IVF-ET 中受精失敗高危因素及后續(xù)處理的研究進(jìn)展

胡瑞雪 ，霍鵬 ，張順

（1.桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心， 廣西 桂林；2.桂林醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，廣西 桂林）

0 引言

世界衛(wèi)生組織表明不孕癥已成為世界第三大頑疾，2017年的生育調(diào)查發(fā)現(xiàn)我國育齡夫婦中不孕率已高達(dá)25.44%[1]。雖然IVF-ET技術(shù)是當(dāng)前治療不孕癥的主要手段，但受限于目前技術(shù)，IVF-ET中大概仍然有10%-15%的FF，包括完全受精失敗（total fertilization failures，TFF）和部分受精失敗，TFF指全部卵母細(xì)胞均未受精(受精率=0%)，部分受精失敗指卵母細(xì)胞受精率≤25%[2]?，F(xiàn)今已知的受精過程包括有精子獲能、卵丘穿透、精卵融合、皮質(zhì)卵丘釋放、第二極體（2PB）釋放及雌雄原核的形成等，且其任一環(huán)節(jié)出現(xiàn)問題均可能導(dǎo)致FF，因此影響受精的因素必然是眾多的。對于FF者將被迫面臨無胚可移、取消周期、經(jīng)濟(jì)損失等風(fēng)險，這無疑對患者和醫(yī)務(wù)工作者都造成了一定的創(chuàng)傷。

為明確FF的原因，國內(nèi)外多個前瞻性及回顧性研究探討了與FF相關(guān)的高危因素，但這些研究的類型、對象及方法等不統(tǒng)一，研究結(jié)論也不完全一致。同時，為預(yù)防和降低FF，國內(nèi)外各輔助生殖機(jī)構(gòu)不斷探索，但對存在FF高危因素者所采取的受精方式、FF的補(bǔ)救條件及補(bǔ)救方法上目前仍存在差異，且各后續(xù)處理的安全性、有效性及經(jīng)濟(jì)性也值得探討。因此，臨床及科研工作者亟須一個可靠的指導(dǎo)依據(jù)，以助患者取得更好的臨床結(jié)局。本文通過整理分析目前國內(nèi)外與此相關(guān)的研究，綜述了影響FF的高危因素及為預(yù)防和降低FF采取的后續(xù)處理。以期為研究、預(yù)測及干預(yù)FF提供一定方向和依據(jù)，同時，為FF高危者找到有效、經(jīng)濟(jì)及安全的實(shí)踐措施。

