加速康復(fù)外科圍術(shù)期營養(yǎng)管理對胃切除術(shù)后腸黏膜屏障的影響

呂季陽，李紅，韓賀，馮樂，陳吉祥

(1.江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院普外科，江蘇 鎮(zhèn)江 212001；2.江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

加速康復(fù)外科(enhanced recovery after surgery,ERAS) 理念由丹麥Kehlet教授于1997年提出[1]，最早應(yīng)用于結(jié)直腸手術(shù)中。隨后，ERAS理念逐步拓展應(yīng)用于普外科的幾乎所有臟器手術(shù)，而關(guān)于胃切除術(shù)的ERAS研究起步稍晚。目前已有的研究多以說明ERAS理念應(yīng)用于胃切除術(shù)安全、有效，可促進(jìn)腸蠕動，有利于術(shù)后腸功能恢復(fù)且并不增加術(shù)后并發(fā)癥等[2-3]，而有關(guān)胃切除術(shù)對腸屏障結(jié)構(gòu)的影響尚不清楚。本文通過檢測全胃切除術(shù)實(shí)施ERAS營養(yǎng)管理患者的腸屏障功能，再制作大鼠胃切除模型并按ERAS營養(yǎng)管理要求進(jìn)行營養(yǎng)管理，觀察其腸黏膜屏障的形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)變化，以期探討ERAS圍術(shù)期營養(yǎng)管理對胃切除術(shù)腸屏障結(jié)構(gòu)和功能的影響。

1 資料和方法

1.1 臨床資料

1.1.1 研究對象 選擇2017年9月至2019年10月江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院普外科收治的42例胃癌患者，均行腹腔鏡全胃切除術(shù)，隨機(jī)分成兩組：ERAS組(按ERAS理念進(jìn)行圍術(shù)期營養(yǎng)管理)22例，47～69歲；傳統(tǒng)組(按傳統(tǒng)理念進(jìn)行圍術(shù)期營養(yǎng)管理)20例，39～70歲。入選標(biāo)準(zhǔn)：年齡≤70歲；術(shù)前未接受過化療；均接受擇期D2手術(shù)治療；患者接受并簽訂知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：姑息、急診手術(shù)；需要聯(lián)合切除脾或胰腺的患者；胃腸梗阻者；有心功能不全、肝硬化、膽囊炎、膽結(jié)石和糖尿病病史。本研究經(jīng)江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審批，審批號2016-035。

兩組患者年齡、性別、腫瘤大小、位置及TNM分期比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。見表1。

表1 兩組患者臨床資料比較

1.1.2 主要藥品、試劑和儀器 腸內(nèi)營養(yǎng)液，紐迪希亞制藥有限公司(無錫)；腸外營養(yǎng)液(1 440 mL，1 000 kcal)，華瑞制藥有限公司(無錫)；麥芽糊精果糖飲品，商品名素乾，江蘇正大豐海制藥有限公司(連云港)。人二胺氧化酶(diamine oxidase,DAO)、人D-乳酸及人腸脂肪酸結(jié)合蛋白(IFABP)ELISA試劑盒為博智科生物(蘇州)產(chǎn)品。微量輸液泵ZD-50F6(蘇州澤德醫(yī)療器械有限公司)；全波長酶標(biāo)分析儀Multiskan GO(上海巴玖實(shí)業(yè)有限公司)；透射電子顯微鏡(型號JEM-1400 PLUS)為日本電子株式會社(東京)產(chǎn)品。

