miR-122靶向調控CREB1對膀胱癌細胞增殖、侵襲能力的影響及其分子機制

王藝璇，郭立華 吉林大學中日聯誼醫(yī)院，長春130033

膀胱癌是常見的惡性腫瘤，其病死率和發(fā)病率在我國所有泌尿系統(tǒng)腫瘤中均排名第一[1, 2]，其復發(fā)率高、患者預后較差[3]。微小RNA122(miR-122)是與腫瘤密切相關的miRNA之一，在不同腫瘤中發(fā)揮的作用不同，既是腫瘤促癌因子又是抑癌因子[4, 5]。前期研究顯示，miR-122在膀胱癌組織及細胞中均表達下調，其過表達可抑制膀胱癌細胞的遷移、侵襲、體外集落形成能力和體內血管生成能力[6]。轉錄因子環(huán)磷腺苷效應元件結合蛋白1(CREB1)可通過磷酸化和去磷酸化來調節(jié)基因轉錄[7]，其在膀胱癌中表達上調，是膀胱癌患者預后不良的分子標志物[8]。研究顯示，miR-122可通過靶向抑制CREB1而抑制胃癌細胞的增殖和侵襲能力[9]，CREB1是否作為miR-122的靶基因而參與膀胱癌細胞的增殖和侵襲及其相關的下游通路目前均尚不明了。為此，我們于2019年1月～2020年3月進行了如下研究。

1 材料與方法

1.1 材料 細胞：膀胱癌J82細胞購自美國ATCC細胞庫。主要試劑：RPMI1640培養(yǎng)基和胎牛血清(FBS)均購自美國Gibco公司，miRNA提取試劑盒購自上海玉博生物試劑有限公司，ULtraRT 一步法RT-PCR試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司，雙熒光素酶基因報告試劑盒和蛋白濃度檢測試劑盒均購自中國上海碧云天生物試劑有限公司，MTS試劑購自美國Biovision公司，CREB1、蛋白激酶B(Akt)、磷酸化Akt(p-Akt)、雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、磷酸化mTOR(p-mTOR)均購自于美國Proteintech公司，ECL化學發(fā)光試劑盒購自于美國Thermo公司。引物：miR-122、CREB1、內參U6和GAPDH引物均由上海生工生物工程有限公司設計合成。質粒：miR-122模擬物(miR-122 mimic)、CREB1過表達質粒、對照質粒、CREB1野生型質粒(CREB1-wt)和CREB1突變型質粒(CREB1-mut)均購自上海吉凱基因化學技術有限公司。

1.2 miR-122與CREB1的靶向調控關系分析 采用雙熒光素酶報告實驗。TargetScan7.1軟件(http://www.targetscan.org/)預測程序顯示，miR-122與CREB1啟動子區(qū)存在連續(xù)的結合位點，見圖1。將J82細胞以3×103/孔接種到96孔板中，接種24 h后分為四部分，采用LipofectamineTM2000分別進行CREB1-wt、CREB1-mut與miR-122 mimic、對照質粒的共轉染。轉染48 h，采用雙熒光素酶基因報告試劑盒檢測細胞熒光素酶活性。

圖1 TargetScan7.1軟件預測程序顯示miR-122與CREB1之間存在連續(xù)的結合位點

1.3 細胞培養(yǎng)及分組轉染 將J82細胞置于含有10% FBS的RPMI1640培養(yǎng)基中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞生長狀態(tài)較好時，胰酶消化收集細胞。將J82細胞分為三組，共轉染組采用LipofectamineTM2000轉染miR-122 mimic及CREB1過表達質粒，miR-122 mimic組轉染miR-122 mimic，對照組轉染對照質粒，轉染48 h。

