結(jié)核病的分子診斷——進(jìn)展與挑戰(zhàn)

李俊明，徐煒

（1.南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗科；2.江西省醫(yī)療服務(wù)指導(dǎo)中心，江西 南昌 330006）

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis, Mtb） 感染導(dǎo)致的一種嚴(yán)重危害人類健康的感染性疾病。世界衛(wèi)生組織（WHO）最新的研究報告顯示，盡管結(jié)核病疫情已得到一定的遏制，全球每年仍有約1000 萬的新發(fā)病例, 約100-140萬人死于結(jié)核病。尤其值得警惕的是，結(jié)核病的耐藥形勢日益嚴(yán)峻。目前, 大約3.3%的新發(fā)病例和17.7%的經(jīng)治復(fù)發(fā)病例為耐多藥結(jié)核病（即同時對利福平和異煙肼耐藥）[1]，而研究顯示，相對于初治和非耐多藥的復(fù)治結(jié)核病患者83%的治愈率，耐多藥結(jié)核病和廣泛耐藥結(jié)核病治療的成功率顯著降低，分別為54%和30%[2]。

早期發(fā)現(xiàn)結(jié)核病患者并給予有效的治療是控制結(jié)核病疫情的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。目前，結(jié)核病的診斷主要基于臨床表現(xiàn)、影像學(xué)檢查和實驗室檢查。由于結(jié)核病,尤其是肺外結(jié)核的臨床表現(xiàn)和影像學(xué)特征均不是很典型,實驗室檢查在結(jié)核病的診斷中發(fā)揮重要作用。目前，結(jié)核病診斷和藥敏分析應(yīng)用最廣泛的方法仍然是細(xì)菌學(xué)方法,主要包括痰涂片抗酸染色和結(jié)核分枝桿菌培的培養(yǎng)。痰涂片抗酸染色的敏感性差,且無法區(qū)分結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌。培養(yǎng)法的敏感性較痰涂片抗酸染色有顯著提高，但耗時過長，一般需要3～4 周獲得陽性結(jié)果, 如果加上藥敏分析的時間通常需要6～8 周時間。細(xì)菌學(xué)檢查的這些不足極大地限制了結(jié)核病的及時診斷和藥敏分析。WHO 估計，目前全球每年約有300 萬的結(jié)核病患者因未獲得診斷而被遺漏[1]，而且，即使在獲得細(xì)菌學(xué)確診的結(jié)核病患者中也僅有三分之一進(jìn)行了藥敏分析檢測,大多數(shù)患者接受的是經(jīng)驗性的治療。因此，快速而準(zhǔn)確的結(jié)核病診斷新技術(shù)的開發(fā)和應(yīng)用對于結(jié)核病的診斷和治療,以及全球結(jié)核病疫情的防控均具有重要意義。

近年來,分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展給結(jié)核病的早期診斷和快速藥敏分析產(chǎn)生了巨大的推動作用,一系列新的分子診斷技術(shù)正在或即將進(jìn)入臨床應(yīng)用。目前，已有多種分子診斷平臺經(jīng)過了WHO的論證并獲得WHO 的推薦，另外還有多種新近發(fā)展的分子診斷平臺雖未獲得WHO 推薦但已經(jīng)獲批在臨床應(yīng)用,這些分子診斷技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用有望進(jìn)一步增強(qiáng)結(jié)核病的臨床診斷和藥敏分析能力，同時大大縮短檢測時間，促進(jìn)結(jié)核病的早期診斷和合理治療。

1 基于核酸擴(kuò)增試驗的結(jié)核病診斷及藥敏分析技術(shù)

基于核酸擴(kuò)增試驗 （nucleic acid amplification tests, NAATs) 的結(jié)核病診斷技術(shù)是指通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù) （polymerase chain reaction, PCR)對結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的特異性基因序列或耐藥相關(guān)基因進(jìn)行靶向擴(kuò)增和分析,借以對結(jié)核病進(jìn)行診斷和耐藥性分析的技術(shù)。NAATs 最主要的特點是具有很高的檢測敏感性，同時檢測速度快，是目前應(yīng)用最為廣泛的結(jié)核病分子診斷技術(shù)。

1.1 Xpert MTB/RIF 和 Xpert MTB/RIF Ultra 系 統(tǒng)Xpert MTB/RIF 檢測系統(tǒng)以Mtb 的rpoB 基因為靶標(biāo), 通過熒光定量PCR 技術(shù)進(jìn)行特異性擴(kuò)增后采用分子信標(biāo)技術(shù)對其中與利福平（rifampicin，RIF）耐藥相關(guān)的突變位點進(jìn)行檢測,從而同時實現(xiàn)對M tb 進(jìn)行檢測和對RIF 耐藥基因型進(jìn)行分析[3]。Xpert的主要特點是具有良好的檢測敏感性和特異性，同時具有操作簡便、檢測時間短和生物安全性好等優(yōu)點,也因此于 2010 年獲得了 WHO 的推薦[4]。大量的研究顯示，Xpert MTB/RIF 對結(jié)核病診斷的整體敏感性和特異性分別達(dá)85%和98%,對于痰涂片抗酸染色陰性標(biāo)本的檢測敏感性也可達(dá)到70%,同時其在RIF 耐藥性分析方面也具有優(yōu)秀的表現(xiàn)，敏感性和特異性分別達(dá)96%和98%[5-7]。然而也有研究顯示, 在結(jié)核病疫情低發(fā)的國家和地區(qū),Xpert MTB/RIF 檢測的敏感性并不理想[8]。

