神經(jīng)病靶酯酶的表達調(diào)控和生物功能

方哲彥，滕茶香，陳加祥

(南昌大學(xué)生殖毒理與藥理重點實驗室，南昌 330006)

神經(jīng)病靶酯酶(neuropathy target esterase，NTE)作為新型蛋白家族的成員之一，廣泛存在于從細菌到人類等多個生物體中，并且在哺乳動物體內(nèi)的多個組織器官中均有表達。NTE包含一個N-末端調(diào)節(jié)域和一個C-末端催化域。調(diào)節(jié)域具有和環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)及其下游分子相似的序列，因此NTE可能受cAMP/PKA/CREB通路的調(diào)節(jié)[1]。而催化域包含一個patatin結(jié)構(gòu)域，可以水解細胞膜中的重要成分磷脂酰膽堿(phosphatidylcholine，PC)并參與膜相關(guān)的細胞活動，維持脂質(zhì)的穩(wěn)態(tài)。NTE最初被發(fā)現(xiàn)是作為有機磷化合物的主要靶位，有機磷毒物可以對NTE產(chǎn)生“老化”作用，造成外周神經(jīng)和脊髓長軸突的變性引發(fā)遲發(fā)性神經(jīng)病(organophosphate induced delayed polyneuropathy，OPIDP)[2]。以往對于NTE的研究更多地關(guān)注于它作為一種絲氨酸酯酶的催化功能，而近幾年的研究則開始探索cAMP結(jié)合位點以及可能調(diào)控NTE表達的聯(lián)系分子[3-4]。當(dāng)前科研人員正在變性NTE導(dǎo)致軸突衰退以及基因敲除對于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的影響機制中進行深入研究[5]。

1 NTE的發(fā)現(xiàn)過程

1968年，JOHNSON[2]在有機磷引發(fā)的遲發(fā)性神經(jīng)毒性(OPIDP)的初始發(fā)病過程中發(fā)現(xiàn)了一種主要靶蛋白NTE，并且指出NTE的存在是OPIDP起病不可或缺的一部分。JOHNSON[2]將雞腦勻漿同放射性32P標(biāo)記的丙氟磷(DFP)在恒溫下孵育，發(fā)現(xiàn)雞腦中許多蛋白質(zhì)發(fā)生了磷?；?。而預(yù)先將神經(jīng)毒性抑制劑即可誘發(fā)OPIDP的神經(jīng)毒性有機磷化合物同雞腦勻漿孵育，雞腦蛋白的放射性32P標(biāo)記量顯著下降，磷?；黠@受抑制，但是非神經(jīng)毒性的抑制劑卻幾乎起不到抑制作用。進一步的實驗證實磷酰化受到抑制的原因是存在著一種可水解聚對苯二酰對苯二胺(polyphosphoricacid，PPA)的酯酶在發(fā)揮作用，這種酯酶被命名為NTE。NTE的發(fā)現(xiàn)是OPIDP發(fā)病機制研究的一次重大突破，它在有機磷化合物誘發(fā)OPIDP的過程中發(fā)揮著起始靶點作用。

2 NTE的結(jié)構(gòu)及分子特性

2.1 NTE是新蛋白家族中的一員

NTE是表達于從細菌到人類等各種生物體的新蛋白家族中的一員,它的主要序列與乙酰膽堿酯酶家族中的蛋白質(zhì)或者任何已知的絲氨酸水解酶相關(guān)性較低。這個新蛋白家族中大部分的蛋白質(zhì)受基因組序列測定為概念上的多肽，全部都包含有幾個潛在的跨膜片段[6]。NTE靠近C-末端大約有200個氨基酸的區(qū)域是高度保守的，而NTE的絲氨酸活性部位恰恰位于這200個氨基酸區(qū)域中。在這個保守區(qū)域中，組氨酸、酸性殘基連同絲氨酸殘基很有可能構(gòu)成一個催化三元組，參與共同形式的催化反應(yīng)。此外，PNPLA6基因編碼NTE，人和禽PNPLA6基因具有高度同源性(80%)，這表明了生物體在進化過程中保留了主要的該酶功能[7]。

