頂空氣相色譜-質譜法分析3種柚子果皮精油成分

李儉，鐘八蓮，2，姚鋒先，2，劉桂東，2，劉璐，鐘余，彭婷，2，*

（1.贛南師范大學生命科學學院，江西贛州341000；2.國家臍橙工程技術研究中心，江西贛州341000）

柚子（Citrus grandis[L.]Osbeck）是蕓香科植物柚的果實，主要在江西、廣東、福建等南方地區(qū)種植。目前柚子主要用來鮮食，而柚子的果皮約占果實重量的30%以上，柚子皮一般直接丟棄或加工為飼料，如此不僅浪費資源，而且污染環(huán)境。柚子果表皮細胞中含有較多的芳香物質，經過提取得到具有芳香氣味的油狀液體，稱為精油[1]。果皮中精油含量約占果皮鮮重的1%～3%[2]。

精油是評價柑橘果實品質的重要指標之一，是影響柑橘鮮食風味和口感的重要因素，同時柑橘果皮中含有多種生物活性物質，具有如抗菌消炎[3]和去除自由基[4]的作用。大量關于精油在癌癥防治作用的研究已開展[5-6]。據報道，檸檬烯對胰腺、乳腺和前列腺腫瘤具有化療活性[7]，能有效阻止乳腺癌和肝癌的發(fā)生和發(fā)展[8]。除了醫(yī)藥方面的作用，精油在食品、化妝品、化工等行業(yè)也有重要應用。翟芳芳等研究發(fā)現(xiàn)采用含茶樹精油的水性丙烯酸樹脂可較好的保持牡丹切花的品質，延長切花、插花的壽命[9]。研究柑橘果皮的精油有利于了解果實風味形成，促進精油有效成分挖掘和果皮深加工等產業(yè)的發(fā)展。

贛州市南康區(qū)種植甜柚的歷史已有1 500多年，被譽為“中國甜柚之鄉(xiāng)”。數據顯示，2007年南康甜柚種植面積占南康柑橘種植面積的65%[10]。練家柚為南康當地特有品種，果實成熟后果皮變成金黃色，香味濃郁，采摘后香味持久，當地人一般用作去味之用，關于其香味的研究鮮有報道。洪鵬等對廣西平樂縣的沙田柚果皮揮發(fā)性成分進行鑒定，檢測到25種揮發(fā)性成分[11]。對廣東梅州市的沙田柚果皮揮發(fā)性成分進行鑒定，檢測到35種物質[12]，而容縣沙田柚果皮揮發(fā)性成分檢測到52種[13]。說明同一品種在不同地方種植會有果皮揮發(fā)性成分的差異。

精油的提取方法有多種，主要為冷磨法、溶劑萃取法、微波萃取法、超臨界萃取法等。因蒸餾法成本低，出油率較高，此法應用最為成熟。本研究先利用蒸餾法提取柚子果皮精油，后采用頂空氣質聯(lián)用儀（headspace gas chromatography-mass spectrometer，HS-GCMS）對贛州南康地區(qū)的水晶柚、練家柚和沙田柚3種果皮精油進行分析測定。

在同一產地，對水晶柚、練家柚和沙田柚3種柚子的果皮揮發(fā)性成分進行研究。研究3種柚子精油成分的區(qū)別并尋找3種柚子的差異性香味貢獻物質，明確3種柚子精油所含成分，分析3種柚子精油間差異成分，為3種柚子果皮深加工和有效成分的利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗所用材料均采自江西省贛州市南康區(qū)三江鄉(xiāng)伍氏果園，水晶柚、練家柚和沙田柚采摘時間均為2018年11月20日，按代表性采樣原則，每種柚子所選柚子樹均為10年以上，長勢相近，健康植株3株。于樹冠中部外圍隨機挑選大小基本一致，無病蟲害的果實（每個品種挑選3個），采后當天送到實驗室4℃保存，后進行精油提取試驗。成熟期的沙田柚、練家柚、水晶柚的果實對比圖見圖1。

氯化鈉（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；無水硫化鈉（分析純）：天津玉福泰化學試劑有限公司；超純水：由超純水器（四川優(yōu)普超純科技有限公司）制備；石油醚（分析純）：西隴科學股份有限公司。

1.2 儀器與設備

7890B氣相色譜儀、5977B質譜儀、NIST數據庫、DB-Wax型色譜柱（30 m×250 μm×0.25 μm）：美國 Agilent公司；RE 52-99型旋轉蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；1 000 mL蒸餾燒瓶、冷凝管、承接管、250 mL分液漏斗、500 mL錐形瓶：蜀牛玻璃儀器有限公司；ZNHW型智能恒溫電熱套：邦西儀器科技（上海）有限公司。

