張力蛋白1抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖和侵襲

任琎，曹一鑫，王德強(qiáng)，莊秀芬，李小琴

(江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，江蘇 鎮(zhèn)江 212001)

非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)是最主要的肺癌類型，復(fù)發(fā)率高，預(yù)后差[1-2]。抑癌基因的缺失與肺癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[3-4]。張力蛋白(tensin,TNS)家族是一種多結(jié)構(gòu)域蛋白，可與細(xì)胞膜交互作用，是聯(lián)系細(xì)胞外基質(zhì)、肌動(dòng)蛋白骨架的重要成分，亦可結(jié)合酪氨酸激酶受體，影響細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，在細(xì)胞黏附、運(yùn)動(dòng)、生長(zhǎng)等細(xì)胞生物學(xué)活動(dòng)中發(fā)揮著重要的作用[5]。TNS1是一種定位于胞質(zhì)灶性黏附區(qū)域的磷酸蛋白[6]。已有研究報(bào)道，TNS1與乳腺癌、胃癌轉(zhuǎn)移有關(guān)，并顯著影響乳腺癌、胃癌患者的預(yù)后[7-8]。然而，TNS1在NSCLC發(fā)病過(guò)程中是否發(fā)揮作用目前并不清楚。本研究通過(guò)比較TNS1在NSCLC組織和細(xì)胞中的表達(dá)，分析其與NSCLC患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系；探討外源性上調(diào)TNS1表達(dá)對(duì)NSCLC細(xì)胞生物學(xué)功能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病例 收集2010年1月至2015年12月于江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院胸外科行部分肺葉切除的56例NSCLC患者肺癌組織及癌旁組織(距離腫瘤邊緣>5 cm)。其中，男35例，女21例。年齡18～78歲，所有患者術(shù)前均未行放療、化療，所有標(biāo)本均經(jīng)過(guò)病理證實(shí)。其中，鱗癌23例，腺癌33例。本研究通過(guò)江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均知情同意。

1.1.2 試劑及儀器 人正常支氣管上皮16HBE、人肺腺癌A549和H1299細(xì)胞均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所；RPMI 1640培養(yǎng)基、DMEM、小牛血清(美國(guó)Hyclone公司)；MTT(美國(guó)Sigma公司)；過(guò)表達(dá)TNS1的質(zhì)粒(pcDNA3.1/TNS1)及相應(yīng)的空載質(zhì)粒(pcDNA3.1)購(gòu)自上海英駿生物技術(shù)有限公司；脂質(zhì)體Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑(美國(guó)Invitrogen公司)；熒光實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)試劑盒(日本TaKaRa公司)；羊抗人TNS1單抗(美國(guó)Abcam公司)；兔抗人E-鈣黏蛋白、波形蛋白單抗(美國(guó)BD Biosciences公司)；羊抗兔HRP耦聯(lián)二抗(美國(guó)Santa Cruz公司)。

1.2 方法

1.2.1 A549和H1299肺癌細(xì)胞培養(yǎng)、分組與轉(zhuǎn)染 在37 ℃、5% CO2條件下，將A549和H1299細(xì)胞置于含10%小牛血清的1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)；16HBE細(xì)胞置于含10%小牛血清的DMEM中培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A549和H1299細(xì)胞，并于轉(zhuǎn)染前24 h 接種至6孔板(3×105個(gè)/孔)，待細(xì)胞生長(zhǎng)融合度達(dá)70%～80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。依照轉(zhuǎn)染說(shuō)明書(shū)，將4 μg過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入A549和H1299細(xì)胞中(分別命名為A549/pcDNA3.1/TNS1和H1299/pcDNA3.1/TNS1)，另轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒pcDNA3.1作為陰性對(duì)照組(分別命名為A549/pcDNA3.1和H1299/pcDNA3.1)，用于后續(xù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。

1.2.2 qRT-PCR檢測(cè)TNS1mRNA表達(dá) 通過(guò)Tri-zol提取組織和細(xì)胞總RNA，行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，然后對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增。GAPDH引物序列上游：5′-GCAAATTCCATGGCACGTC-3′，下游：5′-TCGCCCCACTTGATTTTGG-3′；TNS1引物序列上游：5′-GTGCAAAGGGGACTGAATTCG-3′，下游：5′-GGCTACAAGACTCTCCAAGTGG-3′[9]。PCR 反應(yīng)條件：90 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。以GAPDH作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算TNS1mRNA相對(duì)表達(dá)量。根據(jù)NSCLC組織中TNS1mRNA相對(duì)表達(dá)量的中位數(shù)，將NSCLC 患者分為T(mén)NS1低表達(dá)組(≤中位數(shù))和高表達(dá)組(>中位數(shù))。

