CircRNAs在肝細(xì)胞癌（HCC）中的研究進(jìn)展

賓庚偉，黎軍宏，馬燕渝，茍堯

（1.廣西貴港市平南縣丹竹鎮(zhèn)赤馬衛(wèi)生院宿舍，廣西 貴港；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧；3.廣西國(guó)際壯醫(yī)院，廣西）

0 引言

肝細(xì)胞癌（HCC）是原發(fā)性肝癌最常見(jiàn)的類型[1,2]，占原發(fā)性肝癌的90%，在我國(guó)所有惡性腫瘤發(fā)病率中位列第4，病死率居第2位[3]。據(jù)估計(jì)，中國(guó)的HCC患者每年占全球所有HCC病例的50%以上[4]。由于其發(fā)病機(jī)制尚未明確，目前甲胎蛋白（AFP）是其臨床診斷和預(yù)后的主要標(biāo)志物，此外，α-L-巖藻糖苷酶、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子等亦用于HCC的診斷，但因其診斷的特異度及敏感度低，臨床對(duì)HCC的早期診斷和治療仍處于滯后階段，導(dǎo)致HCC患者預(yù)后差，復(fù)發(fā)率高[5]。臨床若實(shí)現(xiàn)對(duì)HCC患者的早期診斷，則可以在預(yù)期壽命方面取得顯著優(yōu)勢(shì)。盡管如此，大多數(shù)HCC患者通常在可以應(yīng)用任何治愈性治療之前被診斷處于具有轉(zhuǎn)移的晚期階段，且目前尚無(wú)有效的預(yù)防HCC的策略。因此，早期診斷HCC尤為關(guān)鍵。因此，迫切需要探索HCC腫瘤發(fā)生的分子機(jī)制，并確定有價(jià)值的HCC診斷生物標(biāo)志物和治療靶標(biāo)。

1 環(huán)狀RNA(circular RNAs，circ RNAs) 概述

CircRNAs屬于新型內(nèi)源性非編碼RNA（noncoding RNAs，nc RNAs），于20世紀(jì)70年代由Sanger等[6]在一些植物的類病毒中首次發(fā)現(xiàn)，并于1979年由Hsu等人[7]首次通過(guò)電子顯微鏡發(fā)現(xiàn)一些真核生物細(xì)胞質(zhì)中亦存在共價(jià)連接的circ RNAs。然而，CircRNAs曾被認(rèn)為是前體RNA剪接過(guò)程中發(fā)生的錯(cuò)誤，期間一度被研究者忽視。隨著新一代測(cè)序（NGS），特別是高通量RNA測(cè)序 （RNA-sequencing，RNA-seq） 的深入研究，CircRNAs多種生物學(xué)功能逐漸被發(fā)現(xiàn)，成為細(xì)胞基因表達(dá)的一種方式[8]，存在于真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄中，通過(guò)反向剪接形成環(huán)狀轉(zhuǎn)錄物，以組織特異性和細(xì)胞特異性方式表達(dá)，其具有連續(xù)的共價(jià)閉合性，沒(méi)有自由端的回路，因此，CircRNAs比線性RNA更穩(wěn)定[9,12]。研究發(fā)現(xiàn)，CircRNAs在某些類型的病理反應(yīng)以及各種人類惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用，與各種固體和血液惡性腫瘤相關(guān)聯(lián)，據(jù)已有文獻(xiàn)報(bào)道，癌癥相關(guān)CircRNAs參與消化系統(tǒng)惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展[13,14]，并且被證明是消化系統(tǒng)癌癥的潛在診斷生物標(biāo)志物[15]。CircRNAs的發(fā)現(xiàn)，為肝細(xì)胞癌的早期診斷和治療提供新思路。

CircRNAs主要分為三類：外顯子 CircRNAs（eCircRNAs），外顯子-內(nèi)含子CircRNAs（EIciRNA）和環(huán)狀內(nèi)含子RNA（CircRNAs）[16]，三種類型的CircRNAs由不同的環(huán)化機(jī)制產(chǎn)生。CircRNAs是高等真核生物中豐富的非編碼RNA類，與經(jīng)典線性剪接RNA不同，CircRNAs通過(guò)5’位剪接供體與3’位剪接受體形成[17,18]，以共價(jià)鍵形成閉合的環(huán)形結(jié)構(gòu)，具有穩(wěn)定性，核糖核酸酶R （RNase R）難以降解[19]。CircRNAs在組織和發(fā)育階段具有特異性，在表達(dá)方式上，具有普遍性、保守性等特征[20]。然而，新鑒定的環(huán)狀RNA的表達(dá)譜和功能，具體的生物活性仍需進(jìn)一步研究。近年來(lái)，CircRNAs在腫瘤治療中發(fā)揮重要作用，其在胃癌、胰腺癌、結(jié)直腸癌等腫瘤中表達(dá)方式各異，可能與腫瘤轉(zhuǎn)移存在相關(guān)性，為CircRNAs成為臨床診斷腫瘤的生物學(xué)標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)提供依據(jù)，提示其在早期診斷、治療及預(yù)防等方面具有重要價(jià)值[21]。