為了進(jìn)一步提高檢測的敏感性，美國 Cepheid公司推出了第二代Xpert 檢測系統(tǒng),即Xpert Ultra。Xpert Ultra 采用了更大的 DNA 擴(kuò)增倉和兩個額外的分子靶標(biāo)（IS6110 和 IS1081）來檢測 Mtb，同時將高分辨融解曲線分析技術(shù)應(yīng)用于RIF 耐藥基因型的檢測, 從而進(jìn)一步提高了其檢測的敏感性,使其最低檢測限達(dá)到16CFU/mL, 同時保留了對rpoB 基因突變檢測的高敏感性和高特異性[9,10]。研究結(jié)果顯示，Xpert Ultra 檢測Mtb 的整體檢測敏感性可達(dá)88%, 同時顯著地提高了對于兒童結(jié)核和HIV 感染者合并結(jié)核病的檢測敏感性。因此，WHO在2017 年推薦將Xpert Ultra 系統(tǒng)用于成人和兒童結(jié)核病的首診檢測,包括HIV 感染合并結(jié)核病的診斷[11]。然而，檢測敏感性的提高在一定程度上降低了Xpert Ultra 檢測的特異性。雖然從整體上來看由此導(dǎo)致的特異性下降并不是很明顯 （從98%下降至96%）,但研究證實其對HIV 合并Mtb 感染的患者和結(jié)核病復(fù)發(fā)患者等特定群體的檢測性能有較明顯的影響,可顯著降低其檢測的特異性和陽性預(yù)測值[12]。

目前 Xpert MTB/RIF 和 Xpert MTB/RIF Ultra系統(tǒng)已在全球數(shù)十個國家獲得了較廣泛的應(yīng)用,在結(jié)核病的診斷和耐藥性分析方面發(fā)揮了非常積極的作用。然而，Xpert 檢測系統(tǒng)的應(yīng)用也存在一些不足, 除了因檢測敏感性問題導(dǎo)致部分漏診外,在RIF 耐藥性分析方面也存在一定程度的假陽性和假陰性結(jié)果, 如可能出現(xiàn)因rpoB 基因無義突變造成RIF 假性耐藥的結(jié)果[13],也可能因Mtb 存在rpoB熱點突變區(qū)域以外的RIF 耐藥相關(guān)基因突變而導(dǎo)致假性RIF 敏感的結(jié)果[14]。此外,由于大多數(shù)對RIF耐藥的Mtb 會同時對異煙肼（isoniazid，INH）耐藥，因此很多研究者利用Xpert 進(jìn)行耐多藥結(jié)核病的檢測或推測。然而，有研究顯示有約40%對RIF 耐藥的患者對INH 是敏感的[15]，在對RIF 敏感的患者中也有約27%的患者對其它一線抗結(jié)核藥是耐藥的[16]。因此，在采用Xpert 系統(tǒng)進(jìn)行結(jié)核病診斷和耐藥性分析時應(yīng)注意其應(yīng)用的范圍。

1.2 基于等溫擴(kuò)增技術(shù)的結(jié)核病診斷技術(shù) 等溫擴(kuò)增技術(shù)是一類在恒溫條件下進(jìn)行核酸擴(kuò)增的技術(shù)，根據(jù)引物設(shè)計方法、采用的聚合酶和解鏈條件的不同又可分分環(huán)介導(dǎo)的等溫擴(kuò)增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技術(shù)、交叉引物擴(kuò)增（crossing priming amplification，CPA）技術(shù)和核酸序列依賴性擴(kuò)增（nucleic acid sequence-based amplification，NASBA）技術(shù)等。與常規(guī) PCR 比較，恒溫擴(kuò)增具有操作簡單、擴(kuò)增效率高、報告時間短和經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點，同時由于不需要經(jīng)歷不同的溫度循環(huán)，無需復(fù)雜昂貴的DNA 擴(kuò)增儀，非常適合在貧困地區(qū)和基層實驗室使用[17]。

LAMP 技術(shù)是目前唯一通過WHO 的技術(shù)驗證并獲得WHO 推薦應(yīng)用的基于等溫擴(kuò)增的結(jié)核病快速診斷技術(shù),已在多個國家獲得了較廣泛的應(yīng)用[18]。LAMP 借助具有鏈置換功能的嗜熱脂肪芽孢桿菌DNA 聚合酶和至少4 條引物在60～65℃條件下完成DNA 擴(kuò)增過程,具有極高的擴(kuò)增效率，可在60 分鐘內(nèi)完成擴(kuò)增并通過可視化的方式 （熒光或濁度改變等） 呈現(xiàn)結(jié)果。WHO 的驗證數(shù)據(jù)顯示，LAMP 技術(shù)在結(jié)核病診斷方面具有良好的敏感性76%～80%和特異性 97%～98%[18]。

