大熊貓犬瘟熱病毒（CDV－PA－1421 株）微載體懸浮培養(yǎng)工藝研究

劉 靜李艷玲朱明媛谷孝玉李 潤(rùn)

（唐山怡安生物工程有限公司，河北唐山063020）

犬瘟熱（Canine distemper，CD）是由犬瘟熱病毒（Canine distemper virus，CDV）引起的一種急性、高度接觸性傳染病，有較高發(fā)病率和病死率，臨床上以厭食、雙相熱、結(jié)膜炎、嚴(yán)重的胃腸炎和神經(jīng)癥狀為典型特征。 大熊貓是我國(guó)重點(diǎn)保護(hù)瀕危珍稀野生動(dòng)物，隨著犬瘟熱感染宿主范圍的日益擴(kuò)大，從1983 年開始，享有“活化石”之稱的國(guó)寶大熊貓也相繼有感染犬瘟熱死亡的報(bào)道。 2014 年12 月至2015 年樓觀臺(tái)秦嶺大熊貓繁育基地，6 只被CDV感染的大熊貓中有5 只死亡，幸存的1 只因早前接種過CDV 疫苗，體內(nèi)存在CDV 中和抗體，未表現(xiàn)臨床癥狀，這表明中和抗體可以使大熊貓免受CDV強(qiáng)毒的致死性攻擊［1－2］。 因此，及時(shí)進(jìn)行疫苗免疫是防控犬瘟熱病的關(guān)鍵措施，可提高大熊貓的抵抗力［3－4］。

目前，國(guó)內(nèi)外用于大熊貓CDV 免疫預(yù)防的疫苗主要有三類：（1）弱毒疫苗。 弱毒疫苗已在國(guó)內(nèi)外普遍應(yīng)用并取得了一定的效果，但弱毒疫苗接種后保護(hù)效果較弱或安全性不足［5］。 （2）基因工程疫苗。 基因工程疫苗相對(duì)而言比較安全，僅能在哺乳類動(dòng)物機(jī)體發(fā)生復(fù)制，不能產(chǎn)生感染［6］，但免疫持續(xù)期短，不能產(chǎn)生足夠的記憶細(xì)胞維持長(zhǎng)期免疫力［7］。 （3）滅活疫苗。 國(guó)內(nèi)部分動(dòng)物園使用該苗作為大熊貓的預(yù)防疫苗，多年來未發(fā)現(xiàn)任何臨床CDV 病例，也未出現(xiàn)疫苗源性的安全問題，但目前還沒有熊貓?jiān)葱缘娜翢釡缁钜呙纾嗦?lián)苗在疫病防控上效果欠佳，因此，研發(fā)大熊貓犬瘟熱專用滅活疫苗迫在眉睫。 本研究采用正交試驗(yàn)確定Vero細(xì)胞培養(yǎng)、MOI、pH 值、溫度、收獲時(shí)間等工藝參數(shù)，建立大熊貓犬瘟熱滅活疫苗（CDV －PA －1421株） 的懸浮培養(yǎng)工藝，制備高質(zhì)量的大熊貓犬瘟熱滅活疫苗。

1 材料和方法

1．1 試驗(yàn)材料 Vero 細(xì)胞，批號(hào)Vero－B0402－002，130 代，由唐山怡安生物工程有限公司制備并貯存。 大熊貓犬瘟熱病毒（CDV－PA－1421 株），保存于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心（保藏號(hào)：18179）。 MSVP 培養(yǎng)基購(gòu)于上海源培生物科技股份有限公司，胰蛋白酶購(gòu)于GIBCO，新生牛血清購(gòu)于蘭州民海生物公司，谷氨酰胺購(gòu)于Invitrogen，微載體Cytodex 1 購(gòu)于GE。 生物反應(yīng)器（C－10 －2 CC 型）購(gòu)自德國(guó)Sartorius。 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，18 ～22 g 小鼠10 只，購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司。

1．2 方法

1．2．1 Vero 細(xì)胞微載體培養(yǎng)參數(shù) 采用正交試驗(yàn)，選擇細(xì)胞接種濃度、微載體濃度、細(xì)胞生長(zhǎng)液3 個(gè)影響細(xì)胞增殖的因素，每個(gè)因素設(shè)置3 個(gè)水平條件（表1）。 通過選擇的條件進(jìn)行Vero 細(xì)胞培養(yǎng)，37 ℃培養(yǎng)96 ～168 h 后進(jìn)行計(jì)數(shù)，根據(jù)最高細(xì)胞密度，比較不同因素對(duì)細(xì)胞增殖的影響。

表1 Vero 細(xì)胞微載體培養(yǎng)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表Tab 1 Orthogonal experiment design table of Vero cell microcarrier culture

