雞源大腸桿菌和沙門氏菌的分離鑒定及耐藥分析

高 強薛瑞林李守湖柳紀省唐德富?

目前，中國畜禽養(yǎng)殖業(yè)中流行的細菌性傳染病主要由條件致病菌和耐藥菌引起［1］。 在家禽養(yǎng)殖中最為常見的致病性細菌有大腸桿菌和沙門氏菌，發(fā)病的形式主要有單發(fā)、混合感染及與其他疾病并發(fā)［2］。 雞源大腸桿菌不僅會引起雞只腹瀉、氣囊炎、滑膜炎等疾病，而且可因繼發(fā)感染導致生長緩慢、產蛋下降［3］。 雞白痢沙門氏菌極易引起雛雞下痢、急性敗血癥等，死亡率較高，成年雞主要呈現(xiàn)慢性感染或隱形感染，長期帶毒且經卵垂直傳播［4］。雞副傷寒沙門氏菌可感染大多數(shù)溫血動物和冷血動物， 全世界范圍內已分離到雞副傷寒沙門氏菌有90 多個血清型，其中鼠傷寒、海德堡和腸炎沙門氏菌是主要血清型［5］。 作為條件致病菌，大腸桿菌和沙門氏菌都具有水平傳播和垂直傳播的特點，四季均可發(fā)病，不但對家禽業(yè)生產造成嚴重的經濟損失，而且威脅到人類的健康［6］。 加強生物安全防控、疾病凈化、病原菌疫苗免疫、抗生素預防與治療等措施，可以有效預防控制雞病原菌病的發(fā)生［7］。肉仔雞生長發(fā)育尚未健全，機體抵抗力較弱，易受大腸桿菌和沙門氏菌的感染。 常用抗生素因長期不合理的使用，致使病原菌的耐藥性越來越強。 本試驗采集甘肅省民勤縣某雞場7 日齡病死肉雞肝臟、脾臟、心臟進行病原菌分離培養(yǎng)、形態(tài)觀察、16S rDNA 分子鑒定，確認引起肉仔雞腹瀉、死亡的病原菌，之后通過復方中草藥及常用抗生素的藥敏實驗分析抑菌效果，對此次病情的預防控制和科學用藥及復方中藥應用于肉雞生產提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 實驗材料

1．1．1 病料來源 2019 年6 ～8 月，甘肅省民勤縣勤峰灘某肉雞飼養(yǎng)場前期幼雞出現(xiàn)腹瀉、精神萎靡、厭食并出現(xiàn)死亡癥狀，無菌采集10 只患病雞心臟、肝臟、脾臟帶回實驗室進行病原菌的分離培養(yǎng)及檢測。

1．1．2 主要試劑及儀器 普通瓊脂培養(yǎng)基、血平板培養(yǎng)基，購自北京索萊寶科技有限公司。 DNA 提取試劑盒、膠回收試劑盒，購自美國紐英倫生物技術（NEB）；DL 2000 Marker，購自寶生物（Takara）工程（大連）有限公司；濃度為1 g／mL 復方中草藥制劑由蘭州威特森生物科技有限公司自主研發(fā)，主要成分為女貞子、板藍根、當歸、柴胡、丹參、黃芪；其他化學試劑均購自美國SIGMA 生物科技有限公司。 實驗所用主要儀器PCR 儀、電泳儀、凝膠成像儀（Bio－Rad）；離心機（德國赫默）；水浴鍋、電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海，一恒）；恒溫培養(yǎng)搖床（上海，南榮）；超凈工作臺（蘇州，安泰）。

1．2 實驗方法

1．2．1 細菌的形態(tài)學觀察 將無菌采集患病雞心、肝、脾分別劃線接種于普通瓊脂培養(yǎng)基37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。 挑取典型優(yōu)勢菌落繼續(xù)接種培養(yǎng)，37 ℃培養(yǎng)24 h，挑取優(yōu)勢菌落進行涂片，將鏡檢結果為革蘭氏陰性短桿菌進一步劃線純化，以備后續(xù)實驗。

