白英質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)初步研究

陳錫龍，錢莘莘，孫真崢，王培峰，焦貴懷，郭 萍，周藝林，趙 貴

（貴州省獸藥飼料檢測(cè)所，貴陽(yáng)550003）

白英（Solanum lyratumThunb）為茄科植物白英的全草，俗稱白毛藤，性微寒，味苦，具有清熱解毒，袪風(fēng)除濕等功效［1］，用于治療感冒發(fā)熱、黃疸型肝炎、腎炎水腫、子宮頸糜爛、癌癥等疾病。 尤其對(duì)肺癌、胃癌、肝癌、宮頸癌等多種癌癥具有很好的療效［2］。 化學(xué)及現(xiàn)代藥理研究表明［3］，白英主要含皂苷類、甾體類化合物、有機(jī)酸、黃酮類等，是白英藥理作用的主要有效成分。 近年來，有關(guān)白英的研究主要集中在其抗腫瘤機(jī)制方面，如生物堿對(duì)人宮頸癌HeLa 細(xì)胞增殖的抑制作用［4］、抑制人神經(jīng)瘤母細(xì)胞系SH－SY5Y 細(xì)胞氧化活性［5］、影響肝癌Huh－7 細(xì)胞p38 和Caspase－3 的表達(dá)［6］，白英提取物具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖的活性，能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡［7］等。 白英是臨床上應(yīng)用較廣泛的抗腫瘤中草藥，需求量大，但對(duì)白英質(zhì)量控制研究仍處于初步階段［8］。 齊偉等［9］建立了HPLC 法同時(shí)測(cè)定白英中綠原酸和咖啡酸的含量，林世和［10］等建立了HPLC 法同時(shí)測(cè)定白英葉中綠原酸、咖啡酸及蘆丁的含量，孫立新［11］等建立了HPLC 法測(cè)定中藥白英中薯蕷皂苷元的含量，為白英質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立做了一些基礎(chǔ)性工作。 白英未收載入現(xiàn)行《中國(guó)藥典》中，雖收載于《獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》（2017 版中藥卷）［12］中，主治外感風(fēng)寒，濕熱黃疸，水腫，帯下；外治癰瘡腫毒。 但項(xiàng)下僅有性狀及鑒別，已經(jīng)不能滿足越來越多的臨床應(yīng)用及質(zhì)量控制需要。 本研究對(duì)上述文獻(xiàn)中測(cè)量白英新鮮藥材和飲片中綠原酸、咖啡酸的HPLC 法進(jìn)行了驗(yàn)證及比較，發(fā)現(xiàn)白英新鮮藥材和飲片中綠原酸的含量變化太大，不宜作為控制白英的質(zhì)量指標(biāo)；同時(shí)，借鑒了相關(guān)白英質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的薄層色譜鑒別方法等，較全面地建立了白英顯微、薄層鑒別，水分、灰分檢查，醇溶性浸出物以及藥材中咖啡酸含量測(cè)定方法，以期為白英的質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器和試藥

1．1 儀器 Agilent infinity LC1260 高效液相色譜儀（配紫外檢測(cè)器）；BP211D 型電子分析天平（德國(guó)塞多利斯公司）。

1．2 試藥 綠原酸對(duì)照品，中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，批號(hào)：Z0261702，含量：98．3%；咖啡酸對(duì)照品，中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110885 －200102，含量：100%；薯蕷皂苷元對(duì)照品，中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111539 －200001。 共收集到白英原生藥材及飲片15 批。 其中自行采集到原生藥6 批（所采集的藥材除少部分制成標(biāo)本供鑒別用外，其余部分均干燥粉碎后置磨口玻璃瓶中保存），5 批采自貴州省安順市平壩縣，1 批采自浙江省金華市，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源教研室魏升華教授鑒定均為白英。 9 批飲片分別購(gòu)于北京市、廣西玉林、貴陽(yáng)市的藥材公司，詳情見表1。 甲醇為色譜純；水為純凈水；其他試劑均為分析純。

