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    特洛細(xì)胞在動脈粥樣硬化小鼠頸動脈血管損傷修復(fù)中的變化

    2020-12-23 06:17:34景德龍姜秋燕肖園園許瑩田虎濟(jì)南市濟(jì)鋼醫(yī)院濟(jì)南500臨沂金鑼醫(yī)院山東第一醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院山東省千佛山醫(yī)院
    山東醫(yī)藥 2020年35期
    關(guān)鍵詞:小鼠

    景德龍,姜秋燕,肖園園,許瑩,田虎 濟(jì)南市濟(jì)鋼醫(yī)院,濟(jì)南500;臨沂金鑼醫(yī)院;山東第一醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院(山東省千佛山醫(yī)院)

    自21世紀(jì)以來,隨著全民生活水平的不斷提高,高油脂、高鹽飲食日益成為人民生活的常態(tài),由此引發(fā)的心血管疾病發(fā)病率也不斷升高[1]。動脈粥樣硬化是一個由多種免疫細(xì)胞、炎癥細(xì)胞共同參與的不可逆轉(zhuǎn)的病理生理學(xué)過程,最終導(dǎo)致目標(biāo)血管狹窄閉塞,引起相應(yīng)組織、器官缺血壞死[2]。特洛細(xì)胞是20世紀(jì)初期發(fā)現(xiàn)的間質(zhì)干細(xì)胞來源的新型細(xì)胞,具有形成三維網(wǎng)狀支架結(jié)構(gòu)的功能,在多種組織器官中發(fā)揮支撐作用;還具有為組織內(nèi)實質(zhì)細(xì)胞傳遞細(xì)胞間信號物質(zhì)的作用,參與調(diào)節(jié)實質(zhì)細(xì)胞的增殖、修復(fù)和凋亡過程[3,4]。已有研究在小鼠主動脈和頸動脈中發(fā)現(xiàn)特洛細(xì)胞的存在,并證實在多個特洛細(xì)胞之間可以形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),在維持血管壁正常結(jié)構(gòu)方面發(fā)揮關(guān)鍵作用[5]。在臨床外科實際工作中,我們發(fā)現(xiàn)動脈粥樣硬化的患者術(shù)后血管壁恢復(fù)時間更長。而特洛細(xì)胞作為動脈血管壁內(nèi)維持三維結(jié)構(gòu)的重要細(xì)胞群,在動脈粥樣硬化過程中是否出現(xiàn)形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變,是否參與粥樣硬化的病理過程均尚未可知。為了深入了解特洛細(xì)胞在動脈粥樣硬化血管銳性損傷修復(fù)過程中的變化,我們于2019年1月~2020年3月進(jìn)行了如下研究。

    1 材料與方法

    1.1 材料 動物:雄性Apo E基因敲除(Apo E-/-)小鼠30只,6周齡,無特殊病原體級,體質(zhì)量(39±6)g;正常SPF級小鼠30只,6周齡,體質(zhì)量(40±9)g;實驗動物均購于北京維通利華實驗動物有限公司,每5只小鼠放于一個飼養(yǎng)箱內(nèi)飼養(yǎng),室溫23 ℃、相對濕度55%,保證小鼠飲食飲水自由。主要試劑:二甲苯購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;檸檬酸抗原修復(fù)液(pH 6.0,G1202)、BSA試劑(G5001)、CD117(1∶500稀釋,GB11073)、血小板衍生生長因子受體(PDGFR,1∶200稀釋,GB11261)、山羊抗兔二抗(1∶200稀釋,G23303)均購于武漢賽維爾生物科技有限公司,CD34抗體(1∶3 000稀釋,AB81289)購于美國Abcam公司。主要儀器:病理切片機(jī)(RM2016)購于上海徠卡儀器有限公司,動物便攜式超聲顯像(CCS2022)購于北京Palmary電子儀器有限公司,熒光顯微鏡(XSP-C204)購于中國CIC公司。

    1.2 動物分組及動脈粥樣硬化建模 選擇Apo E-/-小鼠30只作為觀察組,采用高脂飲食的方法建立動脈粥樣硬化小鼠模型[6]。高脂飲食10周后,應(yīng)用動物便攜式超聲顯像儀對小鼠頸動脈形成的粥樣斑塊進(jìn)行測量,并確定動脈血管的狹窄程度,以小鼠頸動脈血管壁內(nèi)粥樣硬化斑塊占據(jù)血管管徑至少35%作為建模成功的標(biāo)準(zhǔn)。選擇正常SPF級小鼠30只作為對照組,正常飲食喂養(yǎng)10周。