1．2．2 病毒培養(yǎng)條件 采用正交試驗(yàn)確定病毒培養(yǎng)條件，選擇不同MOI、pH 值、溫度、收獲時(shí)間4 個(gè)因素，每個(gè)因素分別設(shè)置不同水平（表2）。 根據(jù)最高病毒含量，比較不同因素和水平對(duì)病毒增殖的影響。

表2 大熊貓犬瘟熱病毒正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表Tab 2 Orthogonal experiment design table of giant panda canine distemper virus

1．2．3 10L 反應(yīng)器病毒培養(yǎng)工藝驗(yàn)證 根據(jù)確定培養(yǎng)條件，將長(zhǎng)成單層的Vero 細(xì)胞消化，接種到10L 反應(yīng)器中，加入細(xì)胞生長(zhǎng)液至工作體積。 待細(xì)胞長(zhǎng)成單層后，接種大熊貓犬瘟熱（CDV －PA －1421株）毒種，在37 ℃pH7．2 條件下培養(yǎng)96 ～120 h，觀察細(xì)胞病變（CPE）。 CPE 達(dá)到70% ～80%時(shí)收獲上清液，按Reed －Muench 法計(jì)算其半數(shù)細(xì)胞感染量（TCID50），檢測(cè)病毒含量。 連續(xù)培養(yǎng)3 批病毒，驗(yàn)證工藝的穩(wěn)定性。

1．2．4 疫苗制備及檢驗(yàn) 將收獲液過濾去除細(xì)胞碎片后，經(jīng)澄清、濃縮、滅活、配比、分裝等工序，獲得大熊貓犬瘟熱病毒滅活疫苗（CDV－PA－1421 株），參照《中國(guó)獸藥典》（2015 年版）進(jìn)行性狀、裝量、無(wú)菌、pH 值、安全檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2．1 Vero 細(xì)胞微載體培養(yǎng)條件 對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行極差分析可知（表3），影響細(xì)胞增殖的因素細(xì)胞接種濃度＞微載體濃度＞細(xì)胞生長(zhǎng)液，優(yōu)水平組合為A2B2C3，即細(xì)胞接種濃度0．2×106～0．4×106／mL、微載體濃度8．0 g／L、細(xì)胞生長(zhǎng)液MSVP。 方差分析結(jié)果顯示（表4），細(xì)胞接種濃度、微載體濃度對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響高度顯著，細(xì)胞生長(zhǎng)液無(wú)顯著影響。

表3 Vero 細(xì)胞微載體培養(yǎng)極差分析Tab 3 Range analysis of Vero cell microcarrier culture

表4 Vero 細(xì)胞微載體培養(yǎng)方差分析Tab 4 Variance analysis of Vero cell microcarrier culture

2．2 病毒培養(yǎng)條件 對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行極差分析可知（表5），優(yōu)水平組合為A1B1C2D3，即MOI 0．01、溫度37 ℃、pH 7．2、收獲時(shí)間96 ～120 h，影響病毒增殖的因素，收獲時(shí)間＞MOI ＞溫度＞pH值。 方差分析結(jié)果顯示（表6），MOI、溫度、收獲時(shí)間對(duì)試驗(yàn)結(jié)果高度顯著，pH 值無(wú)顯著影響。

表5 大熊貓犬瘟熱病毒培養(yǎng)極差分析Tab 5 Range analysis of giant panda canine distemper virus

表6 大熊貓犬瘟熱病毒培養(yǎng)方差分析Tab 6 Variance analysis of giant panda canine distemper virus culture

2．3 工藝重復(fù)性驗(yàn)證 如圖1 所示，3 批收獲液病毒含量達(dá)到107．0～107．5TCID50／0．1 mL。

圖1 大熊貓犬瘟熱疫苗工藝重復(fù)性驗(yàn)證Fig 1 The repeatability test of the culture craft for canine distemper vaccine of giant pandas

2．4 疫苗檢驗(yàn) 經(jīng)檢驗(yàn)，大熊貓犬瘟熱滅活疫苗（CDV － PA －1421 株）性狀為乳白色至淡紅色液體，靜置后底部有白色沉淀，輕輕振搖，呈均勻懸液，pH 值為7．2。 使用18 ～22 g 小鼠10 只，腹腔注射，每只0．5 mL，觀察21 d，小鼠全部健活，沒有出現(xiàn)任何的局部和全身不良反應(yīng)。