其它的一些等溫擴(kuò)增技術(shù)雖未經(jīng)WHO 驗證，但已有多種獲批在臨床上應(yīng)用,這些技術(shù)雖同為等溫擴(kuò)增,但根據(jù)引物設(shè)計和解鏈方式的不同各具特點[19]，如基于核酸序列依賴性擴(kuò)增技術(shù)的同步擴(kuò)增檢測系統(tǒng)(Simultaneous amplification and testing,SA T-TB) 以Mtb 特異性的16s rRNA 為擴(kuò)增靶標(biāo)，可特異性檢測標(biāo)本中存活狀態(tài)的Mtb，可有效避免死菌的存在對檢測結(jié)果的干擾。這一特點對經(jīng)治結(jié)核病患者的準(zhǔn)確診斷具有更好的特異性， 且具有監(jiān)測結(jié)核病治療效果的潛力[20]。

1.3 基于數(shù)字PCR 的結(jié)核病診斷和藥敏檢測技術(shù)數(shù)字PCR(digital PCR, dPCR)是一種新近建立的單分子核酸擴(kuò)增技術(shù)，其原理是將含有DNA 模板的PCR 溶液稀釋后分布到大量的獨立反應(yīng)室,使單個的模板DNA 分子在各自獨立的反應(yīng)單元中進(jìn)行PCR 擴(kuò)增,再在擴(kuò)增結(jié)束后對每個反應(yīng)單元的熒光信號進(jìn)行采集,最后通過直接計數(shù)或泊松分布公式計算得到樣品的原始濃度或含量。由于各DNA 模板在獨立的反應(yīng)單元中進(jìn)行擴(kuò)增，因此dPCR 具有極高的分辨率和靈敏度,同時由于可在不依賴內(nèi)標(biāo)的條件下實現(xiàn)絕對定量，dPCR 技術(shù)可準(zhǔn)確地計算出野生型和突變型基因的比例[21],這些特點使dPC R 在突變基因檢出方面具有極佳的性能，可以在耐藥相關(guān)基因的檢測方面發(fā)揮獨特的作用。

在結(jié)核分枝桿菌耐藥基因型的判斷中,如果在菌群中存在1%以上的菌株同時對INH 和RIF 耐藥即可定義為耐多藥結(jié)核,并在臨床中表現(xiàn)出耐多藥結(jié)核的表型[22]，這種因少數(shù)耐藥菌存在導(dǎo)致的耐藥現(xiàn)象被稱為異質(zhì)性耐藥[23]。研究顯示，在結(jié)核病高發(fā)地區(qū)有9%～20%的臨床分離菌株中存在異質(zhì)性耐藥現(xiàn)象[24]，而現(xiàn)有的核酸分子雜交技術(shù)和常規(guī)PCR 技術(shù)都難以檢測到5%以下的突變分子，因此在耐藥基因型的檢測方面存在一定的局限，而dPCR 可以借助其高靈敏度和高分辨率的優(yōu)勢檢出低至0.1%的突變分子。菌株水平的研究證實，dPCR 可檢測出低至1CFU/μL 的Mtb, 并可在野生型基因片段中檢出低至0.1%的結(jié)核病耐藥相關(guān)基因[25]，表現(xiàn)出極好的檢測異質(zhì)性耐藥的性能。應(yīng)用臨床標(biāo)本對結(jié)核病進(jìn)行肺結(jié)核和肺外結(jié)核診斷的臨床研究也證實，dPCR 具有優(yōu)于常規(guī)PCR 的檢測敏感性和特異性[26,27]。研究同時證實，利用dPCR 技術(shù)可很好地檢出結(jié)核病患者外周血中Mtb 的循環(huán)游離DNA, 其檢測的敏感性和特異性均顯著優(yōu)于常規(guī)的熒光定量PCR 技術(shù), 這對于兒童結(jié)核病和肺外結(jié)核病的診斷具有很好的實用價值,因為這些患者常常無法獲取痰標(biāo)本[28,29]。同時，由于可對標(biāo)本中的核酸分子進(jìn)行準(zhǔn)確的定量，dPCR 還可用于監(jiān)測結(jié)核病患者的治療反應(yīng)性, 從而指導(dǎo)臨床的治療,這對于接受經(jīng)驗性治療的患者尤其具有重要意義。然而，目前dPCR 在臨床中的應(yīng)用還遠(yuǎn)未普及，WHO 也還未對該技術(shù)在結(jié)核病診斷和藥敏檢測中的有效性組織論證,其中很重要的原因之一可能在于dPCR 檢測需要昂貴的設(shè)備，檢測成本也顯著高于常規(guī)的NAATs 技術(shù)。

