硝化菌分布的原因之一，而clade B相比于clade A可能更適合于低溫環(huán)境，clade A.1相比于clade A.2更適合于較高溫度。除季節(jié)外，沉積物深度也影響灘涂生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)氨氧化微生物的群落結(jié)構(gòu)[24]，冬夏兩季沉積物樣品中，在淺表層沉積物(1～5 cm)樣品中clade A.1比例明顯高于clade A.2，但在深層沉積物(5～10 cm)樣品中，clade A.2比例則明顯高于clade A.1。隨著沉積物深度增加溶氧會(huì)急劇下降[25-26]，因此，相比于clade A.1, clade A.2可能更適合于低氧環(huán)境。

RDA數(shù)據(jù)顯示了全程硝化菌群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境因子的相關(guān)性。沉積物中氨的分布特性對(duì)全程硝化菌的群落結(jié)構(gòu)多樣性具有重要作用[27-28]?？偟?TN)、pH和硝酸鹽對(duì)全程硝化菌的生長(zhǎng)也存在一定的相關(guān)性。相比于clade A.1, clade A.2與銨濃度呈負(fù)相關(guān)，表明clade A.2更傾向于在低銨濃度條件下生長(zhǎng)；全程硝化菌clade B則與TC呈正相關(guān)，與硝酸鹽濃度呈負(fù)相關(guān)；pH對(duì)陸地環(huán)境中氨氧化菌分布及其生長(zhǎng)活性具有重要影響[29-31]，本研究發(fā)現(xiàn)，全程硝化菌clade B與pH呈負(fù)相關(guān)，夏季灘涂沉積物中pH值較高，因此，除了溫度，高pH值也可能是導(dǎo)致全程硝化菌clade B的比例降低的原因。

本研究通過部分巢式PCR擴(kuò)增的方法研究灘涂樣品中全程硝化菌的群落結(jié)構(gòu)及其生態(tài)分布，了解季節(jié)和沉積物深度對(duì)不同類型全程硝化菌的影響，由于研究中樣品數(shù)量有限且未檢測(cè)微生物硝化活性，所以對(duì)于了解灘涂生態(tài)系統(tǒng)中影響全程硝化菌分布的因素，還存在一定的局限。為了解全程硝化菌在環(huán)境中的分布以及對(duì)其在不同灘涂生態(tài)系統(tǒng)中多樣性的分析，還需要通過更廣泛的灘涂樣品，找出不同類型全程硝化菌的分布規(guī)律并進(jìn)一步研究不同類型的全程硝化菌在灘涂系統(tǒng)中的貢獻(xiàn)度。