表1 白英來源登記表Tab 1 Registration information of 15Solanum LyratumThunb． samples

2 方法與結(jié)果

2．1 性狀 本品長(zhǎng)1 ～4 cm，全株被毛，幼枝及葉上尤多。 根較細(xì)，稍彎曲，淺棕黃色。 莖圓柱形，稍有棱，灰綠色或灰黃色。 葉互生，葉片皺縮，易碎，完整者展平后呈長(zhǎng)卵形，長(zhǎng)3 ～8 cm，寬1 ～3． 5 cm；先端漸尖，基部心形，全緣或下部2 淺裂至中裂，裂片耳狀或戟狀；上表面棕綠色，下表面綠灰色；葉柄長(zhǎng)2 ～4 cm。 聚傘花序與葉互生，花序梗折曲狀，花冠5 裂，長(zhǎng)約5 mm，棕黃色。 漿果球形，直徑約1．2 cm，綠棕色至紅黑色，果皮薄，稍有光澤。種子扁圓形，直徑1．5 mm，氣微，味淡。

2．2 鑒別

2．2．1 顯微鑒別 本品粉末灰綠色。 石細(xì)胞淡黃色，類圓形、類方形、長(zhǎng)條形，直徑18 ～35 μm，長(zhǎng)45～130 μm，紋孔小，孔溝明顯。 纖維淡黃色或近無色，長(zhǎng)梭形，末端斜尖。 葉表皮細(xì)胞壁波狀彎曲，內(nèi)含草酸鈣方晶及砂晶，氣孔不定式。 非腺毛單細(xì)胞，完整者長(zhǎng)150 ～500 μm，直徑18 ～30 μm。

2．2．2 薄層鑒別 稱取本品粉末2．5 g，置250 mL具塞錐形瓶中，加入水13 mL，甲醇70 mL，再加入鹽酸17 mL，水浴加熱回流3 h，冷卻，過濾，取續(xù)濾液50 mL，用石油醚（60 ～90 ℃）萃取4 次，每次50 mL，分取石油醚層，回收石油醚層至干，加3 mL甲醇溶解，濾過（0．45 μm），作為供試品溶液。 另取薯蕷皂苷元對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL 含1 mg的溶液作為對(duì)照品溶液。 照薄層色譜法試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以環(huán)已烷－乙酸乙酯（2∶1）作為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%的硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。 供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)（圖1）。

2．2．3 樣品檢測(cè) 用新建立的方法分別對(duì)編號(hào)為1 ～15 號(hào)白英新鮮藥材或飲片樣品行薄層色譜鑒別試驗(yàn)，結(jié)果如圖1。 結(jié)果表明：白英新鮮藥材或飲片色譜中，在與薯蕷皂苷元對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。

圖1 白英及其飲片中薯蕷皂苷元的薄層色譜圖Fig 1 TLC chromatograms of diosgenin in raw material and decoction pieces of Solanum Lyratum Thunb．

2．3 檢查

2．3．1 水分 照水分測(cè)定法（《中國(guó)獸藥典》2015年版二部附錄0832 第一法［13］）測(cè)定不同產(chǎn)地13批樣品的含水量分別為8．71%、7．12%、5．52%、4．60%、4．60%、4．90%、5． 44%、6． 11%、8． 92%、7．60%、3．44%、2．88%、2．94%。 平均值為5．6%，以120%計(jì)水分應(yīng)為7．0%，故規(guī)定水分不得過7．0%。

2．3．2 總灰分 照總灰分測(cè)定法（《中國(guó)獸藥典》2015 年版二部附錄2302［13］）測(cè)定不同產(chǎn)地13 批樣品的總灰分分別為9． 42%、9． 78%、5． 82%、6．87%、12．20%、6．22%、5．94%、4．84%、5．24%、8．54%、5．48%、7．58%、8．00%。 平均值為7．4%，以120%計(jì)水分應(yīng)為9．0%，故規(guī)定總灰分不得過9．0%。