1.1.3 圍術(shù)期營養(yǎng)管理 ERAS組按文獻(xiàn)[4]進(jìn)行營養(yǎng)管理。術(shù)前未常規(guī)進(jìn)行腸道準(zhǔn)備；術(shù)前12 h禁食，術(shù)前6 h及2 h分別口服素乾400 mL和200 mL。術(shù)后麻醉清醒后即可飲水(飲水量小于25 mL/h)。術(shù)后12 h從鼻腸管滴注5%葡萄糖氯化鈉注射液，20～40 mL/h，24 h后如腸道能適應(yīng)，給予鼻腸管注入腸內(nèi)營養(yǎng)液，開始20 mL/h逐日增至80～100 mL/h，維持7 d過渡至正常飲食。熱量開始500～600 kcal/d，逐漸增加至30 kcal/(kg·d)。術(shù)后前幾天由腸內(nèi)營養(yǎng)供給的熱量和液體量不足，可由靜脈補(bǔ)充10%葡萄糖和復(fù)方氨基酸溶液，直至全胃腸內(nèi)營養(yǎng)?？傄后w量2 300～2 500 mL。傳統(tǒng)組按傳統(tǒng)圍術(shù)期管理理念進(jìn)行處理。術(shù)前一天晚間灌腸，術(shù)前12 h禁食禁飲。術(shù)后禁食禁飲，術(shù)后第1天行靜脈營養(yǎng)，輸入腸外營養(yǎng)液，靜脈供給熱量30 kcal/(kg·d)，總液體量2 300～2 800 mL，術(shù)后7 d過渡至正常飲食。

1.1.4 樣本采集 患者于術(shù)前、術(shù)后1、3、5 d取空腹肘靜脈血4 mL于EDTA抗凝管；2 h內(nèi)離心，3 000 r/min離心10 min，取血漿分裝，-70 ℃保存。

1.2 動物分組和胃切除模型制備

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動物 健康成年雄性清潔級SD大鼠，體重250～300 g，由江蘇大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，動物許可證號為SCXK(蘇)2019—0021，于普通實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，自由進(jìn)食飲水。

1.2.2 動物分組 50只大鼠隨機(jī)分為3組。ERAS組：大鼠全胃切除+腸內(nèi)營養(yǎng)，20只；傳統(tǒng)組：大鼠全胃切除+腸外營養(yǎng)，20只；對照組：10只，常規(guī)飼養(yǎng)，自由進(jìn)食飲水。

1.2.3 胃切除模型制備 ERAS組：腹腔注射氯胺酮(10 mg/100 g)后，腹部正中切口逐層進(jìn)腹腔，取下胃組織，吻合食管和十二指腸斷端。在空腸壁(距十二指腸懸韌帶15 cm處)，用絲線作環(huán)狀荷包縫合，置入采血針?biāo)芰蠈?dǎo)管(用作腸內(nèi)營養(yǎng)管)，插入空腸內(nèi)約2 cm，縫合固定。在距腹部切口外側(cè)0.5 cm的腹肌處剪一小洞，導(dǎo)管另一端由此出腹腔，并由此鈍性分離皮膚與皮下組織成一條通道至頸背部，切一小口，導(dǎo)管經(jīng)通道從頸背部引出。腹肌及皮下組織單純連續(xù)縫合，皮膚單純間斷縫合關(guān)閉腹腔。作為假手術(shù)損傷，于頸部正中切口，分離大鼠右側(cè)頸內(nèi)靜脈約0.5 cm，將頸內(nèi)靜脈結(jié)扎，分層縫合頸部切口。將術(shù)后大鼠安置于鼠籠，并連接塑料管與微量注射泵。

傳統(tǒng)組：行全胃切術(shù)后，縫合食管和十二指腸斷端。作為假手術(shù)損傷，在空腸壁(位置同ERAS組)作一小切口，絲線縫合，同時(shí)縫合腹部切口。再作頸前區(qū)切口，分離右側(cè)頸內(nèi)靜脈約1 cm，結(jié)扎遠(yuǎn)心端，在近心端置入充滿肝素液的靜脈留置針(22 G)至上腔靜脈，用絲線將置管固定并由頸部切口引出，縫合切口。將術(shù)后大鼠置于籠內(nèi)，將靜脈管連接微量輸液。