1.4 其它NAATs 技術(shù) 作為核酸擴(kuò)增和檢測的最主要技術(shù)平臺，PCR 主要的特點之一就是可以不斷的推陳出新,在此基礎(chǔ)上衍生出各種具有不同特點的核酸擴(kuò)增和檢測方法,在結(jié)核病分子診斷領(lǐng)域也充分展示出了PCR 技術(shù)平臺的這一特點。近年來，一系列基于PCR 技術(shù)的NAATs 檢測系統(tǒng)不斷地被開發(fā)出來并用于結(jié)核病的診斷和藥敏分析，其中比較具有代表性的包括基于多重?zé)晒舛縋CR 技術(shù)的 Abbott RealTimeMTB 和 Abbott RealTimeTMRIF/INH 檢測系統(tǒng)，基于不對稱擴(kuò)增和線性指數(shù)PCR (linear-after-the-exponential PCR,LATE-PCR)技術(shù)的 Hain FluoroTypeMTB 和 Hain FluoroTypeMTDBR 檢測系統(tǒng)， 基于多靶標(biāo)熒光定量PCR 技術(shù)的Roche CobasMTB 系統(tǒng)和PCR擴(kuò)增結(jié)合熒光探針融解曲線分析的MeltProTB檢測系統(tǒng)等。這些檢測系統(tǒng)大多可以同時進(jìn)行Mtb檢測和藥敏分析，而且，與現(xiàn)有的WHO 推薦的方法比較具有更高的檢測通量，如Abott RealTime 檢測系統(tǒng)每批次可檢測96 份標(biāo)本，且具有良好的檢測性能,在Mtb 檢測方面的敏感性和特異性分別為96%和97%，檢測RIF 耐藥性的敏感性和特異性分別為94%和100,檢測INH 耐藥性的敏感性和特異性分別為89%和99%[30]。2019 年WHO 成立了一個專門的技術(shù)小組對這些高通量的分子診斷平臺進(jìn)行相關(guān)性能的論證, 初步的結(jié)果顯示這些平臺在Mtb 檢測方面的性能與Xpert 相近，在檢測耐多藥結(jié)核病的性能方面與線性探針技術(shù)相近， 但技術(shù)小組的報告認(rèn)為目前還未得到足以支持推薦這些檢測平臺的足夠數(shù)據(jù)[31]，因此盡管上述部分檢測系統(tǒng)已經(jīng)得到相關(guān)政府管理部門的批準(zhǔn)應(yīng)用于臨床，但主要還局限于科研實驗室的應(yīng)用，但目前，WHO 已計劃成立一個指南開發(fā)小組對這些技術(shù)平臺進(jìn)行第二輪的論證[1]。

2 基于核酸分子雜交技術(shù)的結(jié)核病藥敏檢測技術(shù)

核酸分子雜交技術(shù)是基于具有互補(bǔ)序列的兩條核酸單鏈在一定條件下可按堿基配對原則形成雙鏈分子的原理,將待檢分子與已知序列的核酸分子進(jìn)行雜交反應(yīng),再通過適當(dāng)?shù)臋z測技術(shù)對雜交產(chǎn)物進(jìn)行檢測和分析的技術(shù)。如果在進(jìn)行雜交反應(yīng)前對已知序列的核酸分子,即核酸分子探針進(jìn)行標(biāo)記即可在雜交反應(yīng)后對雜交產(chǎn)物進(jìn)行檢測,通過分析與不同探針分子發(fā)生雜交后的信號進(jìn)行分析即可了解待檢標(biāo)本中存在的核酸分子的信息。核酸分子雜交技術(shù)最主要的優(yōu)勢是其具有強(qiáng)大的多靶標(biāo)分析能力,理論上通過設(shè)計合適的探針可用于幾乎所有突變形式的檢測。隨著固相載體材料和點樣技術(shù)的不斷發(fā)展,分子雜交檢測的高度集成的優(yōu)勢越發(fā)顯著,使得其在核酸分子檢測中的效率越來越高。目前，分子雜交技術(shù)已廣泛應(yīng)用于各類核酸分子,尤其是突變分子或SNP 的檢測與分析。通常，而為了提高核酸分子雜交檢測的靈敏度,核酸分子雜交多與PCR 技術(shù)結(jié)合使用，即首先通過PCR 技術(shù)對標(biāo)本中的待檢核酸分子進(jìn)行擴(kuò)增,再采用特異性的探針對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雜交分析。