2．4 醇溶性浸出物 照醇溶性浸出物測(cè)定法（《中國(guó)獸藥典》2015 年版二部附錄2201［13］）測(cè)定，13 批不同產(chǎn)地樣品的醇溶性浸出物分別為4． 64%、5．68%、9．29%、6．56%、7． 35%、4． 47%、3． 72%、3．66%、3．78%、5．78%、5．37%、4．72%、4．24%。平均值為5．3%，以80%計(jì)水分應(yīng)為4．0%。 故規(guī)定醇溶性浸出物不得少于4．0%。

2．5 綠原酸、咖啡酸含量測(cè)定

2．5．1 溶液的制備

2．5．1．1 對(duì)照品貯備溶液的制備 取綠原酸和咖啡酸對(duì)照品適量，精密稱定，分別用75%的乙醇溶液制成每1 mL 含1．0 mg 的溶液，即得。

2．5．1．2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 分別精密量取上述對(duì)照品貯備溶液適量，逐級(jí)稀釋成每1 mL 含綠原酸5．0、20、50、200、1000 μg 和咖啡酸2．0、5．0、10．0、20．0、50．0 μg 的混合對(duì)照品溶液系列，精密吸取各對(duì)照品溶液5 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。分別以綠原酸和咖啡酸色譜峰面積為縱坐標(biāo)，其相應(yīng)濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2．5．1．3 供試品溶液的制備 取本品粉末約1．0 g，置250 mL 具塞三角瓶中，精密加入75%乙醇溶液10 mL，混勻，密塞，超聲處理30 min，取出，放冷。過0．45 μm 濾膜，濾液作為供試品溶液。

2．5．2 測(cè)定方法

2．5．2．1 色譜條件 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以0．4%磷酸溶液－乙腈（87∶13）為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為327 nm。 在此色譜條件下，綠原酸、咖啡酸對(duì)照品混合溶液及供試品溶液高效液相色譜圖見圖2。

圖2 綠原酸和咖啡酸混合對(duì)照品溶液及供試品溶液高效液相色譜圖Fig 2 HPLC chromatorams of chlorogenic acid and caffeic acid in referance substance andSolanum LyratumThunb． sample

2．5．2．2 線性及范圍 分別精密稱取綠原酸及咖啡酸對(duì)照品約10 mg（實(shí)際稱量10．17、9．99 mg），各置于一10 mL 量瓶中，加75%的乙醇溶液溶解并稀釋至刻度，得含綠原酸和咖啡酸對(duì)照品濃度均為1．0 mg／mL 的對(duì)照品貯備溶液，用該兩個(gè)對(duì)照品貯備溶液配制成含綠原酸濃度為5． 0、20、50、200、1000 μg／mL，咖啡酸濃度為2．0、5．0、10、20、50 μg／mL的混合對(duì)照品溶液系列，精密吸取各對(duì)照品溶液5 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。 分別以綠原酸或咖啡酸色譜峰面積（Area）， 對(duì)其相應(yīng)濃度（Amt， μg／mL）進(jìn)行線性回歸，求得回歸方程，可知綠原酸在5． 0 ～1000 μg／mL、咖啡酸在2． 0 ～50 μg／mL內(nèi)線性關(guān)系良好。 相關(guān)數(shù)據(jù)分別見表2。

表2 線性方程和相關(guān)系數(shù)Tab 2 Linear equation and related coefficient

2．5．2．3 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一混合對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6 次，測(cè)定綠原酸、咖啡酸峰面積，計(jì)算6 次進(jìn)樣峰面積的RSD分別為1．2%和0．2%，表明，方法精密度良好。