1．2．2 16S rDNA 分子鑒定 制備分離純化后的細菌菌液，根據(jù)細菌基因組DNA 提取試劑盒說明書提取DNA。 以細菌16S rDNA 通用引物擴增提取DNA，預期擴增長度1400 bp 左右。 反應體系50 μL：DNA 模板5 μL、Mix 25 μL、通用引物27F（5′－AGAGTTTGATCCTGGCTCAG － 3′）和1492R（5′ －GGTTACCTTGTTACGACTT－3′）各2 μL、無菌雙蒸水補足至50 μL。 反應條件：94 ℃預變性2 min，98 ℃變性10 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共進行31 個循環(huán)，最后70 ℃延伸10 min。 擴增產物用1．5%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

根據(jù)PCR 產物純化試劑盒說明書將所得產物純化，純化產物送至武漢金開瑞生物工程有限公司進行測序。 將所得測序結果與GenBank 數(shù)據(jù)庫進行同源性分析，分別選取其中同源性較高菌株的16S rDNA 序列，使用Mega 7． 0 軟件基于鄰接法（NeighborJoining，NJ 法） 構建系統(tǒng)進化樹， Bootstraps重復檢驗1000 次，以確定各菌株在分類學上的定位。

1．2．3 菌液及藥敏紙片的制備 利用平板計數(shù)法將菌液濃度調至1．0 ×106CFU／mL。 無菌采用二倍稀釋法，將原濃度的復方中草藥制劑依次稀釋至最低濃度為31．25 mg／mL。 10 片滅菌6 mm 小紙片依次平鋪與無菌培養(yǎng)皿，每紙片滴加30 μL 中草藥制劑，密封培養(yǎng)皿，烘干4 ℃保存。

1．2．4 體外抑菌 將調制后菌液200 μL 均勻涂抹于普通瓊脂培養(yǎng)基，取4 片不同濃度中草藥藥敏紙片置于上述涂有菌液培養(yǎng)基，倒置37 ℃恒溫24 h，測定抑菌圈直徑。 判定標準：抑菌圈直徑≥20 mm 為高敏，15 mm≤抑菌圈直徑＜20 mm 為中敏，10 mm≤抑菌圈直徑＜15 mm 為低敏，10 mm 以下的為不敏感［8］。 同時用10 種常用抗生素藥敏紙片做對照，藥敏試驗采用Kirby －bauer 瓊脂擴散法并參照參考文獻［9］進行。

2 結果與分析

2．1 菌株的分離與鏡檢 經分離純化培養(yǎng)，在10 只病雞心、肝、脾臟中分離得到三株病原菌，依次編號G1、G2、G3。 如圖1 所示，在血瓊脂平板上，G1 為灰白色、不透明菌落，未見明顯溶血環(huán)。 G2、G3 菌落呈針尖大小“露珠狀”，圓形，微隆起，光滑濕潤、半透明，邊緣整齊。 革蘭氏鏡檢發(fā)現(xiàn)三株菌均為革蘭氏陰性短桿菌，G1 菌珠多以單個存在，無芽孢、是兩端鈍圓的短桿菌。 G2、G3 菌兩端鈍圓，短桿狀，單個、成對或成叢排列。 通過鏡檢得知G1菌與大腸桿菌的形態(tài)特征相似；G2、G3 與沙門氏菌的形態(tài)特征相似。

圖1 分離菌株菌落形態(tài)與革蘭染色圖Fig 1 Colony morphology and Gram staining ofisolated strains

2．2 16S rDNA 基因序列及系統(tǒng)進化關系

2．2．1 PCR 結果 PCR 結果如圖2 所示，測序結果顯示G1 擴增長度1406 bp，G2 擴增長度1386 bp，G3 擴增長度1394 bp，各菌株序列均與預期擴增長度結果一致。