由于結(jié)核分枝桿菌的耐藥機(jī)制絕大多數(shù)與染色體核酸分子的突變有關(guān),且絕大多數(shù)與Mtb 耐藥相關(guān)的基因突變類型已經(jīng)明確,因此核酸分子雜交在Mtb 耐藥性檢測方面有很好的應(yīng)用價值,目前已有多種基于核酸分子雜交的技術(shù)平臺應(yīng)用于結(jié)核病的診斷和耐藥分析。早在2008 年，WHO 就推薦采用線性探針分析法(Line probe assay, LPA)對結(jié)核病患者進(jìn)行RIF 和INH 的耐藥性檢測, 這也是WHO 最早推薦使用的結(jié)核病分子診斷技術(shù)[32]。線性探針分析法是基于反向雜交的原理, 采用靶向Mtb 23S rRNA 基因的探針進(jìn)行Mtb 的檢測, 采用靶向rpoB 的多條探針檢測RIF 耐藥相關(guān)的基因序列，采用靶向katG 基因和inhA 基因啟動子區(qū)域的探針檢測INH 耐藥相關(guān)的基因序列。相關(guān)的meta分析顯示, 對于痰涂片抗酸染色陽性的結(jié)核病患者，LPAs 檢測RIF 耐藥的敏感性和特異性分別為96.7%和98.8%，檢測INH 耐藥的敏感性和特異性分別為 90.2%和 99.2%[33]。然而，由于 LPAs 對涂陰結(jié)核病患者檢測的敏感性較差，WHO 僅推薦將LPAs 用于經(jīng)細(xì)菌學(xué)方法確診的患者的耐藥性分析。隨著Xpert MTB/RIF 技術(shù)和其它NAATs 技術(shù)的快速發(fā)展，目前已很少實驗室采用LPAs 進(jìn)行結(jié)核病的診斷和一線抗結(jié)核藥物的耐藥性分析。然而，由于在檢測靶標(biāo)數(shù)量方面存在限制，NAATs 技術(shù)難以同時對一線和二線藥物進(jìn)行藥敏分析，因此新一代的LPAs 技術(shù)在對結(jié)核病二線藥物進(jìn)行藥敏分析方面獲得了較好的應(yīng)用，WHO 也因此再次對LPAs 在結(jié)核病藥敏分析中的應(yīng)用進(jìn)行了論證，并于2016 年推薦其用于對氟喹諾酮和結(jié)核病二線注射藥物，包括卡那霉素、阿米卡星和卷曲霉素等的藥敏分析[34]。然而，由于與二線藥物耐藥相關(guān)的基因數(shù)較多,耐藥相關(guān)的突變位點更多且較分散，即使是LPAs 系統(tǒng)也難以覆蓋所有的耐藥相關(guān)位點，因此對于LPAs 進(jìn)行二線藥物藥敏分析的性能，不同系統(tǒng)和不同實驗室的數(shù)據(jù)存在較大差異，因而WHO 也將LPAs 的推薦應(yīng)用范圍局限在廣泛耐藥患者的篩查中， 即僅用于確診的耐多藥結(jié)核或耐RIF 患者的二線藥物的耐藥性分析。盡管如此，由于可同時檢測的靶點多、檢測效率高且檢測成本較低,基于核酸分子雜交的結(jié)核病診斷和耐藥檢測技術(shù)仍獲得了較多研究者和臨床實驗室的青睞, 如基于PCR 擴(kuò)增和核酸雜交芯片的TruenMTB/MTB-Rif Dx 系統(tǒng)和 GeneChipMDR 系統(tǒng)就分別在印度和中國獲批了臨床應(yīng)用， 并分別獲得了WHO 和比爾及梅琳達(dá)·蓋茨基金會結(jié)核病項目的技術(shù)驗證和推廣[1,35-36]。

LPAs 一個比較突出的缺點是需要在PCR 擴(kuò)增后對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雜交檢測,操作復(fù)雜且存在一定的生物安全和較高的實驗室污染風(fēng)除,操作時間也相對較長,因而在很大程度上限制了這一技術(shù)的應(yīng)用和推廣。近年來，隨著微流控技術(shù)的發(fā)展和不斷成熟,很多研究者嘗試將微流控系統(tǒng)與核酸分子雜交技術(shù)相結(jié)合建立一種全自動的核酸分子檢測系統(tǒng)，以期克服分子雜交操作復(fù)雜、生物風(fēng)險和實驗室污染較大的不足,并取得了較好的成果，如基于此原理的TruArray MDR-TB 系統(tǒng)就是通過微流控系統(tǒng)將PCR 擴(kuò)增、 核酸分子雜交和雜交產(chǎn)物檢測的各過程整合進(jìn)一個平臺,從而實現(xiàn)結(jié)核病診斷和藥敏分析的自動化檢測。這一平臺以IS6110 and IS1245 基因為靶標(biāo)進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群和鳥分枝桿菌復(fù)合群的檢測,同時以分別靶向野生型和突變型 rpoB、katG、inhA、embB 和 rpsL 基因的寡核苷酸探針同時進(jìn)行雜交,實現(xiàn)同時完成Mtb 檢測、 一線和二線抗結(jié)核藥的耐藥基因型檢測的目的。研究結(jié)果顯示,其對一線抗結(jié)核藥物的耐藥性檢測具有很好的準(zhǔn)確性, 其中對INH、RIF 和乙胺丁醇 （EMB） 耐藥的檢測敏感性分別為90.0%、100%和70%, 特異性分別為98.2%、95.0%和98.6%。由于設(shè)計的探針未能完全覆蓋鏈霉素（streptomycin, SM）耐藥的相關(guān)基因，這一系統(tǒng)對二線藥物SM 耐藥的檢測敏感性較差，只有34.8%，但特異性達(dá)到99.2%，與耐藥表型的總體一致率也達(dá)到了89.5%[37]。其它一些基于微流控和核酸分子雜交技術(shù)的檢測系統(tǒng)也在陸續(xù)地研究開發(fā)當(dāng)中，如Veredus 公司推出的VereMTBTM 系統(tǒng)等， 但目前尚未納入WHO 的驗證范圍。