2．5．2．4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別在0、6、12、24 h 內(nèi)測(cè)定綠原酸、咖啡酸的峰面積，并計(jì)算峰面積的RSD分別為1．43%和1．16%，結(jié)果表明，在24 h 內(nèi)有較好的穩(wěn)定性。

2．5．2．5 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批白英粉末共5 份，按樣品溶液的制備方法制成供試品溶液，依法測(cè)定綠原酸、咖啡酸峰面積并計(jì)算RSD分別為1．12%和0．76%，表明方法重復(fù)性良好。

2．5．3 綠原酸和咖啡酸添加回收試驗(yàn) 分別向12號(hào)樣品（綠原酸和咖啡酸的含量分別為1．5 mg／mL和50 μg／mL）中添加綠原酸對(duì)照品濃度為10．17 mg／mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液150 μL 和咖啡酸對(duì)照品濃度為1．0 mg／mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液55 μL，充分混勻后依法測(cè)定綠原酸和咖啡酸的含量并計(jì)算回收率，一共作8個(gè)平行，結(jié)果見表3，結(jié)果表明：8 個(gè)平行樣品綠原酸和咖啡酸的平均添加回收率分別為86． 5% 和83．0%。

表3 綠原酸和咖啡酸添加回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab 3 Recovery results of chlorogenic acid and caffeic acid

2．5．4 樣品含量的測(cè)定 按2．5 項(xiàng)測(cè)定法對(duì)編號(hào)為1 ～13 的白英樣品進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果見表4。所測(cè)13 批樣品中綠原酸的平均含量為4．59 mg／g，而咖啡酸含量的平均值為76．90 μg／g。 3 號(hào)樣品中綠原酸和咖啡酸含量（21． 80 mg／g 和294． 90 μg／g）明顯偏高，分析認(rèn)為主要原因是該批樣品在采集時(shí)均為當(dāng)年新長(zhǎng)成的較幼嫩的植株，其較高的含量并不具代表性，作為離群值舍去。 其余12 批樣品中綠原酸含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為100．6%，而12 批樣品中咖啡酸含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差則為53．5%。 綠原酸和咖啡酸含量最高的5 號(hào)樣品分別是含量最低的8 號(hào)樣品的94 倍和7 倍，結(jié)果表明白英中咖啡酸含量雖然較低，但卻比綠原酸穩(wěn)定，變化幅度也較小，故采用咖啡酸的含量測(cè)定來控制白英的質(zhì)量。 去除離群值的12 批樣品中咖啡酸含量的平均值為58．73 μg／g，58．73 μg／g ×80%＝46．98 μg／g，因此，使用47．0 μg／g 作為咖啡酸的測(cè)量限值。

表4 13 批白英樣品中綠原酸和咖啡酸含量測(cè)定數(shù)據(jù)Tab 4 Detection results of chlorogenic acid and caffeic acid in 13Solanum LyratumThunb． samples

2．5．5 兩種溶劑處理樣品綠原酸和咖啡酸含量的測(cè)量結(jié)果 使用50%的甲醇溶液和75%的乙醇溶液分別處理2 批樣品，測(cè)定其中綠原酸和咖啡酸的含量，以考察兩種提取方法的優(yōu)劣。 結(jié)果見表5。結(jié)果表明：使用75%的乙醇溶液處理樣品比使用50%的甲醇溶液處理樣品，咖啡酸的收獲率均有非常明顯提高。

表5 不同溶劑處理2 批樣品的綠原酸及咖啡酸含量測(cè)定結(jié)果Tab 5 Detection results of chlorogenic acid and caffeic acid in 2Solanum LyratumThunb． Samples dealed with two different solvent