1 IVF 中受精失敗的高危因素

（1）男方因素：目前研究發(fā)現(xiàn)FF與男方因素最為相關(guān)，其中精液參數(shù)異常、精子與透明帶結(jié)合及穿透異常較常見，精子缺少與卵子質(zhì)膜融合的相關(guān)受體或因子及精子原因?qū)е碌穆炎蛹せ钫系K等較罕見[2,3]。Zhu J等[4]通過病因不同對IVF-ET周期進(jìn)行分組，發(fā)現(xiàn)少弱精子癥組相較于精液參數(shù)正常組發(fā)生FF的比例明顯升高，Logistic回歸模型也顯示少弱精子癥是FF的獨(dú)立危險因素。孫青等[5]通過對比IVF-ET中正常受精率組(受精率≥50%)與低受精率組(受精率<50%)組的精子參數(shù)，發(fā)現(xiàn)精液常規(guī)中正常形態(tài)前向運(yùn)動精子總數(shù)及處理后活動精子百分率與低受精率呈負(fù)相關(guān)，二者可作為預(yù)測IVF-ET低受精率的指標(biāo)。薛林濤[6]對IVF-ET周期中精子參數(shù)與受精結(jié)局行多元回歸分析，結(jié)果顯示受精率與前向運(yùn)動精子百分率及精子頂體完整率呈正相關(guān)，與精子DNA碎片率呈負(fù)相關(guān)，且三者均是預(yù)測IVF-ET周期受精失敗或低受精發(fā)生的獨(dú)立指標(biāo)。同時Liu D等學(xué)者在顯微鏡下觀察未受精的卵母細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)42%的卵子內(nèi)未見精子穿過透明帶且精子的頂體反應(yīng)較紊亂，說明精子與透明帶結(jié)合及穿透異常阻礙了受精發(fā)生[7]。這些研究從宏觀上揭示了精子形態(tài)及功能的異?？赡軐?dǎo)致FF的發(fā)生，但內(nèi)在的分子機(jī)制仍不明確。有學(xué)者將IVF-ET中精液正常男性分為常規(guī)IVF-ET妊娠組及R-ICSI妊娠組，對比發(fā)現(xiàn)兩組間存在精漿蛋白及精子蛋白的表達(dá)差異且R-ICSI妊娠組的自發(fā)性頂體反應(yīng)率增加，提示三者的改變可能影響IVF時的受精[8,9]，這將從分子的角度提升對原因不明男性不育的新認(rèn)識。近期Yan Z等[10]發(fā)現(xiàn)，在14個FF或受精不良的獨(dú)立家系的原發(fā)不育男性中有5個出現(xiàn)了PLCZ1突變，對其進(jìn)行人工卵母細(xì)胞激活（AOA）后其中4個被補(bǔ)救成功并產(chǎn)下3名健康嬰兒。我們已知PLCZ1在誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)鈣(Ca2+)振蕩和啟動卵母細(xì)胞激活中是必不可少的，這從分子基因的角度揭示了原發(fā)不育男性發(fā)生FF的原因，但仍需大規(guī)模的研究認(rèn)證。

（2）女方因素：原發(fā)不孕及不明原因不孕是FF公認(rèn)的高危因素，而卵母細(xì)胞結(jié)構(gòu)、卵母細(xì)胞功能異常基本被認(rèn)為與FF密切相關(guān)[2，3，4]。郝大勇等[11]通過對卵母細(xì)胞進(jìn)行電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)IVFET中未受精的卵母細(xì)胞透明帶比受精的卵母細(xì)胞明顯增厚，這可能引起精子穿透過程的障礙而發(fā)生FF。Li J等[12]對既往ICSI受精失敗的卵母細(xì)胞均分成常規(guī)ICSI后行AOA組（AOA組）及常規(guī)ICSI組（非AOA組）受精，發(fā)現(xiàn)AOA組的受精率和可移植胚胎率明顯高于非AOA組，提示卵母細(xì)胞激活障礙與FF的發(fā)生密切相關(guān)。而Bonte D[13]等使用小鼠卵母細(xì)胞激活試驗(yàn)(MOAT)來檢測精子相關(guān)的卵母細(xì)胞激活功能，再對比激活能力正常者的ICSI后FF的AOA周期和既往ICSI周期，發(fā)現(xiàn)AOA組的受精率、妊娠率和活產(chǎn)率明顯高于既往ICSI組，說明卵母細(xì)胞自身的激活缺陷與FF密切相關(guān)。由于AOA的過度侵入性，目前多在ICSI后發(fā)生FF時使用。近期，Huang L等[14]對出現(xiàn)卵母細(xì)胞成熟停滯的9個獨(dú)立家系的原發(fā)性不孕患者進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其中4個為雙等位基因PATL2突變，提示原發(fā)不孕者出現(xiàn)卵母細(xì)胞成熟停滯可能與這一基因突變有關(guān)，這可能是原發(fā)不孕易發(fā)生FF的原因之一，但仍需大樣本的研究。

（3）其他因素：當(dāng)然，IVF-ET過程中所涉及的一些不可控因素同樣會造成FF的發(fā)生，如操作技巧、實(shí)驗(yàn)室環(huán)境、實(shí)驗(yàn)室人員對卵子質(zhì)量、卵子成熟程度及2PB排出情況的判斷等[2]，因此經(jīng)驗(yàn)豐富的胚胎學(xué)家對每一個輔助生殖實(shí)驗(yàn)室都是至關(guān)重要的。