2.2 NTE作為絲氨酸酯酶的反應(yīng)特性

NTE作為一種絲氨酸酯酶，通過普遍的絲氨酸酯酶機理與羧酸酯底物反應(yīng)。酶活性位點上特定反應(yīng)性絲氨酸殘基的羥基形成了作用于底物羰基的親核攻擊，這導(dǎo)致了共價?；钢虚g物即?；傅男纬梢约暗孜镆掖疾糠值姆蛛x。而此后?；直凰牧u基親核取代，解放自由酶完成催化循環(huán)[6]。而有機磷酸酯類化合物的反應(yīng)則有所不同。有機磷酸酯類化合物作為底物能夠以相似的方式在NTE的催化下釋放X基團形成共價酶中間物即磷酸化酶，然而同?；赶啾?，磷酸化酶的水解速度呈數(shù)量級顯著下降。盡管試劑的親核性優(yōu)于水，但是磷酸化酶實際上長期受到抑制。在有機磷酸酯的作用下，磷酸化的酶隨后能夠經(jīng)歷稱為“老化”的二次反應(yīng)，導(dǎo)致其丟失了一個被束縛的R基團，而剩下的活性絲氨酸部位則共價結(jié)合于帶負電荷的有機磷酸酯部分，能夠顯著耐受親核攻擊免受移除，因此自由酶的釋放速度緩慢，NTE將長期地以老化磷酸化的形式存在[6]。磷酸化酶的老化速度取決于R基團的性質(zhì)，一般最慢的是甲基[8]。

3 NTE上游細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及表達調(diào)控

3.1 cAMP/PKA/CREB信號通路對NTE的表達調(diào)控

cAMP作為一種第二信使，在真核細胞內(nèi)扮演著細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的角色，在不同的刺激下控制著生長、增殖、分化和凋亡等細胞生命活動。而NTE氨基末端結(jié)構(gòu)域的序列與蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)的調(diào)節(jié)亞基相似，這暗示了NTE的活性可能受到cAMP/PKA的調(diào)控。NTE氨基末端的調(diào)節(jié)域包含了三種公認的cAMP結(jié)合位點，并能夠調(diào)節(jié)下游分子[1]。

CHEN等[3]對細胞給予高濃度的cAMP激動劑以及抑制劑，檢測到cAMP水平的變化對于外源性NTE的活性以及表達無影響。然而，海拉細胞中內(nèi)源性NTE的活性受到cAMP激動劑的影響顯著增強，受到cAMP抑制劑的影響則顯著減弱。環(huán)己酰亞胺能夠抑制mRNA翻譯從而抑制蛋白質(zhì)的合成，在應(yīng)用cAMP激動劑的基礎(chǔ)上應(yīng)用環(huán)己酰亞胺后，NTE的活性不再增強，由此證明cAMP上調(diào)所導(dǎo)致的NTE活性增高是NTE表達增多引起的。cAMP對于NTE的調(diào)節(jié)在細胞周期的不同階段也存在著差異。在細胞周期中，分裂是細胞實現(xiàn)增殖的重要生命活動，在所有分裂的細胞中，細胞膜成分包括卵磷脂(PC)在有絲分裂結(jié)束之前需要成倍數(shù)的增加從而為分裂的細胞提供原料。而NTE在維持細胞膜脂質(zhì)的穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著重要的作用，其中PC就是NTE催化功能的主要底物，因此NTE水平在分裂期可能受到廣泛上調(diào)。此外cAMP在酵母細胞周期中發(fā)揮著重要的控制作用，它的水平能夠隨著細胞周期的進展而波動。因此酵母細胞中cAMP對于NTE活性的直接調(diào)節(jié)作用可能存在于細胞周期的進程中。

cAMP可以調(diào)節(jié)NTE的表達，而蛋白激酶A(PKA)是cAMP的下游分子，NTE氨基末端調(diào)節(jié)域的序列又與PKA的調(diào)節(jié)亞基相似，這些均為NTE水平及活性受到PKA的調(diào)節(jié)提供了依據(jù)。CHEN等[3]又發(fā)現(xiàn)NTE蛋白和mRNA水平在PKA抑制劑的影響下顯著下降，并且在此基礎(chǔ)上應(yīng)用cAMP激動劑，發(fā)現(xiàn)其既不能完全阻斷也不能抑制它們的下降，這暗示了受cAMP調(diào)控的PKA在控制NTE的表達中是十分必要的。以上這些結(jié)果暗示了細胞中NTE水平受cAMP/PKA信號通路而上調(diào)。