圖1 成熟期的沙田柚、練家柚、水晶柚Fig.1 Matured Shatian pomelo，Lianjia pomelo and Crystal pomelo

1.3 方法

1.3.1 精油提取方法

本試驗采用水蒸餾法：將果實洗凈，剝皮。稱取切碎至約0.5 cm×0.5 cm的柚子皮約300 g，置于1 000 mL圓底燒瓶中，然后加入4%氯化鈉溶液800 mL沒過柚子皮，使用超聲波處理20 min，使用蒸餾裝置加熱回流3 h后得到水油混合液，水油混合液用石油醚進行萃取，精油溶解在石油醚中，加適量無水硫酸鈉去除多余水分，經旋轉蒸發(fā)器旋轉蒸發(fā)干凈石油醚，得到透明無色精油，轉至棕色瓶避光保存，待HS-GC-MS分析。

1.3.2 HS-GC-MS分析

1.3.2.1 進樣處理

取樣本 100 μL，用乙醇稀釋 100 倍，取 10 μL 于20 mL頂空瓶中，再加入10 μL 2-辛醇為內標。

1.3.2.2 氣相色譜條件

DB-Wax色譜柱（30 m×250 μm×0.25 μm），在 CTC（自動進樣系統(tǒng)）軌道系統(tǒng)的全自動固相微萃?。╯olid phase micro extraction，SPME）循環(huán)中。預熱時間15 min，孵育溫度為60℃，孵育時間30 min，解吸時間為4 min。使用配有5977B質譜儀的Agilent 7890氣相色譜系統(tǒng)進行HS-GC-MS分析。該系統(tǒng)使用DB-Wax（注入不分流模式）。使用氦氣作為載氣，前入口吹掃流量為3 mL/min，通過柱子的氣體流量為1 mL/min。將初始溫度保持在40℃1 min，然后以5℃/min的速率升溫至240℃，保持5 min。前進樣口、傳輸線、離子源和四級桿溫度分別為240、240、230、150℃。電子轟擊模式下的能量為-70 eV，質譜數據以掃描模式獲得，質量范圍為m/z 20～500，溶劑延遲時間為4.5 min。

1.4 數據分析

使用Chroma TOF軟件（V 4.3x，LECO）和NIST庫對質譜數據進行峰提取、基線矯正、解卷積、峰積分、峰對齊、質譜匹配等分析。選出相似度大于900的物質，并結合有關文獻進行人工圖譜解析，確定其香氣成分，通過內標歸一化法計算得出各化學成分的相對含量。所有樣品均重復3次，測定結果取其平均值。

2 結果與分析

2.1 果皮精油成分HS-GC-MS分析

HS-GC-MS分析沙田柚、練家柚、水晶柚3種柚子皮香氣成分的總離子流（total ion chromatography，TIC）見圖 2。

圖2 3種柚子果皮精油成分的總離子流Fig.2 Total ion current of three pomelo peel essential oil components

在本次試驗中3種柚子共檢出了527個峰，其中水晶柚檢出379個峰，練家柚檢出327個峰，沙田柚檢出434個峰。

2.2 柚子果皮精油成分

2.2.1 3種果皮精油主要成分與相對含量

3種柚子精油主要成分及相對含量見表1。

當物質相似度≥900時，從3種柚子皮精油共篩選出49種物質。主要為萜烯類（11種），醇類（13種），酯類（9種）和醛類（5種），同時檢測出酚類4種、苯類2種、氧化物2種、烷烴1種、酮類1種等。3種柚子皮精油中成分相差較小，沙田柚果皮精油檢出47種成分，水晶柚和練家柚均有46種成分。

表1 3種柚子精油主要成分及相對含量Table 1 Main components and related contents of three pomelo

從表1可知，3種果皮精油成分以醇類物質相對含量最大，水晶柚相對含量最高為9.12，其次為練家柚6.918，沙田柚中只有5.063。烯類在沙田柚相對含量最高（7.078），在練家柚中含量最低（2.213）。練家柚中醛類物質相對含量最低（3.116），在水晶柚中相對含量最高（5.279），沙田柚次之。沙田柚精油酯類相對含量最高為3.693，其次為水晶柚，練家柚與水晶柚相差較小。沙田柚中酚類物質相對含量為2.241，其它兩品種的酚類物質相對含量小于1，其它種類物質在3種柚子的相對含量均小于1。3種柚子果皮精油成分存在較大差異。

從品種上看，在水晶柚中的香葉醇相對含量最高為3.927，其次為檸檬醛，相對含量為3.667。練家柚中的檸檬醛相對含量最高為2.144，其次為芳樟醇，相對含量為1.688，吉馬烯D在沙田柚中的相對含量最高達到3.367，其次為檸檬醛，相對含量2.555?？梢?種果皮精油在成分和相對含量上有區(qū)別。