2 IVF-ET 中受精失敗的后續(xù)處理

（1）晚補(bǔ)救 ICSI（Late rescue intracytoplasmic sperm injection，L-ICSI）

1994年Lundin K[15]等首次報道用ICSI補(bǔ)救傳統(tǒng)IVF（過夜受精）后FF的卵母細(xì)胞，即晚補(bǔ)救ICSI，由于卵子最佳受精窗的錯失及卵子老化，受精率低于常規(guī)ICSI周期。由于L-ICSI相當(dāng)于取卵后的第二日受精，導(dǎo)致第3天移植的往往是2-4細(xì)胞期胚胎，此時胚胎發(fā)育與子宮內(nèi)膜發(fā)育不同步，雖受精率有所升高但胚胎種植率極低。因此，有學(xué)者將凍融移植和鮮胚移植周期做對比，發(fā)現(xiàn)相較于后者，前者胚胎植入率明顯改善，建議L-ICSI中的胚胎冷凍保存后用于凍融周期[16]。但因卵子老化、最佳受精窗口期的錯失及胚胎與子宮內(nèi)膜發(fā)育的不同步，L-ICSI對FF周期的臨床結(jié)局并無明顯改善。

（2）部分卵胞漿內(nèi)ICSI (half-ICSI)

1996年Aboulghar M等[17]提出對存在FF高危因素者應(yīng)行half-ICSI受精，即將取出的卵母細(xì)胞隨機(jī)均分為2組，分別采用傳統(tǒng)IVF和ICSI授精。雖改善了此類患者的臨床結(jié)局，但盲目擴(kuò)大了ICSI的應(yīng)用范圍，并有部分卵子因未發(fā)現(xiàn)FF而未行補(bǔ)救ICSI造成了卵子的浪費(fèi)。劉苡萱等[18]將IVF-ET中FF高危者分成Half-ICSI組與R-ICSI組，發(fā)現(xiàn)Half-ICSI組的ICSI周期率遠(yuǎn)高于R-ICSI組，其89.8%的ICSI卵子是常規(guī)IVF中受精率正常的卵子，屬于過度ICSI。且ICSI時繞過了正常的受精過程，逃避了卵子對精子的自然選擇，存在將攜帶父源性異常染色體的精子注入卵子遺傳給子代的可能。Bonduelle M等[19]對ICSI獲得兒進(jìn)行了產(chǎn)前檢測，發(fā)現(xiàn)胎兒染色體異常率明顯高于一般人群，且主要為父源性，當(dāng)存在精液異常時發(fā)病率更高，因此應(yīng)盡量避免過度ICSI。

（3）短時受精聯(lián)合早期補(bǔ)救ICSI (Rescue-ICSI， R-ICSI)

2003年Chen等[20]提出了R-ICSI的概念，即IVF受精4-6h通過觀察2PB的排出情況判斷是否受精，對無2PB排出的卵母細(xì)胞行補(bǔ)救ICSI，獲得了較高的受精率、妊娠率和著床率。He Y等將存在受精失敗高危因素的IVF周期分為傳統(tǒng)IVF組、短時IVF受精組（受精率>30%）及R-ICSI組（TFF后行R-ICSI)，發(fā)現(xiàn)三組間胚胎植入率和臨床妊娠率無明顯差異，說明 R-ICSI是一種安全、可靠的受精方式，使FF高危者即使發(fā)生FF時仍獲得了較好的臨床結(jié)局[21]。即使對目前爭議較大的不明原因性不孕，嚴(yán)為巧等采用Half-ICSI及 R-ICSI受精，對比發(fā)現(xiàn)二者在正常受精率、優(yōu)胚率、臨床妊娠率及種植率等方面均無統(tǒng)計學(xué)差異[22]。當(dāng)然，也有研究者稱當(dāng)一個周期獲得的卵母細(xì)胞較少且精子參數(shù)正常時，傳統(tǒng)IVF的結(jié)局優(yōu)于補(bǔ)救ICSI和ICSI周期[23]。因此R-ICSI受精是否適用于所有的IVF-ET周期仍是不明確的。