環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP-response element binding protein,CREB)是一種亮氨酸封閉鏈?zhǔn)睫D(zhuǎn)錄因子，可以通過結(jié)合目標(biāo)基因啟動子中的CRE序列調(diào)節(jié)幾種基因的表達。除此之外，它還能夠被激素、生長因子、細胞因子等生物活性物質(zhì)所激動，參與調(diào)節(jié)多種細胞活動，包括細胞增殖，生存和應(yīng)激反應(yīng)等。同時CREB又是cAMP/PKA通路的常見靶點，PKA能夠在Ser133位點使CREB磷酸化，這種翻譯后處理對于它的轉(zhuǎn)錄活性起著至關(guān)重要的作用。而在近期的研究[4]中，cAMP激動劑毛猴素和PKA抑制劑H89能夠以不通過敲除NTE的方式分別促進和抑制海拉細胞中NTE的表達。而在CREB基因敲除的基礎(chǔ)上，毛猴素和H89對于NTE的表達均沒有干擾，表明了CREB在通過cAMP/PKA/CREB信號通路調(diào)節(jié)NTE中是必要的。此外CREB基因的敲除能夠使NTE基因啟動子的熒光素酶活性下降大約50%而不是接近100%，由此證明除CREB之外，其他的轉(zhuǎn)錄因子也有可能作用于NTE啟動子調(diào)控NTE的表達。

另外有研究[9]證實一種能夠引發(fā)OPIDP的有機磷化合物，在8 h和10 d的實驗處理下，能夠造成母雞腦細胞核中PKA和磷酸化CREB水平的下降。這暗示了PKA和磷酸化CREB可能在OPIDP的誘發(fā)、演變和發(fā)展中扮演著至關(guān)重要的角色。

3.2 cAMP/PKA/CREB信號通路以外的NTE調(diào)控

cAMP/PKA/CREB已被初步證實在NTE的表達中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，造成NTE的表達和活性的改變。然而一種產(chǎn)物的表達可能受到多條通路的調(diào)控，NTE也不例外。CHEN等[10]應(yīng)用免疫共沉淀技術(shù)發(fā)現(xiàn)G蛋白β2亞型可直接聯(lián)系NTE分子，通過RNA干擾誘發(fā)的Gβ2基因的沉默可以導(dǎo)致NTE活性的下調(diào)，但是NTE的表達并不受到影響。這暗示了Gβ2蛋白可能在維持NTE活性中發(fā)揮著重要的作用，但是其機制還有待更進一步的研究。CHEN等[11]還發(fā)現(xiàn)PKC能夠下調(diào)NTE的活性。通過應(yīng)用NTE特異性抗體進行蛋白印記分析顯示NTE蛋白的水平受到PKC激動劑丙二醇甲醚醋酸酯(PMA)的作用而下調(diào)，并且應(yīng)用RT-PCR證實這是由NTE mRNA水平的下調(diào)引起的，由此證實PKC可以抑制NTE的轉(zhuǎn)錄及翻譯活動。

NTE可通過泛素-蛋白酶體和自噬-溶酶體這兩條途徑降解。LONG等[12]發(fā)現(xiàn)雄激素受體相關(guān)蛋白54(androgen receptor-associated protein 54，ARA54)可以作為泛素連接酶調(diào)節(jié)NTE的泛素-蛋白酶體降解。ARA54的過表達可下調(diào)NTE的蛋白質(zhì)水平，而ARA54基因的敲除則可抑制NTE的降解，ARA54中的環(huán)指(RING)結(jié)構(gòu)域中的突變也可阻斷ARA54對NTE的降解。此外D盒(Destruction Box)還被證實是蛋白酶體降解NTE和NTE相關(guān)酯酶(NRE，NTE-related esterase)所必需的序列[13]，那么位于D盒的基因突變將極有可能導(dǎo)致NTE的調(diào)控失常。