    1.3 頸動脈損傷及修復(fù)處理 兩組均保留3只小鼠作為術(shù)前對照,其余小鼠給予吸入性異氟烷進(jìn)行全身麻醉前的誘導(dǎo)麻醉,待小鼠安靜后,應(yīng)用1%硫噴托納注射液0.1 mL(0.9%生理鹽水稀釋,維持麻醉時間約20 min)進(jìn)行腹腔內(nèi)注射麻醉。麻醉成功后將小鼠置于無菌解剖臺上,固定四肢及頭部,常規(guī)消毒小鼠頸部,鋪無菌巾??v行切開小鼠頸部皮膚及皮下胸腺,裸露頸動脈血管,使用無損傷血管夾夾住動脈血管的兩端,銳性切開部分頸動脈血管壁。在40倍電子顯微鏡下用10-0絲線將損傷血管縫合,確保縫合血管的血流通暢性,然后逐層縫合切口。術(shù)后切口處應(yīng)用碘伏消毒,并涂抹托芬那酸膏和紅霉素軟膏。將小鼠放于溫毯(約42 ℃)上進(jìn)行麻醉復(fù)蘇,術(shù)后均正常飲食,其他飼養(yǎng)條件不變。

    1.4 頸動脈獲取與處理 觀察組和對照組術(shù)后存活數(shù)分別為24、26只,不明原因死亡分別為3、1只。術(shù)后8 h、48 h、21 d,觀察組分別取7、8、9只,對照組分別取8、9、9只,參照1.3的方法進(jìn)行麻醉。在小鼠氣管旁鈍性分離粘連組織,找到有縫合線結(jié)的頸動脈,在距離線結(jié)0.1 cm處上、下各放置血管夾,剪取血管夾之間的頸動脈血管,隨即將標(biāo)本放入通用標(biāo)本固定液中保存。兩組術(shù)前對照小鼠參照1.3的方法麻醉后取頸動脈標(biāo)本。將小鼠頸部術(shù)口簡單縫合,在麻醉狀態(tài)下放入裝有CO2的密閉瓶中處死。標(biāo)本在固定液中保存6 h后取出,采用梯度乙醇脫水的方法對標(biāo)本進(jìn)行脫水處理,二甲苯和氯仿除去標(biāo)本中的脫水劑。選取軟石蠟對標(biāo)本進(jìn)行浸蠟和包埋,病理切片機(jī)將石臘塊切成10 μm厚度的單張切片。

    1.5 特洛細(xì)胞形態(tài)及數(shù)量觀察 采用雙標(biāo)記免疫熒光染色法[7]。將兩組頸動脈石蠟切片進(jìn)行洗滌,置于盛滿EDTA抗原修復(fù)緩沖液(pH 9.0)的修復(fù)盒中,于微波爐內(nèi)進(jìn)行抗原修復(fù)。使用組化筆在組織周圍畫圈(防止抗體流走),在圈內(nèi)滴加自發(fā)熒光淬滅劑A液;常溫孵育、滴加自發(fā)熒光淬滅劑B液,甩干后在圈內(nèi)滴加10%正常兔血清均勻覆蓋組織。室溫封閉30 min,加入CD34、CD117、PDGFR一抗進(jìn)行染色,最后經(jīng)DAPI復(fù)染細(xì)胞核(表現(xiàn)為藍(lán)色)。封片后熒光顯色顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并進(jìn)行拍照。CD34、CD117、PDGFR染色情況:對照組術(shù)后8 h標(biāo)本CD34、CD117、PDGFR抗體熒光顯色分別為紅色、綠色、綠色,術(shù)后48 h、21 d均分別為綠色、紅色、綠色;觀察組術(shù)后8 h分別為綠色、紅色、綠色,術(shù)后48 h分別為紅色、紅色、綠色,術(shù)后21 d分別為紅色、綠色、綠色。同時選取面積大小為10 μm2的血管圖像,對CD34陽性染色(CD34+)的特洛細(xì)胞進(jìn)行計數(shù),每個圖像重復(fù)兩次,取平均值。