1.2.3 MTT比色法實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞抑制率 取“1.2.1”轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞，接種于96孔板，每孔2×103個(gè)，每組6個(gè)復(fù)孔，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h；每孔加MTT 10 μL，37 ℃孵育4 h；棄上清液，加DMSO 150 μL/孔，振蕩溶解10 min；待紫色結(jié)晶完全溶解后，于酶標(biāo)儀490 nm處檢測(cè)各孔光密度(D)值，計(jì)算細(xì)胞抑制率。細(xì)胞抑制率(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組D值/對(duì)照組D值)×100%。

1.2.4 細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力 取“1.2.1”細(xì)胞，按1×103個(gè)/孔接種于6孔板中，置于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育10～14 d；純甲醇固定10 min；加入0.1%結(jié)晶紫染液，室溫染色10～15 min；孔板洗凈并干燥后，肉眼計(jì)數(shù)克隆數(shù)。

1.2.5 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力 取“1.2.1”轉(zhuǎn)染后細(xì)胞，接種于6孔板，每孔5×105個(gè)細(xì)胞，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)過(guò)夜；待細(xì)胞融合度為80%～90%時(shí)，棄培養(yǎng)基并用滅菌的200 μL加樣槍頭在單層細(xì)胞上中間縱向垂直劃痕；用PBS輕柔清洗細(xì)胞3次，去除劃下的細(xì)胞；每孔加入含10 %胎牛血清的1640培養(yǎng)液2 mL；分別于0、24和48 h在高倍鏡下(100×)隨機(jī)取6個(gè)視野劃痕處拍照。遷移率=(遷移前兩線間的長(zhǎng)度-遷移后兩線間的長(zhǎng)度)/遷移前兩線間的長(zhǎng)度×100%。

1.2.6 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的侵襲能力 取“1.2.1”轉(zhuǎn)染后細(xì)胞，以無(wú)血清1640培養(yǎng)液重懸，Transwell培養(yǎng)板上室內(nèi)加入300 μL細(xì)胞懸液(5×104個(gè))，下室加入1 mL含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液；培養(yǎng)48 h后取出小室，用濕棉簽擦去內(nèi)部基底膜上表面的細(xì)胞，預(yù)冷甲醇固定30 min，蘇木精染色1 min，在高倍鏡下(400×)隨機(jī)取6個(gè)視野計(jì)數(shù)，取平均數(shù)。

1.2.7 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)細(xì)胞TNS1、E-鈣黏蛋白和波形蛋白表達(dá) 用全蛋白裂解液提取待測(cè)細(xì)胞總蛋白，冰浴30 min，離心后取上清液，BCA法行蛋白定量；分別取50 μg樣品行SDS-PAGE，60 mA電泳4 h；電壓80 V將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜；5%脫脂奶粉室溫封閉1 h；加入相應(yīng)一抗TNS1 (1 ∶100)、E-鈣黏蛋白(1 ∶250)、波形蛋白(1 ∶200)、GAPDH(1 ∶1 000，內(nèi)參)，4 ℃孵育過(guò)夜；TBST漂洗4次，每次10 min；加入相應(yīng)二抗(1 ∶3 000)室溫孵育2 h；ECL敏感發(fā)光試劑(美國(guó)Invitrogen公司)，曝光顯影。采用Image J軟件處理結(jié)果圖像。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 TNS1 mRNA在NSCLC癌組織中的表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系

如圖1所示，與癌旁組織相比，NSCLC癌組織中TNS1mRNA表達(dá)明顯下降(t=-2.195，P<0.05)。由表1可見(jiàn)，TNS1mRNA表達(dá)量與NSCLC 患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及術(shù)后遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)(χ2=4.45和7.42，P均<0.05)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及術(shù)后出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者TNS1mRNA呈低表達(dá)，而性別、年齡、吸煙史、腫瘤直徑、病理分型、術(shù)后TNM分期與TNS1mRNA表達(dá)水平未見(jiàn)明顯相關(guān)(P均>0.05)。

表1 TNS1 mRNA表達(dá)與NSCLC患者臨床病理特征的關(guān)系

圖1 qRT-PCR檢測(cè)NSCLC癌旁組織和癌組織中TNS1 mRNA表達(dá)