圖2 16S rDNA PCR 擴增電泳圖Fig 2 16S rDNA PCR electrophoresis

2．2．2 同源性比較和進化樹 將PCR 測序結果提交至GenBank 數(shù)據(jù)庫進行BLAST 同源性搜索，發(fā)現(xiàn)G1 菌株與GenBank 已登錄的大腸桿菌基因序列同源性高達98%以上，G2、G3 與沙門氏菌菌株同源性達99%以上。 分別選取同源性最高菌株的16S rDNA 序列，使用Mega 7．0 軟件基于鄰接法構建系統(tǒng)進化樹。 圖3 可得，所有菌株形成2 個主要分支，分離菌G1 與GenBank 已登錄的大腸桿菌Nbrc 102203 聚為一支，置信度為100。 圖4 可得，G2 與GenBank 已登錄的腸沙門氏菌亞種小腸漿液白痢株S09629 序列聚為一支，置信度為100。 從圖5 可得，G3 與GenBank 已登錄的沙門氏菌腸桿菌亞種甲型副傷寒腸桿菌GZ9A00052 序列聚為一支，置信度為98。

圖3 基于16S rDNA 序列構建的大腸桿菌種群鄰接法系統(tǒng)進化樹Fig 3 Phylogenetic tree ofE． colipopulation adjacency method based on 16S rDNA sequence

圖4 基于16S rDNA 序列構建的沙門氏菌種群鄰接法系統(tǒng)進化樹Fig 4 Phylogenetic tree ofSalmonellapopulation based on 16S rDNA sequence construction

圖5 基于16S rDNA 序列構建的沙門氏菌種群鄰接法系統(tǒng)進化樹Fig 5 Phylogenetic tree ofSalmonellapopulation based on 16S rDNA sequence construction

2．3 抑菌結果

2．3．1 復方中草藥制劑 由表1 可知，復方中草藥制劑抑菌效果與其濃度呈正相關。 其最小抑菌濃度（MIC）為62．5 mg／mL。 濃度為1 g／mL 時三株菌均為高度敏感，抑菌效果最好。

表1 復方中草藥制劑抑菌試驗Tab 1 Antibacterial test of compound Chinese herbal medicine preparations

2．3．2 抗生素 由圖6 可知，此次分離雞大腸桿菌對慶大霉素、阿米卡星2 種藥物敏感，對頭孢曲松、鏈霉素、氨芐西林、氟苯尼考、環(huán)丙沙星、頭孢噻肟和恩諾沙星7 種藥物耐藥；而雞白痢沙門氏菌對鏈霉素、氟苯尼考、頭孢噻肟3 種藥物敏感，對慶大霉素、氨芐西林、環(huán)丙沙星、四環(huán)素、恩諾沙星5 種藥物表現(xiàn)耐藥；雞副傷寒沙門氏菌對頭孢曲松、鏈霉素、頭孢噻肟3 種藥物敏感，對慶大霉素、氨芐西林、環(huán)丙沙星、四環(huán)素、恩諾沙星5 種藥物耐藥。

圖6 分離株藥敏試驗結果Fig 6 Isolate drug sensitivity test results

3 討論與結論

禽大腸桿菌病和沙門氏菌病混合感染的情況越來越嚴重，在衛(wèi)生狀況差、消毒不徹底、空氣流通不足、雞群抵抗力下降時極易發(fā)生［10］。 大腸桿菌為條件性致病菌，當動物機體抵抗力下降時，大腸桿菌與宿主的生態(tài)平衡被打破，形成生態(tài)失調，細菌的致病性便會表現(xiàn)出來，引起感染肉雞腹瀉、嘔吐、出血性結腸炎等疾?。?1］。 大腸桿菌與沙門氏菌既可單獨感染肉雞，也可與其他病原菌混合感染致發(fā)病，實際生產中，大腸桿菌和沙門氏菌混合感染的病例尤為突出。 安慧慧等［12］在固原區(qū)檢測出引起雞輸卵管炎癥的病原菌為大腸桿菌。 李蘊玉等［13］從采集的秦皇島地區(qū)患病死亡育成雞38 份肝臟病料組織中分離鑒定出20 株大腸桿菌。 宋欣媛等［14］在昆明地區(qū)發(fā)病雞的肝臟和脾臟病料中分離出沙門氏菌。 陳培培等［15］在即墨地區(qū)從病樣中分離出大腸桿菌和沙門氏菌。 李志紅［16］在寧夏某商品蛋雞養(yǎng)殖場病料中分離鑒定出兩株雞白痢沙門氏菌。 宋海霞等［17］在河南省地區(qū)腹瀉雞群中檢測出主要致病菌為雞大腸桿菌和沙門氏菌。 上述結果與本試驗結果基本一致。