從品種間看，1-辛醇、橙花醇、（1S，5S）-2-甲基-5-（1-甲基乙烯基）-2-環(huán)己烯-1-醇、法尼醇、吲哚和香葉醇在水晶柚的相對含量要極顯著高于其它兩個品種。水晶柚中的丁酸己酯、反式芳樟醇氧化物、香橙醛、1-己醇、吉馬烯D和諾卡酮的相對含量要極顯著高于練家柚中的；同時檜烯、3，7-二甲基-3，6-辛二烯、檸檬醛和松油醇要顯著高于練家柚。練家柚的石竹烯相對含量極顯著高于水晶柚，鄰苯二甲酸二丁酯顯著高于水晶柚。乙酸三烯基己酯、十二甲基環(huán)六硅氧烷、十四烷、（3Z）-3-己烯酚己酯、乙酸香茅酯、吉馬烯D、香茅醇、水楊酸甲酯、2，6-二叔丁基對甲酚、橙花醇、2-仲丁基苯酚、2，4-二叔丁基苯酚、諾卡酮、鄰苯二甲酸二丁酯，這14種化合物在沙田柚中的相對含量極顯著高于其它兩種物質。沙田柚中的1-己醇、丁酸己酯、法呢醛、法尼醇、反式芳樟醇氧化物要極顯著高于練家柚；紫蘇醇同時要極顯著高于水晶柚。（E）-4，8-二甲基-1，3，7-壬三烯、乙酸香葉酯在沙田柚中的相對含量顯著高于其它兩種柚子，同時松油醇、（1S，5S）-2-甲基-5-（1-甲基乙烯基）-2-環(huán)己烯-1-醇和吲哚要顯著高于練家柚。沙田柚中的雙環(huán)大牻牛兒烯的相對含量顯著高于水晶柚。

2.2.2 果皮精油中共有的成分

3種柚子精油成分關系圖見圖3。

圖3 3種柚子精油成分關系圖Fig.3 Three pomelo essential oil composition diagram

從圖3可以看出3種柚子精油成分的相互關系，檢出的49種物質中，有42種共有物質。但在3種柚子中某些成分含量差異較大，如蒎烯在水晶柚的相對含量為2.12，而在練家柚和沙田柚中的相對含量分別為0.26、0.93。從圖3中看到水晶柚與練家柚之間存在43種共有的精油成分，水晶柚與沙田柚之間存在44種共有的精油成分，練家柚與沙田柚之間存在45種共有的精油成分。從共有成分看，3種柚子的成分重合率達到85.71%。

2.2.3 3種柚子果皮精油特征揮發(fā)成分分析

特征揮發(fā)成分物質定義為對所分析的來自相同地理起源的所有樣品中當某種物質僅在某一個基因型中含有或缺失，則這種物質就是該基因型的標識性物質。經過HS-GC-MS檢測，如圖3所示，發(fā)現(xiàn)水晶柚存在1種物質是其它兩種柚子不具有，其它兩種柚子不存在特征揮發(fā)成分。

2.2.4 主成分分析（principal component analysis，PCA）

主成分分析能總體上反映3種柚子品種之間的柚子果皮精油成分差異和3種柚子之間的變異度大小。使用SIMCA 14軟件對數據進行對數轉換加中心化格式化處理，后進行自動建模分析見圖4。

圖4 3種柚子精油成分PCA分析Fig.4 PCA analysis of three pomelo essential oil components

分析結果如圖 4 所示，R2X=0.869，Q2=0.648，Q2≥0.5，說明模型擬合度較好。PCA模型能從總體上反映各組樣本之間的總體代謝差異和樣本之間的變異度大小[14-15]。故PCA可用做分析3種柚子的聚集、離散程度。從圖4可以明顯看出3組柚子分布區(qū)間距離，品種間區(qū)別明顯，說明中3種柚子精油所含有的組成和濃度差異較大。

2.3 不同柚子精油中的差異成分分析

采用OPLS-DA模型的主成分1的變量投影重要度（variable importance in the projection，VIP）大于 l并結合t檢驗的P值（P≤0.05）尋找差異成分。3種柚子精油差異成分見表2。

如表2所示，水晶柚精油中存在5種差異成分，練家柚存在6種差異成分，沙田柚存在4種差異成分。通過計算同一種物質在3種柚子中的相對含量比值，能直觀從表2中看出同一物質在3種柚子中相對含量差異程度。

表2 3種柚子精油差異成分Table 2 Comparison of different components of three pomelo essential oils

2.4 層次聚類圖

運用聚類分析進一步分析3種柚子果皮精油成分差異，見圖5。

將組間距離小于10的物質劃分為一類，組間距離大于10劃分為一類，如圖5所示，在組間距離為5時，存在3條直線連接所有成分，因此3種柚子精油可劃分為三類，第一類成分水晶柚區(qū)別與其它兩種柚子的成分。第二類為沙田柚區(qū)別于其它兩種柚子的成分。第3個成分為練家柚子區(qū)別于其它兩種柚子的成分。但聚類分析能把練家柚和沙田柚區(qū)分開來。說明練家柚與沙田柚的精油成分差異較小。