3 基于基因測序的結(jié)核病診斷及藥敏分析技術(shù)

與NAATs 和核酸分子雜交等靶向性的基因檢測和分析技術(shù)不同,基因測序可提供完整和準(zhǔn)確的基因組或特定基因的序列信息,因此也被認(rèn)為是基因檢測和分子診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)測序原理的不同,目前的基因測序技術(shù)主要分為一代測序和二代測序技術(shù)（next-generation sequencing，NGS）。一代測序技術(shù)的測序準(zhǔn)確率和通量更高, 但測序速度慢，檢測敏感性差，尤其是對突變分子檢出的分辨率不佳（一般只能檢測20%以上的突變分子）,因而在結(jié)核病診斷和藥敏分析中的應(yīng)用價值不是很好,目前往往被用作二代測序結(jié)果的進(jìn)一步確認(rèn)。NGS又被稱為大量并行測序或高通量測序,具有測序速度快、檢測效率高、敏感性好和突變基因檢出分辨率高等特點，已被廣泛應(yīng)用于產(chǎn)前診斷、腫瘤和遺傳性疾病的診斷等領(lǐng)域,在感染性疾病的診斷和藥敏分析領(lǐng)域也表現(xiàn)出良好的應(yīng)用價值[38]。根據(jù)測序策略的不同，NGS 又可應(yīng)用于特定微生物種群的全基因組測序 （whole genome sequencing，WGS）和非靶向性的宏基因組測序（Metagenomic next-generation sequencing，mNGS）。

研究顯示,在Mtb 檢測方面，WGS 具有與NAA Ts 相似甚至更好的敏感性和特異性， 但在耐藥基因型的檢測方面明顯優(yōu)于NAATs 技術(shù)和核酸分子雜交技術(shù)[39,40]。一方面，由于可準(zhǔn)確檢測Mtb 的全基因組信息，WGS 可以覆蓋所有與Mtb 耐藥相關(guān)的基因和位點，因此對耐藥基因型的檢測更為靈敏。另一方面,由于可以獲得基因詳細(xì)的序列信息,NGS可避免在NAATs 和核酸分子雜交檢測過程中出現(xiàn)的因基因多態(tài)性導(dǎo)致的假陽性結(jié)果,因此具有更好的特異性, 可用于NAATs 技術(shù)和核酸分子雜交技術(shù)檢測結(jié)果的確認(rèn)[41]。此外，有研究顯示，NGS 可從敏感性Mtb 中檢出低至3%的耐藥Mtb, 因而具有比NAATs 和核酸分子雜交技術(shù)更優(yōu)的Mtb 異質(zhì)性耐藥的檢出率[42]。

然而截至目前，WGS 尚未作為常規(guī)技術(shù)應(yīng)用于臨床結(jié)核病的診斷和藥敏分析,主要的原因除了成本較高外, 還在于WGS 檢測一般需在獲得Mtb純培養(yǎng)物的基礎(chǔ)上進(jìn)行,因而極大地限制了這一技術(shù)的臨床應(yīng)用。近年來, 為了克服WGS 的這一不足,有些研究者嘗試通過對臨床標(biāo)本進(jìn)行快速預(yù)處理后再進(jìn)行WGS 檢測，如以快速液體培養(yǎng)陽性的培養(yǎng)物進(jìn)行直接WGS 檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以1ml 陽性的快速液體培養(yǎng)物直接進(jìn)行核酸提取再進(jìn)行WGS檢測,可從所有陽性標(biāo)本中獲得高質(zhì)量的測序結(jié)果[43,44]。此外，有研究報道通過采用DNA 濃縮試劑盒對臨床痰標(biāo)本中提取的DNA 標(biāo)本進(jìn)行富集后再進(jìn)行WGS 檢測,或以靶向結(jié)核分枝桿菌DNA 的生物素化的RNA 對標(biāo)本中的結(jié)核分枝桿菌DNA 進(jìn)行特異性捕獲后再行WGS 檢測均能取得較好的檢測結(jié)果, 對于痰涂片抗酸陽性的痰標(biāo)本，74%-83%的標(biāo)本可獲得測序結(jié)果[44,45]。這些研究提示通過優(yōu)化檢測流程應(yīng)用WGS 進(jìn)行臨床標(biāo)本的直接檢測是可行的,但這一結(jié)論還需要更多臨床研究的支持。