2 CircRNAs功能

研究發(fā)現(xiàn)，CircRNAs含有miRNA反應(yīng)元件（MREs），可以競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miRNA[22]，并且CircRNAs可以作為競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源性RNA（ceRNAs）或miRNA海綿發(fā)揮作用，抑制miRNA功能。在細(xì)胞生理和病理過(guò)程中，天然內(nèi)源性環(huán)狀RNA具有抗外核溶解RNA衰變的作用，并含有選擇性保守的microRNA（microRNA）靶位點(diǎn)。因此，環(huán)狀RNA可以作為有效的microRNA海綿，與microRNA相互作用調(diào)節(jié)基因表達(dá)，在miRNA發(fā)揮海綿作用的相關(guān)研究中，主要以（CDR1as或ciRS-7）為主，ciRS-7含有超過(guò)70個(gè)保守的miR-7結(jié)合位點(diǎn)，從而影響miR-7附著于其靶mRNA的可用性，以解除miR-7對(duì)靶基因表達(dá)的抑制作用[23]。但越來(lái)越多的研究表明，CircRNAs的miRNA海綿功能在各種物種中是保守的，因此，需要更詳細(xì)的研究來(lái)闡明CircRNAs/miRNA相互作用對(duì)miRNA的表達(dá)和細(xì)胞定位的影響。

CircRNAs調(diào)節(jié)基因表達(dá)中具有重要功能，EIciRNA保留其親本基因的內(nèi)含子序列，因此能夠與轉(zhuǎn)錄機(jī)制相互作用。例如，circEIF3J和circPAIP2可以與宿主基因啟動(dòng)子區(qū)域中的U1小核核糖核蛋白（snRNP）和RNA Pol II相互作用，從而增強(qiáng)其親本基因，真核翻譯起始因子3J（EIF3J）和poly（A）的表達(dá)。結(jié)合蛋白相互作用蛋白2（PAIP2）[24]。CircRNAs主要積聚在細(xì)胞核中，能夠調(diào)節(jié)順式基因轉(zhuǎn)錄。Ci-ANKRD52，ci-MCM5和ci-SIRT7能夠與延長(zhǎng)的Pol II復(fù)合物相互作用[25]。結(jié)果證明CircRNAs可通過(guò)調(diào)節(jié)延長(zhǎng)的Pol II活性來(lái)促進(jìn)其親本基因的轉(zhuǎn)錄。CircRNAs在調(diào)節(jié)基因表達(dá)中起重要作用。

CircRNAs主要組成部分為外顯子，并且含有起始密碼子，為翻譯蛋白質(zhì)的重要條件，因此CircRNAs是否為轉(zhuǎn)錄本仍為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。其作用產(chǎn)生的機(jī)制為處于位點(diǎn)（IRES）的內(nèi)部核糖體被引入CircRNAs之際，CircRNAs即在體內(nèi)和體外進(jìn)行翻譯，指示CircRNAs編碼蛋白質(zhì)[26]，Circ-ZNF609含有一個(gè)753個(gè)核苷酸的開(kāi)放閱讀框（ORF），從起始密碼子到框內(nèi)終止密碼子，在環(huán)化時(shí)產(chǎn)生，并且它以剪接依賴性和不依賴帽的方式翻譯成蛋白質(zhì)，提供真核生物中編碼蛋白質(zhì)的CircRNAs的實(shí)例[27]。

上述研究表明，CircRNAs在各種生物過(guò)程中起重要作用。然而，CircRNAs的功能尚未明確，探索CircRNAs生物學(xué)功能尤為重要。CircRNAs可以作為分子海綿來(lái)隔離miRNA或蛋白質(zhì)，并且可以影響它們的細(xì)胞豐度和定位。

3 CircRNAs在與肝細(xì)胞癌（HCC）的相關(guān)性

HCC是消化系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，病死率仍較高[2]。目前，針對(duì)HCC的治療方法臨床主要以外科手術(shù)為主，其中包括化療，肝移植，手術(shù)切除，抗腫瘤藥物療法和放射治療。由于疾病早期沒(méi)有癥狀，大多數(shù)患者被診斷為疾病晚期，具有轉(zhuǎn)移和肝儲(chǔ)備不足，從而失去了根治性切除的機(jī)會(huì)。在過(guò)去的十年中，改良的藥物治療劑已大大延長(zhǎng)了患有晚期疾病的HCC患者的生存期。常用的治療方案包括索拉非尼，阿霉素（ADM），5-氟尿嘧啶（5-FU），含鉑抗癌藥物，喜樹(shù)堿和吉西他濱。然而，對(duì)這些藥物的多藥耐藥性（MDR）的獲得是臨床腫瘤學(xué)中的致命弱點(diǎn)，并且可能導(dǎo)致不良的預(yù)后。HCC患者5年復(fù)發(fā)率也高達(dá)70%[29]。因此，目前臨床對(duì)HCC的綜合治療效果尚不如人意，HCC患者的預(yù)后仍很差[28]。因此，研究HCC發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，尋找新的分子治療靶點(diǎn)，將有望為HCC患者尋求更有效的治療策略。