1.4 轉染效果檢測 采用實時熒光定量PCR法。收集各組細胞，采用miRNA提取試劑盒獲得細胞總RNA，分光光度計檢測RNA濃度。采用ULtraRT一步法RT-PCR試劑盒將RNA逆轉錄為cDNA，并以cDNA為模板進一步擴增。miR-122上游引物5′-TATTCGCACTGGATACGACACAAAC-3′、下游引物5′-GCCCGTGGAGTGTGACAATGGT-3′，內參U6上游引物5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′、下游引物5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。CREB1上游引物5′-CTTTTCTCCGGAACACAGATTTC-3′、下游引物5′-GATTTGCCAAGTGGGAGGGA-3′，內參GAPDH上游引物5′-CACTCCTCCACCTTTGA-3′、下游引物5′-CCACCACCCTGTTGCTG-3′。PCR反應體系：2×ULtraRT一步緩沖液12.5 μL、RNA 1 μL、上下游引物各1 μL、ULtraRT一步酶混合液0.5 μL，用無RNA酶的雙蒸水補足25 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性2 min，94 ℃變性30 s、65 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，共40個變性退火延伸循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計算miR-122、CREB1 mRNA相對表達量。

1.5 細胞增殖能力觀察 ①MTS法：胰酶消化收集1.3中的各組細胞，以2×103/孔接種至96孔板中，每組設置6個復孔。培養(yǎng)48 h，加入20 μL MTS試劑與細胞共同孵育1 h。采用全波長掃描儀檢測各孔450 nm波長處的光密度(OD)值，OD值越高表示細胞增殖能力越強。②平板克隆實驗：胰酶消化收集1.3中的各組細胞，以2×102/孔接種至6孔板中，混勻后在細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，及時更換培養(yǎng)基。培養(yǎng)2周左右肉眼可見細胞克隆團形成時終止培養(yǎng)，甲醇固定、吉姆薩染色后計數克隆形成數?？寺⌒纬蓴翟蕉?表示細胞增殖能力越強。

1.6 細胞侵襲能力觀察 采用Transwell小室實驗。胰酶消化收集1.3中的各組細胞，采用無血清培養(yǎng)基洗滌細胞，去除FBS和胰酶。將1×104個細胞重懸至100 μL無血清培養(yǎng)基中，混勻后加至Transwell小室的上室中，將500 μL含10% FBS的培養(yǎng)基加至Transwell小室的下室中。放置細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 h，下室可見由上室穿過膜進入的細胞時終止培養(yǎng)。甲醇固定、吉姆薩染色后計數穿膜細胞數，細胞穿膜數越多表示細胞侵襲能力越強。

1.7 細胞CREB1及Akt/mTOR信號通路相關蛋白表達檢測 采用Western blotting法。各組轉染48 h收集細胞，加入蛋白裂解液進行裂解。離心去除細胞碎片，獲得細胞總蛋白。細胞總蛋白與上樣緩沖液混勻后，經沸水煮沸變性。變性的蛋白上樣進行凝膠電泳，并采用濕轉法將蛋白轉移至PVDF膜上。PVDF膜置于8%牛奶中，室溫孵育1 h。加入CREB1、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR、內參蛋白GAPDH一抗(稀釋比例均為1∶500)，4 ℃孵育過夜；加入二抗，室溫孵育2 h。TBST沖洗3次，采用ECL顯示蛋白條帶;Image J軟件分析條帶灰度值，計算各蛋白相對表達量。

2 結果

2.1 雙熒光素酶基因報告實驗結果 共轉染對照質粒+CREB1-mut或miR-122 mimic+CREB1-mut的J82細胞熒光素酶活性分別為1.00±0.10、0.92±0.13(P>0.05)，共轉染對照質粒+CREB1-wt或miR-122 mimic+CREB1-wt的J82細胞熒光素酶活性分別為1.00±0.06、0.57±0.09(P<0.01)。

2.2 各組細胞miR-122、CREB1 mRNA表達比較 見表1。

表1 各組細胞miR-122、CREB1 mRNA表達比較

2.3 各組細胞增殖、侵襲能力比較 見表2。

表2 各組細胞增殖OD值、克隆形成數、穿膜細胞數比較

2.4 各組細胞CREB1及Akt/mTOR信號通路蛋白表達比較 見表3。

表3 各組細胞CREB1及Akt/mTOR信號通路蛋白表達比較

3 討論

膀胱癌是最常見的惡性泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤之一，是尿路上皮演變而來的尿路上皮癌[1]。根治性膀胱切除術和全身化療是治療膀胱癌的主要方法，但其總體治療效果有限，患者的5年生存率較低，高復發(fā)率和遠處轉移是導致患者預后較差的重要原因[3]。闡明膀胱癌發(fā)展的分子機制具有重要的臨床意義，有助于探索膀胱癌新的治療靶點和開發(fā)更有效的靶向藥物。