    2 結(jié)果

    2.1 兩組小鼠損傷后不同時間點頸動脈血管中特洛細(xì)胞形態(tài)變化比較 觀察組和對照組術(shù)前綠色熒光的CD34+和PDGFR+特洛細(xì)胞均集中位于血管壁的外膜層中。術(shù)后8 h,觀察組CD34+特洛細(xì)胞(綠色熒光)聚集在血管壁外膜損傷處,對照組血管壁外膜損傷處的CD34+特洛細(xì)胞(紅色熒光)數(shù)量明顯多于觀察組,CD117+和PDGFR+特洛細(xì)胞也有相同表現(xiàn),但細(xì)胞形態(tài)改變不明顯。術(shù)后48 h,觀察組CD117+特洛細(xì)胞(紅色熒光)數(shù)量明顯減少,細(xì)胞體扁平,由圓形或橢圓形變?yōu)榧?xì)長的梭形,端足細(xì)長如絲;對照組CD34+(綠色熒光)和CD117+(紅色熒光)特洛細(xì)胞形態(tài)較術(shù)后8 h無明顯差別,端足形態(tài)無明顯改變。術(shù)后21 d,觀察組CD117+(綠色熒光)特洛細(xì)胞形態(tài)恢復(fù)至術(shù)前和術(shù)后8 h的形態(tài),但特洛細(xì)胞數(shù)量較術(shù)后8 h明顯減少;對照組CD34+(綠色熒光)、CD117+(紅色熒光)和PDGFR+(綠色熒光)特洛細(xì)胞形態(tài)較術(shù)前無明顯差別,數(shù)量無明顯改變。

    2.2 兩組小鼠損傷后不同時間點頸動脈血管中特洛細(xì)胞數(shù)量比較 隨著時間的推移,兩組術(shù)后特洛細(xì)胞數(shù)量均呈現(xiàn)先升高后降低趨勢。兩組術(shù)前特洛細(xì)胞數(shù)量比較無明顯差異(P>0.05)。觀察組術(shù)后8 h特洛細(xì)胞數(shù)量高于術(shù)前,術(shù)后48 h和術(shù)后21 d特洛細(xì)胞數(shù)量均低于術(shù)前(P均<0.05);對照組術(shù)后8、48 h特洛細(xì)胞數(shù)量均高于術(shù)前(P均<0.05),術(shù)后21 d與術(shù)前比較無明顯差異(P>0.05)。觀察組術(shù)后8 h、48 h、21 d特洛細(xì)胞數(shù)量均低于對照組(P均<0.05)。見表1。

    表1 兩組小鼠損傷后不同時間點頸動脈血管中特洛細(xì)胞數(shù)量比較(個,

    3 討論

    自特洛細(xì)胞被發(fā)現(xiàn)至今已有50余年的歷史,目前研究重點多聚焦在這種特殊細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)以及組織分布上[8, 9],關(guān)于特洛細(xì)胞在病理生理學(xué)方面的研究較少。雖然近幾年來特洛細(xì)胞在皮膚免疫性硬化癥、子宮肌瘤和肺纖維化的病理研究中有些進(jìn)展,但是并沒有從分子生物學(xué)的角度完全解釋特洛細(xì)胞在疾病發(fā)生、發(fā)展過程中的各種改變[10, 11]。特洛細(xì)胞存在于動脈血管壁內(nèi),在動脈血管壁的外膜層和中膜層形成三維立體框架結(jié)構(gòu),支撐和維持血管的正常形態(tài)功能[12, 13]。目前,國內(nèi)外關(guān)于特洛細(xì)胞免疫生物學(xué)指標(biāo)的研究集中在CD34、CD117、PDGFR、VEGFR、CD28、CD31、Vimentin、Nanog和Sca-1等免疫標(biāo)記抗體上,應(yīng)用免疫熒光技術(shù)將標(biāo)本中的組織染色后可以將組織中的特洛細(xì)胞和成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等常見細(xì)胞分離開來,再根據(jù)標(biāo)記后細(xì)胞表現(xiàn)出的特殊形態(tài)結(jié)構(gòu)將特洛細(xì)胞區(qū)分出來[14, 15]。雖然在不同的組織器官中,特洛細(xì)胞陽性表達(dá)的免疫生物學(xué)指標(biāo)有所不同,但在小鼠動脈血管壁中特洛細(xì)胞陽性表達(dá)的免疫指標(biāo)為CD34、CD117和PDGFR,這也是本研究應(yīng)用CD34/CD117和CD34/PDGFR雙標(biāo)記免疫熒光染色法的理論基礎(chǔ)。