4 NTE功能和調(diào)控及功能障礙誘發(fā)的疾病

4.1 NTE在細胞生命活動中的功能

有研究[14]表明NTE的生理底物可能是一個連接細胞膜的中間代謝物，具有相當(dāng)長的羧酸鏈。而卵磷脂(PC)是真核細胞細胞膜的主要脂質(zhì)成分，維持PC合成與轉(zhuǎn)化的穩(wěn)態(tài)在細胞分裂以及細胞膜的新生過程中是十分必要的。NTE作為一種磷脂酶則能夠催化哺乳動物細胞中磷脂酰膽堿(PC)向甘油磷膽酰(glycerophosphocholine,GPC)的轉(zhuǎn)化。因此細胞中NTE的主要生理底物可能就是PC，NTE的存在可以影響PC的代謝，從而能夠維持細胞膜脂質(zhì)的穩(wěn)態(tài)。此外NTE還可能維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum，ER)磷脂的穩(wěn)態(tài)，ER磷脂穩(wěn)態(tài)的破壞有助于引發(fā)有機磷酸鹽誘導(dǎo)的延遲神經(jīng)毒性。

有研究[14]發(fā)現(xiàn)NTE的水平和活性隨著細胞周期的進展而被調(diào)控，其在G1期上調(diào)至最高在G2/M期下調(diào)至最低。由于NTE具有維持細胞膜脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)的功能，此調(diào)節(jié)可能與分裂時細胞膜的變化相關(guān)聯(lián)，因此NTE水平的大幅度波動極有可能影響細胞的正常分裂。實驗證實NTE基因敲除可以顯著下調(diào)NTE基因的表達并且減少甘油磷膽酰(GPC)的水平，但是NTE的抑制并沒有影響卵磷脂(PC)的水平，細胞周期的進程也沒有受到影響。這暗示了NTE作為一種細胞周期關(guān)聯(lián)蛋白，其數(shù)量確實會隨著細胞周期的進程而發(fā)生變化，但它本身并不能對細胞周期和細胞增殖產(chǎn)生至關(guān)重要的影響。

此外，NTE還在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育階段調(diào)控神經(jīng)元和附屬神經(jīng)膠質(zhì)細胞的相互作用，參與神經(jīng)膠質(zhì)細胞之間的信號傳導(dǎo)途徑，影響神經(jīng)元發(fā)育，最近有關(guān)NTE抑制導(dǎo)致斑馬魚運動神經(jīng)元缺陷的實驗就支持了NTE參與維護神經(jīng)系統(tǒng)完整性的理論[15]。另外有研究[5]顯示PNPLA6基因沉默的人類胚胎癌干細胞(NT2)在分化的初始過程中神經(jīng)元分化數(shù)量減少87%，神經(jīng)突的數(shù)量減少55%，神經(jīng)分叉點的數(shù)量減少67%，電活動也發(fā)生了變化，每分鐘尖峰數(shù)與其振幅分別減少了79%和44%。由此證實NTE在神經(jīng)元分化的早期起著關(guān)鍵作用，但是對分化后期無顯著影響。

然而用神經(jīng)毒性有機磷酸酯丙胺氟(mipafox)作用于NTE只顯著改變長非編碼RNA的表達，而不影響分化神經(jīng)元的數(shù)量、神經(jīng)突長度、分支點的數(shù)量以及神經(jīng)膠質(zhì)和突觸標(biāo)志物的表達，這表明PNPLA6或NTE在神經(jīng)分化中的作用并不依賴于酯酶中心，因為有機磷酸酯類化合物對NTE的抑制作用已被證實是對酶的催化中心造成“老化”抑制作用[16]。