L-ICSI因不理想的臨床結(jié)局，目前臨床上已基本棄用。對FF高危者，相較于half-ICSI， R-ICSI既提高了IVF-ET中FF周期的正常受精率，又避免了過度ICSI帶來的安全隱患，對預(yù)防和改善FF更加精準(zhǔn)、有效。

3 R-ICSI 的依據(jù)及其優(yōu)勢

3.1 R-ICSI 的理論依據(jù)

R-ICSI包括短時受精及早期補(bǔ)救ICSI兩部分。傳統(tǒng)IVF受精失敗后的補(bǔ)救ICSI大多在隔日進(jìn)行，即L-ICSI，隨卵齡的延長細(xì)胞核質(zhì)過度成熟甚至老化，導(dǎo)致卵子最佳受精窗的錯失，且卵母細(xì)胞暴露于培養(yǎng)液內(nèi)增加了與毒性物質(zhì)接觸的時間，導(dǎo)致遺傳物質(zhì)畸變及染色體異常的概率升高，不僅影響卵子受精而且降低了胚胎發(fā)育潛能，這為R-ICSI奠定了基礎(chǔ)。

3.2 短時受精中受精的觀察時機(jī)及指標(biāo)

核質(zhì)成熟的卵母細(xì)胞停留在MⅡ期，與精子結(jié)合后被激活完成第二次減數(shù)分裂并排出2PB，隨后再形成雌雄原核，因此，2PB的排出是卵母細(xì)胞形態(tài)學(xué)上最早的受精的標(biāo)志，是目前判斷卵母細(xì)胞早期受精的金標(biāo)準(zhǔn)，因此找到2PB的最佳觀測時間，以便及時對未受精的卵子行補(bǔ)救ICSI非常重要。有研究表明[24]，卵子一般在精卵共培養(yǎng)2-4h后完成受精過程，6h后大約有90%的受精卵排出第二極體，也有報道發(fā)現(xiàn)授精4h超過90%的受精卵排出第二極體[25]。當(dāng)然，即使授精6 h后仍存在10%左右的卵母細(xì)胞出現(xiàn)2PB延遲釋放的情況，因此對FF周期行補(bǔ)救ICSI時對存在2PB的卵不建議行ICSI，防止造成多精受精。近期有研究者通過紡錘體觀察儀觀察IVF中不同受精時間（4h、5h、6h）的卵母細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)受精5小時出現(xiàn)紡錘體是卵母細(xì)胞未受精的準(zhǔn)確指標(biāo)，此時結(jié)合補(bǔ)救ICSI可有效地防止FF及降低多精受精率[26]。但由于PM價格昂貴，目前并不是每個生殖實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)用品。

3.3 早期補(bǔ)救ICSI 的時間

卵母細(xì)胞成熟包括細(xì)胞核、質(zhì)的共成熟，且細(xì)胞質(zhì)成熟需經(jīng)歷復(fù)雜的生理生化過程，較細(xì)胞核成熟晚，二者同時成熟對受精及后續(xù)的胚胎發(fā)育至關(guān)重要與此同時，在脫顆粒細(xì)胞判斷是否受精之前，卵子周圍的顆粒細(xì)胞可為卵母細(xì)胞提供促進(jìn)早期胚胎發(fā)育所需的營養(yǎng)物質(zhì)，而適時的脫除顆粒細(xì)胞又可去除對早期胚胎發(fā)育有害的物質(zhì)，并避免顆粒細(xì)胞和高密度精子長期存在對胚胎發(fā)育的不利影響。王紫娟等研究者[27]發(fā)現(xiàn)R-ICSI的受精率并不明顯低于常規(guī)IVF或首次因男方因素行ICSI的周期，推測可能是因其縮短了精卵共孵育時間的同時，穿刺時間又較常規(guī)ICSI周期晚，此時卵母細(xì)胞不僅更成熟，且汲取了更多養(yǎng)分并適時脫離了不利因素，從而更利于受精成功。精卵共孵育4-6小時通過觀察2PB判斷受精是R-ICSI的第一步，找到行補(bǔ)救ICSI的最佳時機(jī)是其第二步的關(guān)鍵，既能讓卵子仍處于最佳的受精窗口期又使得到的胚胎與子宮內(nèi)膜可以實(shí)現(xiàn)同步化。因此，有學(xué)者對補(bǔ)救ICSI時的受精時間進(jìn)行分組(<6h、6-8h和>8h)，發(fā)現(xiàn)臨床轉(zhuǎn)歸與補(bǔ)救時間呈負(fù)相關(guān)[28]，補(bǔ)救時間越早臨床結(jié)局越好。隨后，林碎玲等[29]又將補(bǔ)救時間間隔分為(4-5 h、5.1-6 和6.1-8 h )，同樣發(fā)現(xiàn)補(bǔ)救時間越早胚胎質(zhì)量及妊娠結(jié)局越好。綜上所述，結(jié)合2PB的排出時間，受精4-6h后拆顆粒對受精失敗的卵母細(xì)胞立即行補(bǔ)救ICSI仍是目前大多數(shù)生殖中心較好的選擇。

