鼻咽癌組織miR-10b與患者臨床病理參數(shù)及HoxD4 mRNA表達(dá)的關(guān)系

劉春麗，郭霞，張潔，梁媛，張圣林承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，河北承德067000

鼻咽癌是一種發(fā)生在鼻咽上皮細(xì)胞中的惡性腫瘤，其年齡標(biāo)準(zhǔn)化發(fā)病率低于1/100 000，但在我國(guó)廣東地區(qū)發(fā)病率較高[1,2]。miRNA是一類(lèi)數(shù)量繁多、功能復(fù)雜的調(diào)控因子，廣泛參與多種生命進(jìn)程的調(diào)控。miR-10b為miRNA家族成員之一，在許多惡性腫瘤細(xì)胞中均存在異常表達(dá)，包括鼻咽癌細(xì)胞系[3]，但其在鼻咽癌組織中的表達(dá)變化鮮有報(bào)道。研究顯示，miR-10b可通過(guò)靶向轉(zhuǎn)錄因子HoxD10促進(jìn)大腸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[4,5]，但二者在鼻咽癌組織中的表達(dá)是否相關(guān)鮮見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究觀察了鼻咽癌組織中miR-10b的表達(dá)變化，并分析其與患者臨床病理參數(shù)及其相鄰基因HoxD4 mRNA表達(dá)的關(guān)系?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2017年1月～2018年6月承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科收治的鼻咽癌患者65例作為觀察組，均未接受過(guò)放療、化療或其他生物治療，并經(jīng)術(shù)后病理檢查證實(shí)為原發(fā)性鼻咽癌，術(shù)中收集其癌組織65例份；其中男41例、女24例，年齡(39.57±3.23)歲；組織學(xué)類(lèi)型：角化型38例、非角化型27例；臨床TNM分期[6,7]：Ⅰ期9例、Ⅱ期17例、Ⅲ期31例、Ⅳ期8例；分化程度：高分化鱗狀細(xì)胞癌3例、中分化鱗狀細(xì)胞癌25例、低分化鱗狀細(xì)胞癌22例、未分化癌15例。選擇同期因慢性鼻咽炎進(jìn)行活檢的患者10例作為對(duì)照組，收集其鼻咽正常組織10例份；其中男6例、女4例, 年齡(40.23±3.14)歲。兩組性別、年齡均具有可比性。本研究通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核，患者及家屬均簽署知情同意書(shū)。

1.2 鼻咽組織miR-10b表達(dá)檢測(cè) 采用基于莖環(huán)引物的實(shí)時(shí)熒光定量PCR法。取兩組鼻咽組織，采用TRIzol試劑提取總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)量RNA濃度和純度。選擇純度好的組織樣本，使用莖環(huán)引物對(duì)miR-10b(5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTC-AGTTGAGCACAAATT-3′)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，結(jié)合成熟miR-10b分子3′側(cè)的6個(gè)核苷酸，使用特異性引物(5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′)對(duì)小核RNA(sn-RNA)U6進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，并將其視為內(nèi)參。在50 ng總RNA中進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，終體積為10 μL，包含特異性引物0.1 pmol、1×反應(yīng)緩沖液、dNTP 10 nmol和M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶100 U。將反應(yīng)物在16 ℃條件下溫育30 min，37 ℃溫育50 min，最后70 ℃溫育15 min終止反應(yīng)。通過(guò)定量PCR儀進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)，以U6作為內(nèi)參。PCR反應(yīng)體系：RT產(chǎn)物1 μL，每種引物4 pmol，2×Evagreen Master Mix試劑10 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃、30 s；94 ℃、10 s，61 ℃、45 s，共45個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法[8]計(jì)算miR-10b相對(duì)表達(dá)量。

1.3 鼻咽組織HoxD4 mRNA表達(dá)檢測(cè) 采用熒光定量PCR法。取兩組鼻咽組織，參照1.2的方法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。HoxD4上游引物5′-TGGTCTACCCCTGGATGAAG-3′，下游引物5′-CGACAGACACAGGGTGTGAG-3′，引物長(zhǎng)度187 bp；內(nèi)參U6上游引物5′-TTCGGCAGCACATATACTAAAATTGG-3′，下游引物5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′，引物長(zhǎng)度86 bp。PCR反應(yīng)條件：95 ℃、30 s，95 ℃、5 s，60 ℃、33 s，共40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算HoxD4 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 兩組鼻咽組織miR-10b、HoxD4 mRNA表達(dá)比較及其相關(guān)性分析結(jié)果 觀察組與對(duì)照組鼻咽組織miR-10b相對(duì)表達(dá)量分別為3.94±0.21、1.25±0.14，兩組比較P<0.05；觀察組與對(duì)照組鼻咽組織HoxD4 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1.48±0.67、0.98±0.30，兩組比較P>0.05。鼻咽癌組織中miR-10b與HoxD4 mRNA相對(duì)表達(dá)量無(wú)明顯相關(guān)性(r=0.038,P>0.05)。