有研究[17]還發(fā)現(xiàn)在成年小鼠的坐骨神經(jīng)中施萬細胞可表達NTE，且在非髓鞘施萬細胞中表達最突出，NTE/PNPLA6可參與神經(jīng)元損傷后發(fā)育過程中的非髓鞘施萬細胞的發(fā)育以及神經(jīng)元髓鞘再生。神經(jīng)病靶酯酶在果蠅體內(nèi)被稱為瑞士奶酪蛋白(drosophila swiss cheese,SWS)，是一種進化保守蛋白質(zhì)，相當(dāng)于NTE，果蠅膠質(zhì)細胞SWS基因的敲除的確能夠誘導(dǎo)神經(jīng)元變化和嚴(yán)重的運動缺陷，但由于果蠅不合成髓鞘，因此膠質(zhì)細胞變化對神經(jīng)元完整性和功能的影響可能不僅僅局限于髓鞘的形成和再生[18]。

4.2 NTE催化功能的調(diào)控

cAMP能夠通過依賴于PKA的NTE水平上調(diào)導(dǎo)致PC去?；騁PC轉(zhuǎn)化。然而，無論是在cAMP激動劑還是抑制劑的作用下，PC水平均沒有顯著變化而是維持在一個比較穩(wěn)定的區(qū)間，這暗示了細胞中存在除了NTE以外的磷脂酶來維持細胞內(nèi)PC的穩(wěn)態(tài)。

酵母細胞質(zhì)磷脂結(jié)合蛋白Sec14p能夠與卵磷脂形成復(fù)合物，這種復(fù)合物可以抑制PC合成的中間限速步驟即CDP-choline的產(chǎn)生。實驗中敲除了NTE基因的酵母細胞由于NTE催化功能受限導(dǎo)致GPC的產(chǎn)生受到抑制，然而在細胞中并沒有發(fā)現(xiàn)大量的PC堆積，因為它的產(chǎn)生受到CDP-choline合成限速步驟以及choline吸收減少的干擾[19]，由此證實PC合成的抑制是有可能是通過Sec14p-PC復(fù)合物的活動所介導(dǎo)的。最近又有研究[20]顯示Sec14p能夠聯(lián)系一種膜磷脂酶Nte1p(Nte1p就是酵母中的NTE)以此增加PC去酰基化向GPC轉(zhuǎn)變的速率。這些證據(jù)都表明了NTE水平雖然可以受cAMP水平的調(diào)控并顯著影響PC向GPC轉(zhuǎn)化的生化過程，但酵母細胞內(nèi)PC穩(wěn)態(tài)的維持還受到其他生理機制的調(diào)控。

4.3 NTE功能障礙誘發(fā)的疾病

OPIDP首次引起公眾的注意早在1930年，在美國的南部有上千人因中毒性傳染病而癱瘓。OPIDP的患者有四肢麻木，皮膚感覺異常的臨床表現(xiàn)，并逐漸發(fā)展為運動性神經(jīng)病，重者可出現(xiàn)遠端肌肉萎縮。一種有機磷化合物磷酸三鄰甲苯酯被認為是引起這種疾病的主要毒物之一。此后的動物模型體內(nèi)實驗均發(fā)現(xiàn)誘發(fā)OPIDP的有機磷化合物可以有效抑制NTE的活性。然而并不是滿足NTE抑制達到臨界值這一個條件就能引發(fā)OPIDP,事實上OPIDP的發(fā)生受到多種因素的影響。有機磷化合物可作為NTE這種絲氨酸酯酶的底物類似物與NTE發(fā)生被稱之為“老化反應(yīng)”的共價結(jié)合，結(jié)合生成的中間物可耐受親核攻擊，水解極度緩慢，引起NTE原本的活性顯著下降[21]。

許多學(xué)者[22]認為NTE被抑制后發(fā)生的老化機制才是誘導(dǎo)OPIDP產(chǎn)生的必要步驟。老化反應(yīng)是指通過一個快速的兩步反應(yīng),使得引起遲發(fā)性神經(jīng)病的有機磷酸酯類(organophosphates，OPs)與NTE共價結(jié)合,這種變化不僅抑制酶的活性,而且導(dǎo)致R基團的丟失，使得活性部位絲氨酸帶負電荷，穩(wěn)定性增強，自由酶將難以釋放。發(fā)生老化后的NTE不存在“自我復(fù)活”機制，即變性的NTE難以恢復(fù)活性。而老化反應(yīng)是否發(fā)生則取決于被抑制的磷酸化酯酶的分子結(jié)構(gòu)[22]。NTE的老化可看作是一種外源生物活性物質(zhì)對NTE蛋白質(zhì)進行了轉(zhuǎn)錄后修飾,從而抑制NTE的活性，這個過程是不可逆的。OPs修飾的NTE以某種方式造成了“軸突的化學(xué)橫斷面”，引起軸突變性，繼而導(dǎo)致OPIDP，其分子生物學(xué)具體機制還未闡明。