與WGS 不同，mNGS 不針對特定的病原體進(jìn)行靶向測序,而是對標(biāo)本中所有微生物的基因組進(jìn)行高通量測序,再通過將測序獲得的讀數(shù)結(jié)果與微生物基因組文庫中的序列進(jìn)行比對,從而獲取標(biāo)本中微生物存在的信息,常用于臨床復(fù)雜感染的病原體檢測。近年來，mNGS 在Mtb 檢測，尤其是在肺外結(jié)核檢測中的性能也逐漸受到研究者的關(guān)注。一項對腦脊液標(biāo)本進(jìn)行的平行檢測研究發(fā)現(xiàn)，mNGS診斷結(jié)核性腦炎的敏感性為66.67%,特異性為100%，顯著優(yōu)于抗酸染色法、培養(yǎng)法和PCR 法[46]。對結(jié)核病疑似患者的臨床標(biāo)本（包括痰標(biāo)本、腦脊液和腫液等）采用mNGS、Xpert 和Mtb 培養(yǎng)法進(jìn)行的平行檢測發(fā)現(xiàn)，mNGS 診斷結(jié)核病 （包括肺結(jié)核和肺外結(jié)核） 的敏感性和特異性與Xpert 系統(tǒng)相當(dāng)，顯著優(yōu)于培養(yǎng)法[47,48]。鑒于mNGS 可同時發(fā)現(xiàn)多種可能的病原體，mNGS 在檢測病原體感染方面與靶向性的分子診斷比較有顯著的優(yōu)勢,但mNGS 檢測病原體的性能受測序深度影響,不同的測序深度可能導(dǎo)致同一份標(biāo)本產(chǎn)生不同的檢測結(jié)果，此外，高昂的檢測費用在很大程度上限制了這一技術(shù)的推廣應(yīng)用[49]。

目前，已有多個國家和地區(qū)在使用WGS 技術(shù)進(jìn)行耐藥結(jié)核病的篩查[50]，部分結(jié)核病低發(fā)的國家和地區(qū)已批準(zhǔn)采用WGS 技術(shù)進(jìn)行一線抗結(jié)核病藥物的耐藥性檢測[51]。鑒于NGS 技術(shù)良好的應(yīng)用前景，WHO 于 2018 年發(fā)布了 NGS 在 Mtb 耐藥性突變檢測中的技術(shù)指南[52]，同時為了進(jìn)一步規(guī)范對NGS 在結(jié)核病耐藥檢測中的結(jié)果解讀，由梅琳達(dá)·蓋茨基金會、關(guān)鍵路徑研究所（C-Path），創(chuàng)新型新診斷基金會（FIND）和WHO 在內(nèi)的多個機(jī)構(gòu)共同倡議建立的關(guān)聯(lián)測序結(jié)核病數(shù)據(jù)平臺ReSeqTB 也開始支持高通量測序的數(shù)據(jù)分析，并已經(jīng)被WHO所采納[53]。綜上，NGS 是一種非常有效的結(jié)核病診斷和藥敏分析的技術(shù)平臺， 但目前高昂的成本不太可能使其在短期內(nèi)成為結(jié)核病診斷和藥敏分析的常規(guī)方法。

4 基于宿主應(yīng)答靶標(biāo)和Mtb 循環(huán)游離DNA 檢測的結(jié)核病分子診斷技術(shù)

結(jié)核病分子和病原學(xué)診斷的主要標(biāo)本是痰,然而在某些情況下患者的痰標(biāo)本并不容易獲取，如無痰或少痰的患者、年老體弱的患者或兒童，在這些情況下結(jié)核病的診斷往往難以進(jìn)行,因此,WHO2 014 年提出應(yīng)重視開發(fā)基于非痰標(biāo)本的結(jié)核病診斷技術(shù)[54],在此背景下基于宿主反應(yīng)和Mtb 游離D NA 檢測的結(jié)核病診斷方法受到大量研究者的關(guān)注。

基于宿主應(yīng)答的結(jié)核病分子診斷的靶標(biāo)主要包括兩類,免疫細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄本(mRNA)和非編碼RN A 的檢測。已有的研究顯示，基于宿主應(yīng)答靶標(biāo)的分子診斷方法在結(jié)核病診斷中的整體準(zhǔn)確性并不是很理想,但在區(qū)分活動性結(jié)核病和Mtb 的潛伏感染方面, 以及結(jié)核病預(yù)后評估方面有一定的價值[55-57]。

基于Mtb 游離DNA 檢測的方法被證實是非痰標(biāo)本診斷結(jié)核病, 尤其是肺外結(jié)核病的有效方法。如有研究顯示，采用熒光定量PCR 技術(shù)檢測確診和疑診腹部結(jié)核患者腹水標(biāo)本中的Mtb 游離DNA 時,其敏感性和特異性為70.9%和97.1%,顯著優(yōu)于Xpert 技術(shù)[58]。然而，來自不同課題組的臨床研究顯示，以血液和體液中Mtb 游離DNA 為靶標(biāo)的分子診斷技術(shù)對結(jié)核病的診斷敏感性從29%到79%不等，這些差異可能與采用的標(biāo)本、核酸提取的方式和檢測的靶基因不同有關(guān),提示以Mtb 游離DNA 為靶標(biāo)進(jìn)行結(jié)核病的診斷并不穩(wěn)定, 進(jìn)一步對標(biāo)本采集、核酸提取和檢測的靶基因進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化可能有助于提高M(jìn)tb 游離DNA 檢測在結(jié)核病診斷中的價值[59]，采用更為靈敏的檢測技術(shù)，如dPCR和NGS 技術(shù)對循環(huán)Mtb 游離DNA 進(jìn)行檢測也是提高其檢測性能的有效方法[29]。