3 討論與結(jié)論

3．1 選擇薯蕷皂苷元作為薄層色譜鑒別對(duì)象的考慮 白英中含有較高的綠原酸及薯蕷皂苷元，兩者均可考慮作為薄層色譜鑒別的目標(biāo)物質(zhì)。 且《中國(guó)獸藥典》中對(duì)于綠原酸的薄層色譜鑒別有很成熟的方法，從這個(gè)角度而言，綠原酸的薄層色譜鑒別應(yīng)該作為優(yōu)先考慮的范疇。 但在對(duì)白英中的綠原酸進(jìn)行薄層色譜鑒別時(shí)發(fā)現(xiàn)，絕大多數(shù)白英飲片的薄層色譜鑒別顯色均不明顯甚至不顯色，原因應(yīng)當(dāng)是綠原酸不穩(wěn)定，在貯藏過程中容易分解所致。 對(duì)白英中的薯蕷皂苷元進(jìn)行薄層色譜鑒別時(shí)，新鮮藥材和飲片的薄層色譜顯色均沒有出現(xiàn)明顯差異。

3．2 薯蕷皂苷元薄層色譜鑒別的顯色特點(diǎn) 對(duì)薯蕷皂苷元進(jìn)行薄層色譜鑒別時(shí)，斑點(diǎn)的顯色情況會(huì)因加熱及放置時(shí)間的不同而出現(xiàn)較大的差別，但基本上是在磚紅色到暗綠色之間變化，且對(duì)照品與樣品所顯斑點(diǎn)的顏色均保持一致，并非顯色方法不佳所致。

3．3 選擇咖啡酸而沒有選擇綠原酸作為含量測(cè)定控制指標(biāo)的考慮 研究中發(fā)現(xiàn)白英新鮮藥材和飲片中綠原酸的含量均比較高，13 批樣品的平均含量可達(dá)4．59 mg／g，而咖啡酸的含量則相對(duì)低得多，13 批樣品的平均含量?jī)H為76．90 μg／g。 但不同批次的綠原酸含量存在巨大差距，而且綠原酸不穩(wěn)定，貯藏過程中容易發(fā)生降解；而不同批次的咖啡酸含量的偏差則相對(duì)小得多，故選擇咖啡酸而不選綠原酸作為控制白英質(zhì)量的含量指標(biāo)。

3．4 性狀中果實(shí)的顏色 研究中采集的新鮮藥材經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源教研室魏升華教授鑒定確定均為白英。 關(guān)于白英果實(shí)的顏色文獻(xiàn)中的描述存在一定差異，如《中國(guó)獸藥典》中果實(shí)的顏色為綠棕色，《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》（2003 版）［14］中為紅黑色，余南才［15］等認(rèn)為果實(shí)為淡黃色至暗紅色。 不同文獻(xiàn)中白英果實(shí)的顏色之所以存在差異，應(yīng)該與采集時(shí)間有關(guān)，采集時(shí)間太早，果實(shí)的顏色尚為綠色，故干燥后呈現(xiàn)為綠棕色或淡棕色；采集時(shí)間過晚，果實(shí)已經(jīng)完全成熟，顏色呈深紅色，干燥后會(huì)呈現(xiàn)出紅黑色的性狀；采集時(shí)間處于兩者之間時(shí)，果實(shí)正好由綠色變?yōu)榧t色，所以干燥后會(huì)呈現(xiàn)出淡黃色的情況。 所以，綜合考慮各種情況后，決定把果實(shí)的顏色修改為綠棕色至紅黑色。

3．5 薯蕷皂苷元含量的測(cè)定 本研究還建立了白英中薯蕷皂苷元含量的高效液相色譜測(cè)定方法及相應(yīng)的含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)。

本質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)較全面、客觀地建立了白英性狀、顯微、薄層鑒別，水分、灰分檢查，醇溶性浸出物以及其中咖啡酸含量測(cè)定的方法。 方法專屬性強(qiáng)，靈敏度佳，準(zhǔn)確度高，具有很強(qiáng)的可操作性，為控制白英的質(zhì)量提供了較全面的科學(xué)依據(jù)，可作為控制白英的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。