1.2.4 營養(yǎng)供給方案 兩組大鼠均于術(shù)前12 h禁食，ERAS組于術(shù)前6 h供給素乾3 mL。兩組均于術(shù)后6 h供給營養(yǎng)，熱能按每天30 kcal/kg計(jì)算。ERAS組每天注入腸內(nèi)營養(yǎng)液量(mL)=30 kcal·kg-1×體重(kg)/(1 kcal·mL-1)，傳統(tǒng)組每天注入腸外營養(yǎng)液量(mL)=30 kcal/kg×體重(kg)/(0.69 kcal·mL-1)。每天液體供給量30 mL，不足部分加注射用水補(bǔ)充，以微量注射泵勻速于24 h內(nèi)輸入。其間大鼠禁食不禁飲。為防止?fàn)I養(yǎng)管堵塞，腸內(nèi)營養(yǎng)管堅(jiān)持每天用0.9% NaCl溶液沖洗，腸外營養(yǎng)管每12 h予肝素生理鹽水沖洗。

1.2.5 標(biāo)本采集 兩組于術(shù)后24 h、72 h分兩批處理并取腸組織，每批10只。對照組10只，于常規(guī)飼養(yǎng)1周后腹腔注射氯胺酮(10 mg/100 g)麻醉，打開腹腔，于距離回盲部5 cm處切取回腸腸管約2 cm，用0.9% NaCl注射液沖洗，取一段放入甲醛固定液，用于光鏡病理切片；另一段用刀片在黏膜側(cè)切取約1 mm3組織3塊，放入2.5%中性戊二醛中固定，用于電鏡切片。另兩組腸組織采集同對照組。

1.3 檢測項(xiàng)目及方法

1.3.1 ELISA法測定患者血漿DAO、D-乳酸及IFABP 操作步驟按試劑說明書進(jìn)行，先測定不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品的光密度(D)值，繪制濃度—光密度標(biāo)準(zhǔn)曲線，再測定樣品光密度并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算成相應(yīng)的濃度。若樣品濃度超過標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍則將樣品成倍稀釋。

1.3.2 腸黏膜病理切片制作及觀察 從固定液中取出腸組織，梯度乙醇脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋、切片機(jī)切片，再行HE染色。光鏡下每個(gè)切片先低倍鏡后高倍鏡分別觀察，以病變最嚴(yán)重者作該組織的病理評分。

腸黏膜病理以Chiu氏評分[5]評估：5 分，固有膜結(jié)構(gòu)消失并有明顯組織出血及潰瘍；4 分，固有膜和絨毛組織脫落，伴隨固有膜細(xì)胞結(jié)構(gòu)模糊；3 分，腸黏膜與黏膜下層分離，絨毛呈現(xiàn)傾倒、部分絨毛頂端脫落；2 分，腸上皮層與固有層分離；1分，絨毛處腸黏膜上皮下間隙增大；0分，正常小腸黏膜絨毛組織形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)。

1.3.3 腸組織電鏡制片及觀察 從電鏡固定液中取出腸組織，漂洗后置于1% 鋨酸固定液1.5～2 h；漂洗3次，每次10 min；經(jīng)30%、50%、70%、90%及100%乙醇逐級梯度脫水；純樹脂進(jìn)行樹脂滲透，每級3～4 h；用包埋模具、Epon 812純樹脂包埋；在電熱鼓風(fēng)干燥箱中加熱聚合固化；超薄切片機(jī)切片；雙蒸水沖洗、干燥；電鏡觀察、采集圖像。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

2 結(jié)果

2.1 患者血漿DAO、D-乳酸及IFABP水平比較

ERAS組和傳統(tǒng)組術(shù)后1 d血漿DAO、D-乳酸及IFABP水平顯著高于術(shù)前(P均<0.01)。與傳統(tǒng)組相比，ERAS組術(shù)后1、3、5 d DAO水平，術(shù)后3、5 d D-乳酸水平，術(shù)后1、3 d血漿IFABP水平均明顯降低(P<0.01或0.05)。ERAS組術(shù)后1 d血漿DAO升高，至術(shù)后5 d仍高于術(shù)前(P<0.05或0.01)；術(shù)后5 d D-乳酸與術(shù)前比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，傳統(tǒng)組仍明顯高于術(shù)前(P<0.05)；血漿IFABP水平，ERAS組術(shù)后3 d與術(shù)前比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，傳統(tǒng)組術(shù)后3 d仍明顯高于術(shù)前(P<0.05)。見圖1。

a：P<0.05，b：P<0.01，與同組術(shù)前比較；c：P<0.05，d：P<0.01，與同時(shí)間點(diǎn)傳統(tǒng)組比較圖1 兩組患者血漿DAO、D-乳酸和IFABP水平比較

