魚類細(xì)菌性病原分離鑒定新方法

目前魚類主要微生物病原包括細(xì)菌、真菌及病毒等，其通用的分離鑒定方法主要是培養(yǎng)法，即選擇合適的培養(yǎng)基對目標(biāo)生物進(jìn)行培養(yǎng)、純化，繼而開展相關(guān)鑒定工作，其最重要的關(guān)鍵點(diǎn)即培養(yǎng)微生物。病原微生物分離純化技術(shù)的發(fā)展給魚類病原微生物鑒定帶來極大便利，推動了魚類病原學(xué)的革命性發(fā)展。隨著研究的深入及新技術(shù)的發(fā)展，我們認(rèn)識到并非所有病原微生物均可培養(yǎng)。而隨著養(yǎng)殖環(huán)境的惡化，魚類病原呈現(xiàn)多樣性，一些不可培養(yǎng)的(或者常規(guī)條件難以培養(yǎng))細(xì)菌、真菌也可能成為魚類病原菌，因此迫切需要革新病原分離鑒定的技術(shù)。本文以黃顙魚腹水病病原分離鑒定為例，介紹一種新的魚類細(xì)菌性病原分離鑒定方法，供同行參考。

一、16S rDNA高通量測序技術(shù)

16S rDNA 高通量測序技術(shù)是主要基于細(xì)菌16S rDNA 基因在功能上的高度保守性以及又有一定程度的高變性，可以真實(shí)全面地反映樣品中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，從而檢測到可培養(yǎng)以及不可培養(yǎng)的細(xì)菌種類。隨著現(xiàn)代高通量測序技術(shù)的發(fā)展，16S rDNA 高通量測序技術(shù)已經(jīng)被普遍使用于各個領(lǐng)域進(jìn)行細(xì)菌多樣性分析。針對水生動物細(xì)菌性病原，可采取16S rDNA 高通量測序技術(shù)來解決難培養(yǎng)或者不能培養(yǎng)的細(xì)菌感染引起的疾病病原確定問題，直接取病樣測序獲取發(fā)病魚相應(yīng)病灶部位及相關(guān)組織器官細(xì)菌群落，通過高通量獲取細(xì)菌種屬信息，從而對可分離培養(yǎng)的細(xì)菌制定針對性的分離培養(yǎng)措施，對不可培養(yǎng)細(xì)菌也可了解其大致信息以便進(jìn)行毒力相關(guān)研究。

二、應(yīng)用實(shí)例

1.流行病學(xué)調(diào)查 荊州某黃顙魚養(yǎng)殖場暴發(fā)腹水病，筆者對養(yǎng)殖情況、周邊環(huán)境、發(fā)病史及用藥情況進(jìn)行調(diào)查，分析黃顙魚發(fā)病的典型癥狀，并取樣進(jìn)行液氮保存帶回實(shí)驗室進(jìn)一步分析。

2.16S rDNA 細(xì)菌多樣性分析 在無菌條件下，取6 尾具典型患病癥狀的黃顙魚置于操作臺上，用滅菌剪刀將黃顙魚腹部戳破，將腹水分別裝入兩支10毫升的離心管中，一支加入20%甘油置于-80℃冰箱保存待用，另一支送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司抽提DNA 并在Illumina Mi-Seq平臺上進(jìn)行高通量測序。

3.特定細(xì)菌分離 基于細(xì)菌16S rDNA 多樣性測序結(jié)果，此次患病黃顙魚的腹水中氣單胞菌屬種類占據(jù)絕對優(yōu)勢，因此使用谷氨酸鹽淀粉酚紅瓊脂從腹水中分離優(yōu)勢菌，即用接種環(huán)蘸取保存的腹水劃線于平板上，28℃培養(yǎng)24 小時后挑取單菌落進(jìn)一步純化，純化后的細(xì)菌加入20%甘油保存于-20℃?zhèn)溆?。分離菌株命名為HS01。

4.病原確診 經(jīng)人工感染試驗，病菌HS01 確定為本次黃顙魚腹水病病原，通過理化特性測定及保守基因分型，確定分離株HS01 為嗜水氣單胞菌，從而確定本次黃顙魚暴發(fā)溶血性腹水病的病原是嗜水氣單胞菌。

三、討論

當(dāng)前水生動物細(xì)菌性疾病暴發(fā)癥狀呈現(xiàn)多樣性，細(xì)菌性病原種類繁多，對于如何確定細(xì)菌性病原變得更加艱難。傳統(tǒng)水生動物細(xì)菌性病原的確定方法是通過直接對細(xì)菌性病原進(jìn)行分離培養(yǎng)，從而獲得細(xì)菌的純培養(yǎng)物，其后利用細(xì)菌的純培養(yǎng)物進(jìn)行回歸感染，看是否出現(xiàn)自然感染癥狀，如出現(xiàn)則進(jìn)一步對純培養(yǎng)物進(jìn)行鑒定，如若不是則進(jìn)行純化細(xì)菌。

傳統(tǒng)方法在細(xì)菌病原確定方面嚴(yán)格遵循了科赫法則，是確定細(xì)菌病原的金標(biāo)準(zhǔn)。但隨著現(xiàn)代研究的深入以及細(xì)菌病原不斷增多，傳統(tǒng)病原確定方法暴露出了不少缺點(diǎn)，主要集中在病原分離培養(yǎng)方面。傳統(tǒng)細(xì)菌性病原確定方法的關(guān)鍵手段是獲得細(xì)菌性純培養(yǎng)物，而細(xì)菌性病原培養(yǎng)條件各不同，有的甚至很苛刻，有厭氧的，有喜寡養(yǎng)，有親富營養(yǎng)的，有本身會自噬的以及其他特殊條件要求等。

我們進(jìn)行細(xì)菌性病原分離時通常使用的是普通培養(yǎng)基如營養(yǎng)瓊脂等或者營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基如腦心浸出液等，更進(jìn)一步用一些常用的選擇性培養(yǎng)基如TCBS 等，培養(yǎng)條件常為28℃有氧恒溫培養(yǎng)，對于一般常見水生動物細(xì)菌性病原能夠分離到，有時雜菌率比較高。而對于一些有特殊要求的病原可能就很難分離純化到，不長或者長得不如常見微生物好的情況經(jīng)常遇到，還有一些種類是不可培養(yǎng)的，所以導(dǎo)致一部分細(xì)菌性疾病病原始終無法準(zhǔn)確確定，給細(xì)菌性疾病病原確定帶來了嚴(yán)重障礙。

16S rDNA 高通量測序技術(shù)的引入，使得本次確診更加可信，也改正了傳統(tǒng)水生動物細(xì)菌性病原確定的缺點(diǎn)，是對傳統(tǒng)方法的補(bǔ)充與完善。