隨著研究不斷深入，證明CircRNAs表達(dá)的改變對(duì)肝癌的生物學(xué)特性具有廣泛的影響。CircRNAs在HCC中起癌基因或抑癌作用。許多CircRNAs參與肝細(xì)胞癌（HCC）的發(fā)生和發(fā)展[30]。CircRNAs在組織和器官生長(zhǎng)中發(fā)揮發(fā)育和調(diào)節(jié)的作用[31,32]，包括細(xì)胞凋亡[33,34]，細(xì)胞應(yīng)激[35,36]，細(xì)胞衰老[37]和炎癥反應(yīng)[38]。HCC中過(guò)表達(dá)has_circ_0078710可以通過(guò)海綿體miR-31上調(diào)HDAC和CDK2水平，同時(shí)介導(dǎo)細(xì)胞周期成分和陰性細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子p21的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞周期進(jìn)展，促進(jìn)細(xì)胞增殖，遷移，侵襲和腫瘤生長(zhǎng)[39]。薛莉等研究發(fā)現(xiàn)circ_001569可以直接吸收miR-411-5p和miR-432-5p，進(jìn)而調(diào)節(jié)circ_001569的部分致癌功能，證明circ_001569可以提示肝細(xì)胞癌預(yù)后不良，并促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[40]。王斌等人通過(guò)RT-PCR測(cè)定HCC組織和HCC細(xì)胞系中circRBM23和miR-138的表達(dá)水平，證實(shí)上調(diào)的circRBM23通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤抑制因子miR-138在HCC中起致癌基因的作用[41]。邱思等通過(guò)定量實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）研究了73對(duì)肝細(xì)胞癌（HCC）和相鄰非腫瘤組織中CircRNAs hsa_circ_0001445的表達(dá)水平，證明了hsa_circ_0001445可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡并抑制這些細(xì)胞的增殖，遷移和侵襲[42]。韓鼎等人將肝癌與鄰近正常組織比較，發(fā)現(xiàn)circc3p1的表達(dá)與TNM呈負(fù)相關(guān)，并通過(guò)CCK8和Transwell分析，證明circ3p1過(guò)度表達(dá)，顯著抑制了肝癌細(xì)胞，鑒定了CircRNAs circ3p1作為腫瘤抑制因子[43]。hsa_circ_0000673與HCC細(xì)胞中的miR-767-3p直接相關(guān)，通過(guò)抑制miR-767-3p，hsa_circ_0000673促進(jìn)HCC細(xì)胞增殖和侵襲和調(diào)節(jié)miR-767-3p/SET途徑促進(jìn)HCC惡性行為[44]。更有研究證明hsa_circ_0003570表達(dá)水平與HCC臨床病理學(xué)特征相關(guān)，環(huán)狀RNA（CircRNAs）中的Hsa_circ_0003570不僅首先在HCC細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)下調(diào)，而且在HCC組織中也被下調(diào)，因此，CircRNAs可能是HCC治療的有希望的新治療靶標(biāo)。周祖樺等通過(guò)RT-PCR在各種肝癌細(xì)胞系和人癌組織中定量分析circCDK13表達(dá)，證實(shí)了circSMARCA5的過(guò)表達(dá)導(dǎo)致抑制增殖，增加細(xì)胞凋亡和抑制侵襲。這些研究表明，CircRNAs可能是HCC治療的新治療靶標(biāo)。

4 結(jié)語(yǔ)與展望

HCC是最主要的惡性腫瘤之一，盡管最近幾年相繼進(jìn)行了新的先進(jìn)治療方法，但是HCC的存活率仍然很低。越來(lái)越多的證據(jù)表明，改變的CircRNAs表達(dá)可影響HCC的發(fā)生和發(fā)展，并且在HCC治療和預(yù)后方面顯示出巨大的潛力。CircRNAs充當(dāng)miRNA海綿，調(diào)節(jié)參與細(xì)胞周期，增殖，侵襲和轉(zhuǎn)移的基因、蛋白質(zhì)的表達(dá)。且CircRNAs具有高豐度和穩(wěn)定的優(yōu)勢(shì)，可作為HCC診斷生物標(biāo)記物，將有望成為HCC有效的治療靶標(biāo)。目前，CircRNAs在HCC的研究仍處于起步階段，CircRNAs可能通過(guò)不同的機(jī)制參與HCC的腫瘤發(fā)生，進(jìn)一步了解CircRNAs與HCC病因之間的關(guān)系將加速CircRNAs在HCC診斷和治療中的臨床應(yīng)用。對(duì)CircRNAs在HCC中的功能和機(jī)制的深入研究將豐富我們對(duì)參與肝癌發(fā)生的復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的了解。此外，進(jìn)一步了解CircRNAs與HCC病因之間的關(guān)系將加速CircRNAs在HCC診斷和治療中的臨床應(yīng)用。