2.2 NSCLC癌組織中TNS1表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系

在TCGA數(shù)據(jù)中，TNS1mRNA高表達(dá)肺腺癌患者的總體生存率顯著優(yōu)于TNS1mRNA低表達(dá)肺腺癌患者(P=0.019)，見(jiàn)圖2。

圖2 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中TNS1 mRNA高表達(dá)與低表達(dá)肺腺癌患者的總體生存曲線

進(jìn)一步對(duì)我院56例肺腺癌術(shù)后患者進(jìn)行隨訪，隨訪時(shí)間為3.5～47.3個(gè)月，中位隨訪時(shí)間為21.3個(gè)月。TNS1mRNA高表達(dá)患者3年累積無(wú)病生存率和累積總體生存率明顯優(yōu)于TNS1mRNA低表達(dá)患者(χ2=5.770和3.950，P=0.016和0.047)。見(jiàn)圖3。

圖3 NSCLC癌組織中TNS1 mRNA高表達(dá)與低表達(dá)患者的累積無(wú)病生存曲線和累積總體生存曲線

2.3 TNS1在不同肺癌細(xì)胞中的表達(dá)

由圖4可見(jiàn)，A549和H1299細(xì)胞中TNS1mRNA和蛋白表達(dá)量明顯低于16HBE細(xì)胞(P均<0.01)。質(zhì)粒pcDNA3.1/TNS1轉(zhuǎn)染A549和H1299細(xì)胞48 h后，qRT-PCR檢測(cè)顯示，A549/pcDNA3.1/TNS1和H1299/pcDNA3.1/TNS1組細(xì)胞TNS1mRNA和蛋白表達(dá)量明顯高于相應(yīng)對(duì)照組 (P均<0.01)。

①：A549/pcDNA3.1;②：A549/pcDNA3.1/TNS1;③:H1299/pcDNA3.1;④:H1299/pcDNA3.1/TNS1圖4 qRT PCR和蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)不同細(xì)胞中TNS1 mRNA和蛋白表達(dá)

2.4 TNS1對(duì)A549和H1299細(xì)胞增殖能力的影響

由圖5可見(jiàn)，在48、72 h，A549/pcDNA3.1/TNS1和H1299/pcDNA3.1/TNS1組細(xì)胞增殖能力均明顯低于對(duì)照組(P<0.05和P<0.01)，表明pcDNA3.1/TNS1轉(zhuǎn)染組細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)顯示轉(zhuǎn)染pcDNA3.1/TNS1組A549細(xì)胞和H1299細(xì)胞克隆形成能力均明顯低于對(duì)照組(t=-7.865和-8.877，P均<0.01)，見(jiàn)圖6。由此可見(jiàn)，TNS1可抑制A549和H1299細(xì)胞的增殖能力。

a：P<0.05，b：P<0.01，與同時(shí)間點(diǎn)A549/pcDNA3.1比較；c：P<0.05，d：P<0.01，與同時(shí)間點(diǎn)H1299/pcDNA3.1比較圖5 MTT法檢測(cè)A549和H1299細(xì)胞增殖能力

圖6 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)A549和H1299細(xì)胞增殖能力

2.5 TNS1對(duì)A549和H1299細(xì)胞遷移能力的影響

細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在24、48 h，與對(duì)照組相比，A549/pcDNA3.1/TNS1和H1299/pcDNA3.1/TNS1組細(xì)胞遷移細(xì)胞數(shù)量明顯減少，遷移速度明顯減慢(P均<0.01) ，見(jiàn)圖7。由此說(shuō)明，上調(diào)TNS1表達(dá)可明顯抑制A549和H1299細(xì)胞的遷移能力。

①：A549/pcDNA3.1；②：A549/pcDNA3.1/TNS1；③：H1299/pcDNA3.1；④：H1299/pcDNA3.1/TNS1圖7 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)A549和H1299細(xì)胞遷移能力

2.6 TNS1對(duì)A549和H1299細(xì)胞侵襲能力的影響

Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，A549/pcDNA3.1/TNS1和H1299/pcDNA3.1/TNS1組穿透基膜的細(xì)胞數(shù)明顯減少(t=-6.585和-7.637，P<均0.01)。由此說(shuō)明，上調(diào)TNS1表達(dá)可明顯抑制A549和H1299細(xì)胞的侵襲能力。見(jiàn)圖8。

圖8 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)A549和H1299細(xì)胞的侵襲能力(×200)