5 挑戰(zhàn)與希望

隨著分子診斷技術(shù)的快速發(fā)展,近年來結(jié)核病的病原學(xué)確診率逐年提高,接受耐藥性檢測患者的比例也有了顯著提升。WHO 的統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示,2019年約有57%的肺結(jié)核患者獲得了病原學(xué)確診，在獲得病原學(xué)確診的患者中有61%接受了耐藥性檢測,這一數(shù)據(jù)在 2017 年為 51%，2012 年僅為 7%[1]。然而，盡管取得了較大的進(jìn)展，結(jié)核病的診斷仍面臨巨大的挑戰(zhàn),漏診和診斷延遲仍是阻礙結(jié)核病疫情防控的主要原因之一,尤其是在中低收入的國家和地區(qū)。WHO 的統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，全球每年仍有約300 萬結(jié)核病患者未能獲得診斷或未進(jìn)行登記，在2019 年新發(fā)的耐多藥結(jié)核患者中, 僅有約38%接受了適當(dāng)?shù)闹委焄1]。

因此,大量涌現(xiàn)的高敏感性和高特異性的分子診斷技術(shù)并未從根本上改變結(jié)核病診斷的困境，其背后主要的原因在于這些新技術(shù)并未能得到很好的推廣應(yīng)用。有調(diào)查發(fā)現(xiàn),在17 個主要的結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家中,痰涂片抗酸染色仍是目前結(jié)核病診斷的最主要方法，而WHO 在十年前就開始推薦的Xpert 檢測系統(tǒng)并未獲得廣泛的應(yīng)用[60]。因此，從目前的現(xiàn)狀來看單純發(fā)展新的結(jié)核病診斷技術(shù)并不足以改變結(jié)核病防控面臨的問題,推廣這些技術(shù)可能更為重要。然而，高昂的檢測成本又使得這些技術(shù)難以在短期內(nèi)在中低收入國家和地區(qū)廣泛推廣,但世界上絕大部分的結(jié)核病患者恰恰分布在經(jīng)濟(jì)條件較差的中低收入國家,因此在全面衡量技術(shù)性能、 生物安全和經(jīng)濟(jì)可承受性的基礎(chǔ)上發(fā)展適合中低收入國家實際情況的分子診斷技術(shù),而非一味地追求兼具高敏感、全自動和更低生物風(fēng)險的技術(shù)可能才是最有效的策略。在這一方面，印度研發(fā)的TruenatMTB/TruenatMTB-Rif Dx 檢測系統(tǒng)是一個值得借鑒的經(jīng)驗。該系統(tǒng)雖然在操作簡便性和生物安全風(fēng)險防控方面不如Xpert 系統(tǒng)，但技術(shù)性能和檢測時間與Xpert 系統(tǒng)相當(dāng)，成本卻遠(yuǎn)低于Xpert 系統(tǒng)。目前，TruenatMTB/TruenatMTBRif Dx 系統(tǒng)已經(jīng)在印度得到了較廣泛的推廣，用以替代價格昂貴的Xpert 系統(tǒng)[61]。最近，該檢測系統(tǒng)的技術(shù)性能也已經(jīng)過WHO 專家組的論證并得到了 W HO 的推薦[1]。

另一個困擾結(jié)核病防控的問題在于結(jié)核病大多發(fā)生在醫(yī)療條件較差的偏遠(yuǎn)地區(qū),這些地區(qū)的患者除了經(jīng)濟(jì)條件受限外,往往難以及時得到相應(yīng)的醫(yī)療服務(wù),尤其是對實驗條件要求較高的分子診斷服務(wù)。因此除了進(jìn)一步推廣低檢測成本的高效診斷技術(shù)外, 進(jìn)一步發(fā)展適合偏遠(yuǎn)地區(qū)檢測需求的POCT 快速檢測系統(tǒng)也很有必要。目前，Xpert 系統(tǒng)和TruenatMTB/TruenatMTB-Rif Dx 系統(tǒng)都推出了相應(yīng)的POCT 檢測平臺，WHO 也在大力提倡開發(fā)更為低廉、靈活的POCT 檢測系統(tǒng)用于偏遠(yuǎn)地區(qū)的結(jié)核病診斷[1]。因此，我們有理由相信在不久的將來，更加便捷、高效且適合中低收入國家推廣使用的結(jié)核病分子診斷技術(shù)將得到快速發(fā)展，為結(jié)核病患者的及時診治提供更好的服務(wù)， 同時為全球結(jié)核病疫情的防控發(fā)揮更加積極的作用。