miRNA是一類保守的內源性非編碼RNA分子，長度為18～25個核苷酸，可通過轉錄后誘導降解或抑制靶信使RNA(mRNA)的翻譯來調控靶基因，并參與調節(jié)如細胞發(fā)育、分化和運動等各種細胞功能。超過50%的miRNA位于與腫瘤相關的基因組區(qū)域，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關鍵作用。近年來，miRNA作為抗癌藥物的靶點被廣泛研究[10]。盡管膀胱癌組織中已經鑒定出許多差異表達miRNA，但尚未開發(fā)出有效的臨床藥物。miR-122是在脊椎動物中表達高度保守的肝臟特異性miRNA，在肝細胞肝癌中是一種新型的腫瘤抑制因子[4]。miR-122在卵巢癌和胃癌等腫瘤中發(fā)揮抑癌作用，可抑制腫瘤細胞的惡性進展[11, 12]；但是，在結直腸癌和腎癌等腫瘤中miR-122發(fā)揮促癌作用，可促進腫瘤細胞增殖、侵襲和轉移等生物學行為[5,13]。以上提示miR-122與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關，但是發(fā)揮的作用并不一致。Wang等[6]報道，miR-122在膀胱癌組織和細胞系中的表達均降低，過表達miR-122在體內和體外均可抑制膀胱癌細胞HT1376的惡性生物學行為。本研究結果顯示，轉染miR-122 mimic后，J82細胞的增殖和侵襲能力降低，說明miR-122 在膀胱癌中可發(fā)揮抑癌作用。

miRNA通常通過與3′-UTR的互補堿基配對來抑制mRNA翻譯，并降低mRNA穩(wěn)定性，從而調節(jié)基因表達。研究報道，miRNA可調節(jié)多種癌基因或抑癌基因，從而參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[10]。在卵巢癌中miR-122通過靶向脯氨酰-4-羥化酶亞基α-1(P4HA1)基因發(fā)揮抑癌作用[11]，在膀胱癌中miR-122通過靶向促癌基因血管內皮生長因子C(VEGFC)的表達而抑制細胞增殖和侵襲[6]。每一個miRNA可以調控多個靶基因，CREB1是原癌基因轉錄因子，可促進其靶基因表達，參與代謝和DNA修復[7]。研究報道，CREB1表達升高可促進乳腺癌和結直腸癌等多種腫瘤的進展，為腫瘤促癌基因[14, 15]。Rao等[9]報道,在胃癌中CREB1可作為miR-122的直接作用靶點，參與miR-122對于腫瘤細胞增殖和侵襲能力的抑制作用。本研究采用TargetScan7.1軟件預測miR-122與CREB1啟動子區(qū)具有連續(xù)的結合位點，并且雙熒光素酶基因報告實驗結果顯示，在J82細胞中miR-122可靶向負調控CREB1。本研究進一步實驗結果顯示，CREB1過表達可以減弱miR-122對J82細胞增殖和侵襲能力的抑制作用，表明miR-122可通過負向靶控CREB1而抑制膀胱癌細胞的增殖和侵襲能力。

在乳腺癌中，miR-122通過靶向IGF1R調節(jié)Akt/mTOR信號途徑而發(fā)揮作用[16]。Akt的激活或過度表達是腫瘤進展的標志;mTOR是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，是許多腫瘤細胞增殖、侵襲和其他生物學進程中的關鍵調節(jié)劑[16]。在包括膀胱癌在內的各種腫瘤進展中,Akt/mTOR信號途徑均發(fā)揮促進作用。本研究結果顯示，miR-122可抑制膀胱癌細胞Akt和mTOR蛋白的磷酸化水平，但是CREB1可以減弱miR-122的這種作用。以上結果均表明，miR-122通過作用靶點CREB1負向調控Akt/mTOR通路，從而抑制膀胱癌細胞的增殖和侵襲。