2.7 TNS1 mRNA對(duì)E-鈣黏蛋白和波形蛋白的調(diào)控作用

蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，A549/pcDNA3.1/TNS1和H1299/pcDNA3.1/TNS1組細(xì)胞中E-鈣黏蛋白表達(dá)水平明顯增加(t=3.112和3.579，P均<0.01)，波形蛋白表達(dá)明顯降低(t=-4.757和-3.187，P均<0.01)。見(jiàn)圖9。

①：A549/pcDNA3.1;②:A549/pcDNA3.1/TNS1；③ H1299/pcDNA3.1;④ H1299/pcDNA3.1/TNS1圖9 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)E-鈣黏蛋白和波形蛋白表達(dá)

3 討論

以往研究表明，TNS參與調(diào)節(jié)多種腫瘤細(xì)胞生物學(xué)活動(dòng)，包括細(xì)胞黏附、遷移、增殖等，與腫瘤患者預(yù)后相關(guān)[10]。Zhan等[7]研究發(fā)現(xiàn)，TNS1在轉(zhuǎn)移性乳腺癌組織中表達(dá)顯著降低，且TNS1高表達(dá)患者無(wú)轉(zhuǎn)移生存時(shí)間顯著長(zhǎng)于低表達(dá)患者。曹一鑫等[8]報(bào)道胃癌腫瘤轉(zhuǎn)移患者TNS1蛋白表達(dá)率低于未發(fā)生轉(zhuǎn)移患者，是胃癌獨(dú)立的保護(hù)性預(yù)后因素。本研究發(fā)現(xiàn)，TNS1mRNA在NSCLC組織中的表達(dá)低于癌旁組織，且與NSCLC患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及術(shù)后腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是預(yù)后不良的表現(xiàn)，由此提示TNS1可能參與NSCLC細(xì)胞增殖與轉(zhuǎn)移。此外，TNS1mRNA高表達(dá)患者3年累積無(wú)病生存率和累積總體生存率均優(yōu)于低表達(dá)患者。由此表明，TNS1mRNA低表達(dá)促進(jìn)肺癌患者術(shù)后復(fù)發(fā),與患者不良預(yù)后有關(guān)。

此外，本研究體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，上調(diào)TNS1表達(dá)可顯著抑制肺癌A549和H1299細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力。有研究發(fā)現(xiàn)，攜帶TNS1特定突變基因型的乳腺癌MDA-MB231細(xì)胞系遷移和侵襲能力增強(qiáng)[6]，提示TNS1可抑制乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。Zhan等[7]研究亦證實(shí)，干擾TNS1表達(dá)可增強(qiáng)多種乳腺癌細(xì)胞系的侵襲能力，與乳腺癌細(xì)胞增殖及侵襲活性密切相關(guān)。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)與腫瘤細(xì)胞的原位侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有著密切關(guān)系[11]。當(dāng)腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT，表現(xiàn)為上皮表型如角絲蛋白、E-鈣黏蛋白逐漸喪失，而間質(zhì)表型如波形蛋白、纖維連接蛋白、N-鈣黏蛋白的表達(dá)增加，與周圍細(xì)胞和基質(zhì)接觸減弱，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞遷移和運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng)[12]。EMT是腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵機(jī)制，本研究結(jié)果顯示，TNS1高表達(dá)可引起NSCLC細(xì)胞E-鈣黏蛋白表達(dá)上調(diào)和波形蛋白表達(dá)下降，從而推測(cè)TNS1高表達(dá)可抑制EMT過(guò)程，負(fù)性調(diào)控NSCLC細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移。腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移涉及多種細(xì)胞因子和多條信號(hào)傳導(dǎo)通路，Shinde 等[13]研究表明，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶-2和TNS1共同參與乳腺癌細(xì)胞EMT的過(guò)程。Zhan等[7]研究證實(shí)，乳腺癌細(xì)胞中TNS1表達(dá)下降促進(jìn)Rho-GTP酶家族成員Cdc42基因活化，Cdc42可能是TNS1影響乳腺癌腫瘤細(xì)胞增殖能力的靶基因。關(guān)于TNS1對(duì)NSCLC細(xì)胞轉(zhuǎn)移具體的調(diào)控機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，TNS1在NSCLC組織中呈低表達(dá)，且與肺癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、術(shù)后遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及患者的不良預(yù)后有關(guān)，其可抑制肺癌細(xì)胞增殖和遷移，提示TNS1可作為NSCLC轉(zhuǎn)移發(fā)生的潛在指標(biāo)。