3 結(jié)論與討論

犬瘟熱病毒自1809 年報(bào)道以來，在世界范圍內(nèi)廣泛流行［8］。 隨著CDV 毒株基因的不斷變異，宿主范圍已由犬和貓擴(kuò)大到其他哺乳動(dòng)物，尤其是瀕危的大熊貓［9］。 犬瘟熱已經(jīng)成為威脅大熊貓種群數(shù)量和生命安全的第一大烈性傳染?。?0－11］，然而現(xiàn)有犬瘟熱疫苗的免疫效果有所降低，針對(duì)熊貓?jiān)吹膶Ｓ靡呙绺乔啡?，迫切需要研發(fā)更為有效的疫苗制劑。 本研究所用大熊貓犬瘟熱病毒（CDV－PA－1421 株）是陳德坤團(tuán)隊(duì)2015 年提取分離的大熊貓犬瘟熱病毒陜西株，屬?gòu)?qiáng)毒株，與已發(fā)表CDV SD（14）11 毒株（亞洲－1 型）同源性為98%［12］，毒株十分寶貴。 本試驗(yàn)基于已有的大熊貓犬瘟熱攪拌瓶工藝參數(shù)，利用正交試驗(yàn)對(duì)培養(yǎng)基、細(xì)胞接種濃度、微載體濃度、pH 值、病毒MOI 等關(guān)鍵參數(shù)進(jìn)行研究，從而確定大熊貓犬瘟熱病毒（CDV－PA－1421 株）微載體懸浮培養(yǎng)工藝。

Vero 細(xì)胞微載體培養(yǎng)方差分析結(jié)果顯示：微載體濃度、細(xì)胞接種密度對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響高度顯著，但并不是細(xì)胞接種密度及微載體濃度越高越好。微載體濃度低時(shí)，細(xì)胞增殖受限，最高細(xì)胞密度較低。 微載體濃度過高，攪拌速度較大，對(duì)細(xì)胞造成損傷，不僅不利于細(xì)胞生長(zhǎng)，微載體成本也較高。此外，細(xì)胞接種密度為0．4 ×106／mL ～0．6 ×106／mL反而比0．2 ×106／mL ～0．4 ×106／mL 的最高細(xì)胞密度低。 這是由于過高的接種密度，會(huì)造成營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)過快耗竭，影響細(xì)胞增殖，更不利于后期的病毒繁殖。 細(xì)胞生長(zhǎng)液優(yōu)選條件為MSVP ＋1%血清，但是否添加血清對(duì)最高細(xì)胞密度影響較小，方差分析也顯示細(xì)胞生長(zhǎng)液對(duì)細(xì)胞增殖的影響不顯著。 此外，血清的添加也存在諸多問題：無(wú)論是進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)血清均可能存在外源病毒污染的風(fēng)險(xiǎn)，影響疫苗產(chǎn)品的安全性；血清白蛋白易吸附在微載體表面，細(xì)胞貼附率明顯下降；雜蛋白、激素、多肽等多種雜質(zhì)增大下游分離純化的難度。 因此，本試驗(yàn)選擇MSVP無(wú)血清培養(yǎng)基作生產(chǎn)培養(yǎng)基。

病毒培養(yǎng)方差分析顯示：MOI 對(duì)病毒增殖影響顯著，但0．01、0．03、0．1 結(jié)果差異較小，顯著性主要來自0．3 MOI 水平與其他水平的差距。 當(dāng)MOI大于0．3 時(shí)，細(xì)胞病變過快，細(xì)胞維持時(shí)間短，影響病毒增殖，最終收獲液的病毒含量偏低，從而確定最適MOI 為0．01 ～0．1。 溫度對(duì)病毒增殖影響顯著，37 ℃條件下的病毒含量明顯高于34 ℃。 收獲時(shí)間對(duì)病毒增殖影響高度顯著，培養(yǎng)96 ～120 h 病毒滴 度 高 于107．0TCID50／0． 1mL，與 水 貂 犬 瘟 熱（CDV3 －CL 株）在100 ～120 h 獲得高滴度病毒液一致［13］。

本研究確定大熊貓犬瘟熱病毒（CDV－PA－1421株）培養(yǎng)工藝為：將長(zhǎng)成單層的Vero 細(xì)胞消化，接種到10L 生物反應(yīng)器中，細(xì)胞接種濃度為0．2 ×106／mL ～0．4 ×106／mL，微載體濃度為8．0 g／L，細(xì)胞生長(zhǎng)液為MSVP 培養(yǎng)基。 按0． 01 ～0． 1MOI 接毒，37 ℃pH 值7．2 條件下培養(yǎng)96 ～120 h 收獲上清液，即可獲得高于107．0TCID50／0．1mL 的收獲液。 連續(xù)進(jìn)行3 批重復(fù)性驗(yàn)證結(jié)果顯示，病毒培養(yǎng)工藝穩(wěn)定，收獲液病毒含量在107．0～107．5TCID50／0．1mL，批間差異小，為大熊貓犬瘟熱滅活疫苗的研究奠定良好基礎(chǔ)。 由于大熊貓的保護(hù)限制，無(wú)法對(duì)其進(jìn)行犬瘟熱攻毒試驗(yàn)研究，難以確定大熊貓犬瘟熱特異性抗體保護(hù)效價(jià)，本研究將繼續(xù)利用制備的滅活疫苗免疫其他動(dòng)物，進(jìn)行異源精制抗體的研究，以期為大熊貓犬瘟熱的治療提供更多的解決方案。