大腸桿菌和沙門氏菌都易產生對抗生素的耐受性，而且多重耐藥現(xiàn)象嚴重，尤其是大腸桿菌和沙門氏菌混合感染的病例［18］。 混合感染時，雞的死亡率較高，用藥難度較大，其發(fā)病率、死亡率顯著增高。 兩種細菌血清型種類較多，不同地區(qū)差別較大；不同菌株之間不產生交叉保護作用，極易產生耐藥性［19］。 中草藥具有毒副作用小、促進生長、促進動物新陳代謝、無耐藥性、提高飼料報酬、預防疾病等優(yōu)點［20］。 關于雞大腸桿菌和沙門氏菌分離鑒定及抗生素藥敏實驗的文獻報道較多，但以復方中藥代替抗生素做體外抑菌實驗報道少見。 尹姣姣等［21］在晉中地區(qū)分離出雞致病性大腸桿菌做藥敏試驗，結果顯示耐藥率極高。 宋健等［22］分離出雞白痢沙門氏菌對環(huán)丙沙星、恩諾沙星高度敏感。 其結果與本實驗不一致可能是地理和養(yǎng)殖環(huán)境所不同造成，此結果也提示肉雞生產中要合理使用抗菌藥物，避免經驗用藥。 中草藥中的生物活性物質能夠促進動物健康生長，使畜禽機體內環(huán)境保持平衡狀態(tài)［23］。 女貞子所含的路類及苯芒醇巧類等具有補肝補腎、清虛熱的作用；板藍根當中所含有的黃酬類和三瞄皂巧類具有清熱解毒的作用；當歸中含有的當歸多糖和揮發(fā)油具有補血活血、潤燥滑腸作用；柴胡中所含的皂苷能抑制各種炎癥因子引起的踝關節(jié)腫脹和結締組織增生性炎癥［24］。 本試驗復方中藥抑菌實驗結果顯示，將1 g／mL 復方中草藥制劑濃度稀釋至62．5 mg／mL（MIC）時依然對3 株菌均有抑菌作用。 劉永波等［25］以云南10 種中草藥水煎劑對豬源大腸桿菌進行體外抑菌實驗，結果顯示中藥材水煎液對豬源大腸桿菌皆有不同程度的體外抑菌效果。 林炎權等［26］對四種中草藥對致病菌的抑菌作用測試結果顯示，在藥液pH 值調至中性后，五倍子和石榴皮能有效抑殺四種弧菌。 綜上結果所述，中草藥對致病菌有抑制作用。

根據(jù)大腸桿菌與沙門氏菌的流行特點，要有效控制和預防疾病的發(fā)生，除改善環(huán)境衛(wèi)生條件外，還需提高機體的抵抗力，從而有效抵御病原的侵襲。 由于人們對抗生素的濫用，導致常見病原菌對很多藥物產生了耐藥性，因此，治療效果十分不明顯。 本試驗結果顯示大腸桿菌和沙門氏菌耐藥性極高，復方中藥抑菌效果較好。 故雞場發(fā)生此類型病情時應根據(jù)藥敏試驗結果指導科學用藥，才能獲得良好的治療效果。

本實驗條件下，研究發(fā)現(xiàn)常用抗生素的殺菌效果并不理想，復方中草藥制劑殺菌效果良好。 建議生產中應采用藥敏試驗，根據(jù)其結果選擇敏感藥物，且應注意交替用藥，以收到良好的治療效果?？梢钥紤]在生產中使用復方中草藥制劑代替部分常用抗生素。