3 討論與結論

有研究認為，柑橘精油含量和成分與多方面相關，如地理環(huán)境，遺傳型、成熟度，溫度和是否患病等[16-19]，有研究發(fā)現(xiàn)，紅/藍組合光質比為3∶1時可以通過調節(jié)酶的活性和產生相關基因來間接改善番茄果實的揮發(fā)性物質，與白光相比具有顯著性差異[20]。吳磊等研究發(fā)現(xiàn)不同栽培模式會對桃子揮發(fā)性物質的含量產生影響[21]。同時岳釘伊等發(fā)現(xiàn)增施CO2與LED補光明顯地提高了番茄特征揮發(fā)性芳香物質的含量，使番茄果實香味濃郁豐富[22]。同時能通過柑橘含量和成分揭示不同品種的遺傳差異及遺傳背景[23-24]。果實中存在某揮發(fā)性物質可以作為衡量果實健康和營養(yǎng)價值高低的重要指標[25]。從以上結果可以發(fā)現(xiàn)，3種柚子果皮精油含量和成分存在較大差異，能在一定程度反映3種柚子的遺傳差異和遺傳背景。

從果皮氣味上看，沙田柚風味較為清淡，水晶柚和練家柚具有較為濃郁的香味，練家柚為南康當地特有品種，其相關研究尚且欠缺。沙田柚果皮精油鑒定出47種成分，洪鵬等研究發(fā)現(xiàn)沙田柚精油成分數量25種[11]，數量存在較大差異。水晶柚和練家柚的精油研究尚未有報道。

圖5 3種柚子精油成分聚類分析圖Fig.5 Cluster analysis of the essential oil components of three pomelos

水晶柚精油中的檜烯、1-己醇、1-辛醇、松油醇、橙花醇、（1S，5S）-2-甲基-5-（1-甲基乙烯基）-2-環(huán)己烯-1-醇、香葉醇、香橙醛和吲哚相對含量均要顯著高于其它兩個品種，且這些物質均會揮發(fā)出不盡相同的香氣，檜烯和芳樟醇發(fā)出花香味，松油醇發(fā)出松油味，可能會對精油香氣有影響[26]，橙花醇發(fā)出過熟味，香葉醇為玫瑰花香味，香橙醛為檸檬香氣。練家柚中的石竹烯具有淡的丁香似香味，且相對含量極顯著高于其它兩個品種。吉馬烯D、芳樟醇、香茅醇、紫蘇醇、反-橙花叔醇、乙酸香茅酯、乙酸香葉酯、水楊酸甲酯、圓柚酮和（3Z）-3己烯酸己酯芳香醇具有香味，且相對含量顯著高于其它兩個品種。芳香醇是無色液體，具有鈴蘭花香氣；但隨著來源不同而有所差異，同時是柑橘果實香氣的重要貢獻者[27]，芳香醇廣泛用于香料，制作香水、香精等[28]。香茅醇具有甜玫瑰香；紫蘇醇具有溫暖的草香，稍有木香和花香；（3Z）-3-己烯酸己酯具有嫩莢青刀豆香氣和生水果香味。有研究表明乙酸香葉酯對琯溪蜜柚和沙田柚的果皮香味造成影響，乙酸香葉酯帶有薄荷的味道[29]。在本研究中其相對含量有差異，乙酸香葉酯在水晶柚、練家柚和沙田柚中相對含量分別為：1.063、0.926、2.097。沙田柚中乙酸香葉酯的相對含量要顯著高于其它兩個品種。結合差異成分分析結果，推測水晶柚果實香味區(qū)別其它兩個品種主要是因為香葉醇、吲哚、橙花醇的影響；吉馬烯D、石竹烯和反式芳樟醇氧化物是練家柚子有別于其它兩種柚子的成分；水楊酸甲酯和鄰苯二甲酸二丁酯是沙田柚有別于其它兩個品種的成分。因為3種柚子精油成分及含量存在區(qū)別，綜合表現(xiàn)在香氣上，形成柚子特有的風味。

根據果皮精油成分對3種柚子進行化學分類，結果表明水晶柚和練家柚親緣關系較近，沙田柚作為南康當地種植多年的品種，從精油成分數量上看，要比水晶柚和練家柚更為復雜，但水晶柚和練家柚具有濃郁的香氣，可見柚子風味并不由精油成分數量決定，而是由成分的相對含量和成分本身的性質決定。綜上所述，水晶柚、練家柚和沙田柚的精油成分及含量具有一定的差異，為我國柚子的精深加工提供了理論參考。