2.2 大鼠腸黏膜病理變化

由圖2可見，術(shù)后兩組大鼠腸黏膜損傷程度不同。傳統(tǒng)組術(shù)后24 h顯示絨毛傾倒、脫落，術(shù)后72 h絨毛部分修復(fù)，但腸黏膜上皮細(xì)胞下間隙增大；ERAS組術(shù)后24 h顯示腸系膜上皮細(xì)胞層與固有層分離，術(shù)后72 h絨毛組織結(jié)構(gòu)已完整，但淋巴細(xì)胞浸潤增多。對照組的腸黏膜絨毛組織結(jié)構(gòu)正常。

對照組腸黏膜病理評分為0分。ERAS組術(shù)后24 h及72 h腸黏膜病理評分均明顯低于傳統(tǒng)組(P<0.05)。見表2。

表2 兩組大鼠回腸黏膜病理評分

2.3 大鼠腸黏膜上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化

超微結(jié)構(gòu)顯示，兩組大鼠腸上皮細(xì)胞以及緊密連接破壞程度不同。傳統(tǒng)組術(shù)后24 h上皮細(xì)胞壞死，微絨毛脫落；72 h微絨毛部分恢復(fù)，但微絨毛很短，緊密連接仍消失。ERAS組術(shù)后24 h上皮細(xì)胞大體結(jié)構(gòu)及細(xì)胞器清晰，只微絨毛部分脫落和上皮細(xì)胞間連接線模糊；術(shù)后72 h微絨毛稍短，已可見部分緊密連接。對照組細(xì)胞間界線清晰，細(xì)胞微絨毛細(xì)長、排列整齊，緊密連接完整，細(xì)胞間連接復(fù)合體結(jié)構(gòu)清晰。見圖3。

圖3 各組大鼠腸上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)

3 討論

臨床上多種因素可導(dǎo)致腸黏膜屏障不同程度損傷，腹部大手術(shù)患者更有不同程度的腸屏障受損[6]。DAO主要存在于腸黏膜絨毛上皮細(xì)胞中，是一種胞內(nèi)酶[7]，IFABP亦主要存在于腸上皮細(xì)胞，多位于細(xì)胞胞質(zhì)，二者都能較好地反映腸上皮細(xì)胞損傷[8]。

在哺乳動物中，D-乳酸是腸道許多細(xì)菌的代謝產(chǎn)物，且在體內(nèi)不能再被降解、代謝，當(dāng)腸黏膜屏障受損時(shí)，D-乳酸則以最終產(chǎn)物進(jìn)入血液，檢測其外周血水平亦可反映腸黏膜屏障受損程度[9]。有研究比較腹腔鏡與開腹胃癌手術(shù)患者術(shù)前1 d及術(shù)后第1、3、7 d的血漿DAO和L-乳酸水平，結(jié)果顯示上述各時(shí)間點(diǎn)二者水平均無差異，因此腹腔鏡胃切除手術(shù)亦可造成腸屏障功能損傷[10]。本研究病例均采用腹腔鏡行胃切除術(shù)，結(jié)果顯示，ERAS組和傳統(tǒng)組術(shù)后1 d血漿DAO、D-乳酸及IFABP水平均顯著高于術(shù)前，提示胃切除術(shù)可損害腸屏障功能。近年來，研究認(rèn)為在反映腸黏膜細(xì)胞破壞的指標(biāo)中，IFABP特異性和敏感性高，因其半衰期短，在血液中的峰值時(shí)間較短，是反映腸屏障功能障礙的早期指標(biāo)，更具臨床應(yīng)用價(jià)值[11]。本研究亦發(fā)現(xiàn)術(shù)后1 d血漿IFABP水平明顯增高，其后下降速度較DAO和D-乳酸快，ERAS組在術(shù)后3 d已接近正常，因此IFABP易早期檢測。