2.2 鼻咽癌患者不同臨床病理參數(shù)間鼻咽癌組織miR-10b表達(dá)比較 患者年齡<30歲、臨床TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、T分期為T(mén)3～T4期的鼻咽癌組織miR-10b表達(dá)均高于患者年齡≥30歲、臨床TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期、T分期為T(mén)1～T2期的鼻咽癌組織(P均<0.05)。不同性別、組織學(xué)類(lèi)型、N分期、M分期、分化程度的鼻咽癌組織miR-10b表達(dá)比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均>0.05)。見(jiàn)表1。

3 討論

Gee等[9]使用芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)，除鼻咽癌以外的其他頭頸部惡性腫瘤患者中均存在miR-10b表達(dá)下調(diào)。本研究結(jié)果顯示，觀察組鼻咽組織miR-10b表達(dá)明顯高于對(duì)照組，說(shuō)明原發(fā)性鼻咽癌組織中miR-10b顯著過(guò)表達(dá)，提示miR-10b可能與鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。本研究分析鼻咽癌組織miR-10b表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系時(shí)發(fā)現(xiàn)，年齡<30歲(青年型)的鼻咽癌患者癌組織miR-10b表達(dá)高于≥30歲者，說(shuō)明青年型患者可能具有獨(dú)特的致癌途徑及臨床和生物學(xué)特征。既往研究顯示，青年型鼻咽癌患者中控制細(xì)胞凋亡存活平衡的兩種關(guān)鍵蛋白p53和Bcl-2表達(dá)較少，IgA抗EA和抗VCA抗體較少[10]，而C-kit受體和EBV癌蛋白LMP1較多[11]。這可能是導(dǎo)致青年型鼻咽癌患者miR-10b升高的原因之一，但具體機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。Sun等[12]在鼻咽癌CN-2Z細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)，miR-10b過(guò)表達(dá)可以促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞的遷移和侵襲，提示miR-10b表達(dá)與淋巴結(jié)和(或)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)。但本研究結(jié)果顯示，是否發(fā)生淋巴結(jié)和(或)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的鼻咽癌組織miR-10b表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而臨床TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、T分期為T(mén)3～T4期的鼻咽癌組織miR-10b表達(dá)均高于臨床TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期、T分期為T(mén)1～T2期的鼻咽癌組織；這說(shuō)明miR-10b過(guò)表達(dá)可能參與的是癌細(xì)胞的增殖過(guò)程，而不是遷移和侵襲過(guò)程。

表1 鼻咽癌患者不同臨床病理參數(shù)間鼻咽癌組織miR-10b表達(dá)比較

miROB在線數(shù)據(jù)庫(kù)(http://mirob.interactome.ru/microRNA_databases)顯示，miR-10b主要通過(guò)靶向不同基因，進(jìn)而控制各種不同的細(xì)胞途徑，其中研究最多的是細(xì)胞周期抑制基因和促凋亡基因，如BCL2L11、TFAP2C、CDKN1A、CDKN2A、TP53、CYLD和FOXO3等。關(guān)于miR-10b是否通過(guò)過(guò)表達(dá)HOXD4基因而參與鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移，目前的研究結(jié)果仍存在爭(zhēng)議。一項(xiàng)乳腺癌相關(guān)的研究顯示，miR-10b表達(dá)升高可能是因?yàn)閙iR-10b基因也嵌入在HOXD4基因上游1 kb染色體2q31上的HOXD簇中，即這兩個(gè)基因共享位于miR-10b上游1.5 kb的共同調(diào)節(jié)區(qū)內(nèi)(包含RARE元件)[13]。還有研究證明，抑制miR-10b表達(dá)可以同時(shí)抑制神經(jīng)母細(xì)胞瘤組織HoxD4的表達(dá)[14]。Kim等[15]研究顯示，由于受DNA控制區(qū)域CpG島高甲基化的影響，胃癌細(xì)胞中miR-10b和HoxD4的表達(dá)可出現(xiàn)同時(shí)抑制現(xiàn)象。但本研究結(jié)果顯示，觀察組和對(duì)照組鼻咽組織HoxD4 mRNA表達(dá)比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，且鼻咽癌組織中miR-10b和HoxD4 mRNA表達(dá)無(wú)明顯相關(guān)性，提示兩個(gè)基因受到的調(diào)控途徑可能不同。因此,miR-10b在鼻咽癌發(fā)生中的作用機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

綜上所述，鼻咽癌組織miR-10b表達(dá)升高，miR-10b表達(dá)與患者的年齡、TNM分期及T分期有關(guān)，與HoxD4 mRNA表達(dá)無(wú)關(guān)。