    動脈粥樣硬化是發(fā)生于動脈血管壁的常見病理改變,粥樣硬化斑塊從動脈血管的損傷內(nèi)膜開始,逐漸不可逆地向動脈外膜層進(jìn)展。動脈粥樣硬化過程中從內(nèi)皮細(xì)胞開始發(fā)生細(xì)胞水樣變性、脂肪樣變性及泡沫樣變性等病理學(xué)改變,變性的細(xì)胞逐漸增多并深達(dá)血管壁肌層,導(dǎo)致血管壁正常結(jié)構(gòu)的退變及消失,彈性減弱甚至失去彈性[3,16,17]。在動脈粥樣硬化疾病發(fā)生發(fā)展過程中,存在著大量正常細(xì)胞的變性壞死和炎性細(xì)胞浸潤,而特洛細(xì)胞作為一種維持正常血管壁形態(tài)結(jié)構(gòu)的功能性細(xì)胞,在動脈粥樣硬化的病理發(fā)展過程中出現(xiàn)了細(xì)胞體脂肪樣變性和水樣變性,失去了細(xì)胞間廣泛的連接。此時的血管如果受到損傷,在修復(fù)過程中受到脂質(zhì)體侵蝕的細(xì)胞會因失去正常功能而影響血管壁修復(fù)[6]。

    本研究結(jié)果顯示,兩組術(shù)前頸動脈血管中的特洛細(xì)胞數(shù)量無統(tǒng)計學(xué)差異,說明動脈粥樣硬化并不會影響頸動脈血管中的特洛細(xì)胞數(shù)量。頸動脈血管損傷后修復(fù)過程中,對照組特洛細(xì)胞數(shù)量在術(shù)后8 h明顯升高后又緩慢降低至損傷前水平,而觀察組特洛細(xì)胞數(shù)量雖然也在術(shù)后8 h出現(xiàn)了升高趨勢,但隨著時間推移其數(shù)量明顯降低,且觀察組術(shù)后8 h、48 h和21 d特洛細(xì)胞數(shù)量均明顯低于對照組。這說明在動脈粥樣硬化小鼠頸動脈血管損傷修復(fù)的過程中,其特洛細(xì)胞數(shù)量明顯少于正常小鼠。因此,特洛細(xì)胞參與了動脈粥樣硬化小鼠的頸動脈血管損傷修復(fù)。本研究結(jié)果顯示,觀察組血管損傷修復(fù)過程中伴隨著特洛細(xì)胞和端足形態(tài)改變,在損傷修復(fù)初期特洛細(xì)胞的細(xì)胞體由圓形或橢圓形變?yōu)榧?xì)長的梭形,端足變得更加細(xì)長或消失,直到損傷修復(fù)后期(術(shù)后21 d)其細(xì)胞形態(tài)恢復(fù)至術(shù)前狀態(tài);但在正常動脈血管中,未發(fā)現(xiàn)上述特洛細(xì)胞形態(tài)的改變。分析原因,這可能與動脈粥樣硬化過程中高血脂對血管壁的影響有關(guān);在脂質(zhì)體的影響下,特洛細(xì)胞的數(shù)量可能無法恢復(fù)到正常水平,從而延長了血管損傷后修復(fù)的時間。

    綜上所述,動脈粥樣硬化并不會影響小鼠頸動脈血管中的特洛細(xì)胞數(shù)量,但動脈粥樣硬化小鼠在頸動脈血管損傷修復(fù)過程中存在特洛細(xì)胞數(shù)量降低及形態(tài)異常。本研究僅從宏觀角度闡述了特洛細(xì)胞在血管損傷修復(fù)過程中的數(shù)量變化規(guī)律,應(yīng)用免疫生物學(xué)原理觀察特洛細(xì)胞在血管修復(fù)不同階段的形態(tài)改變,但只有應(yīng)有透射電鏡技術(shù)才能觀察到特洛細(xì)胞內(nèi)各種細(xì)胞器的種類改變及其在疾病不同階段的超微結(jié)構(gòu)改變[18, 19],這也是本研究的不足之處。在接下來的研究中,我們將從小鼠動脈粥樣硬化血管的活體標(biāo)本中分離特洛細(xì)胞,進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng),以達(dá)到從微觀角度分析研究特洛細(xì)胞的目的。

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