許多研究[23]證明NTE基因敲除所導(dǎo)致的NTE水平的下調(diào)與運動神經(jīng)性疾病無關(guān)，而僅僅表現(xiàn)為神經(jīng)系統(tǒng)功能的衰退，從而支持了NTE活性減弱在神經(jīng)衰退疾病中發(fā)揮作用的功能下降理論。然而，此結(jié)果并不能證明老化假說就是錯誤的，因為NTE基因敲除和有機磷化合物誘發(fā)的毒性作用發(fā)病機制有所不同，他們的結(jié)果并不相悖。NTE基因敲除僅僅表現(xiàn)為NTE表達下調(diào)活性減弱，而有機磷的老化反應(yīng)致使NTE發(fā)生了變性和活性下降。除了OPIDP,最近有研究證實NTE突變還與Boucher-Neuhauser和Gordon-Holmes綜合征有關(guān)，這些綜合征包括性腺機能減退、小腦萎縮、共濟失調(diào)和認知障礙等[23]。此外，NTE突變可導(dǎo)致Oliver-McFarlane和Laurence-Moon綜合征，其特征為視網(wǎng)膜變性伴脈絡(luò)膜萎縮，而Laurence-Moon綜合征還包括進行性脊髓小腦性共濟失調(diào)和痙攣性截癱[24-25]。NTE還可以在哺乳動物體內(nèi)的多個組織器官中有所表達，例如胎盤、骨骼肌、腎、腸、淋巴結(jié)、腦等，其中在腦中含量被公認為是最多的[26]，那么NTE的變性和活性下降將對它們產(chǎn)生損害，但其具體機制有可能不相同。比如最近有研究[27]證實NTE水平的降低可以通過Erk1/2和AKT信號通路下調(diào)MMP-9(Matrix metalloproteinase-9)而損害滋養(yǎng)細胞浸潤，從而促進先兆子癇的進展。

5 展望

NTE作為OPIDP發(fā)病初始過程中的主要靶位發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，然而具體的發(fā)病機理仍然不明確，“老化”和軸突變性理論沒有被廣泛認可，因此未來有關(guān)變性NTE與軸突衰退的關(guān)聯(lián)仍需進一步研究，同時PNPLA基因敲除或基因沉默所導(dǎo)致的NTE活性下降對于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的影響機制也有待深入研究。近年來關(guān)于NTE水平調(diào)節(jié)的通路及分子是研究的熱門，cAMP/PKA/CREB通路已經(jīng)被證實能夠上調(diào)NTE，其他通路和調(diào)節(jié)分子還有待被發(fā)現(xiàn)。NTE作為絲氨酸酯酶發(fā)揮著重要的催化功能，能作為磷脂酶和溶血磷脂酶發(fā)揮功效，維持細胞膜的穩(wěn)定性。由于NTE具有催化羧酸酯類和有機磷酸酯類化合物等功能，因此它可能對葡萄糖和胰島素具有潛在的調(diào)節(jié)作用。鑒于NTE的遺傳和化學(xué)損傷與軸突變性之間的關(guān)聯(lián)，若NTE能受到胰島素和葡萄糖調(diào)節(jié)，那么探討NTE是否與糖尿病性神經(jīng)病的發(fā)病有關(guān)聯(lián)將具有重要的臨床意義[28]。此外，NTE不僅存在于腦內(nèi)，還分布于其他組織例如胎盤、骨骼肌、腎臟等，因此其他疾病的發(fā)生是否與NTE變性有關(guān)聯(lián)還有待進一步探索。