3.4 R-ICSI 的條件

目前，有些輔助生殖機(jī)構(gòu)對受精率低于50%的未受精卵子行R-ICSI[27]，但有學(xué)者稱在受精能力較好時，卵丘細(xì)胞的早期脫去和補(bǔ)救ICSI將顯著增加多原核率[30]。因此，有研究者將受精率<50%行R-ICSI處理的周期分成三組（0%、<25%、>25%)，其受精率分別為74.66%、68.35%和65.46%，多倍體率分別為8.55%、11.33%和14.47%，且第2組可移植胚胎率為38.33%，高于其他兩組，發(fā)現(xiàn)對受精率<25%的組行補(bǔ)救ICSI可明顯提高受精率及優(yōu)胚率，對受精率>25%組行補(bǔ)救ICSI風(fēng)險高臨床回報低[31]。

3.5 R-ICSI 的安全性

R-ICSI廣泛應(yīng)用的同時，有學(xué)者對其安全性表示了擔(dān)憂，譚艷等[32]的Meta分析結(jié)果顯示R-ICSI與常規(guī)IVF及常規(guī)ICSI相比，新生兒的各項(xiàng)出生結(jié)局并無統(tǒng)計學(xué)差異，也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)R-ICSI與常規(guī)IVF和ICSI相比，在保證分娩健康兒童之外其臨床妊娠率也相似[33]。綜上所述，對存在FF高風(fēng)險的周期，采用R-ICSI受精將是安全、經(jīng)濟(jì)及有效的。但由于研究對象的時間限制，其長遠(yuǎn)影響仍需繼續(xù)研究。

4 小結(jié)與展望

IVF中影響FF的高危因素是眾多的，如精子參數(shù)異常，尤其是邊緣性合格精液及原發(fā)性不孕等。眾所周知，大多數(shù)FF與男性因素密切相關(guān)，為防止FF高危者發(fā)生FF，尤其是合并精液參數(shù)異常者，R-ICSI應(yīng)為目前最佳的受精方式，即精卵共孵育4-6 h，通過觀察2PB的排出情況判斷是否受精，當(dāng)受精率<25%時立即行補(bǔ)救ICSI。當(dāng)然找到觀察2PB（或其他受精指標(biāo)）與補(bǔ)救ICSI時機(jī)的最佳平衡點(diǎn)及最佳的補(bǔ)救條件，將使患者得到更好的臨床結(jié)局。目前國內(nèi)外對FF高危因素及后續(xù)處理的研究多為回顧性研究且樣本量有限，而回顧性研究本身具有一定的局限性，不能控制研究對象的分布，如年齡這類明顯影響受精及胚胎發(fā)育的干擾因素，故存在一定的偏倚，需結(jié)合受精生物學(xué)理論和臨床實(shí)踐。因此，大樣本、設(shè)計精良、具有所有最新技術(shù)優(yōu)勢的前瞻性隨機(jī)對照試驗(yàn)研究亟須完善。