腸黏膜的組織學(xué)結(jié)構(gòu)是腸屏障的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，主要包括腸上皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞間的緊密連接、黏膜固有層等，其中上皮細(xì)胞間的緊密連接對腸屏障功能影響最大，它可以封閉細(xì)胞之間的間隙，防止腸道中的共生微生物和致病微生物的侵襲[12]。本研究ERAS組及傳統(tǒng)組胃切除術(shù)后腸黏膜均有不同程度損傷，表現(xiàn)為腸黏膜上皮細(xì)胞下間隙增大、上皮細(xì)胞層與固有層分離，嚴(yán)重者有絨毛破壞、脫落；超微結(jié)構(gòu)顯示腸上皮細(xì)胞可發(fā)生變性、壞死，腸上皮細(xì)胞間緊密連接完整性受損。

ERAS的主要目的是盡快實(shí)現(xiàn)術(shù)后機(jī)體生理狀態(tài)和全身多器官功能包括腸道功能康復(fù)。2014年歐洲制定首個(gè)《胃切除術(shù)加速康復(fù)外科指南》[13]，該指南有關(guān)ERAS圍術(shù)期營養(yǎng)管理的要素亦提倡術(shù)前口服碳水化合物及術(shù)后早期腸內(nèi)營養(yǎng)。有研究將術(shù)前口服碳水化合物大鼠與術(shù)前單純飲水大鼠作比較，前者在缺血再灌注情況下肝、腎和腸系膜淋巴結(jié)中細(xì)菌含量降低[14]；胃切除術(shù)后第1天進(jìn)食有助于促進(jìn)術(shù)后腸蠕動、動力恢復(fù)，且不增加術(shù)后并發(fā)癥和病死率[15]。上述研究結(jié)果表明，術(shù)前碳水化合物及術(shù)后早期腸內(nèi)營養(yǎng)對腸功能恢復(fù)有益。本研究中ERAS組按圍術(shù)期營養(yǎng)管理要求，術(shù)前6 h和術(shù)前2 h口服碳水化合物，術(shù)后早期腸內(nèi)營養(yǎng)，結(jié)果顯示ERAS組血漿DAO水平術(shù)后1、3和5 d均低于傳統(tǒng)組，血漿D-乳酸水平術(shù)后3 d和5 d低于傳統(tǒng)組，血漿IFABP水平術(shù)后1 d和3 d低于傳統(tǒng)組，提示ERAS圍術(shù)期營養(yǎng)管理有利于腸道功能快速康復(fù)。

此外，本研究顯示ERAS組術(shù)后24 h腸黏膜病理評分明顯低于傳統(tǒng)組，上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)及緊密連接破壞程度較輕；術(shù)后72 h兩組腸黏膜超微結(jié)構(gòu)均有改善，且ERAS組病理評分亦明顯低于傳統(tǒng)組，上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)及緊密連接改善亦較明顯，說明ERAS組腸黏膜損傷恢復(fù)更快，提示ERAS圍術(shù)期營養(yǎng)管理有利于減輕腸黏膜病理及上皮細(xì)胞緊密連接的損傷并促進(jìn)其修復(fù)。早期腸內(nèi)營養(yǎng)能直接為腸道黏膜提供營養(yǎng)物質(zhì)、刺激腸蠕動增加、盡快恢復(fù)腸黏膜血流、減少腸道原籍菌移位、刺激腸腺分泌，因而能減輕腸黏膜應(yīng)激損傷并能促進(jìn)腸黏膜增生和修復(fù)[16]。

綜上所述，ERAS圍術(shù)期營養(yǎng)管理能減輕腸道黏膜物理屏障損傷，有利于腸道屏障結(jié)構(gòu)和功能的盡早恢復(fù)。