葛仙米藻粉對便秘大鼠腸神經(jīng)遞質(zhì)、ICC及水通道蛋白的影響

劉銀路，畢萃萃，楊麗濤，魏芬芬，張波

（生物活性物質(zhì)與功能食品北京市重點(diǎn)實驗室，功能食品科學(xué)技術(shù)研究院，北京聯(lián)合大學(xué)，北京100191）

便秘是一種常見的腸道疾病，主要表現(xiàn)為便秘患者大便量減少、直腸脹感并排便困難，且具有治療周期較長、易反復(fù)發(fā)作等特點(diǎn)，嚴(yán)重困擾患者的身心健康?，F(xiàn)代生活方式的改變以及人口老齡化趨勢的日益加重，使便秘患病率不斷升高。便秘還可以誘導(dǎo)多種疾病的發(fā)生[1]。目前緩解便秘的藥物主要包括瀉藥、滲透劑、潤滑劑等，這些藥劑在短時間有較好的作用，但是長時間服用此類藥物會有不同程度的毒副作用，如長期服用番瀉葉、大黃等蒽醌類瀉藥會導(dǎo)致結(jié)腸黑病變，嚴(yán)重者可能會導(dǎo)致結(jié)直腸腫瘤等疾病的發(fā)生[2-4]。故許多研究者致力于挖掘和開發(fā)低毒副作用的緩解便秘的藥食兩用天然產(chǎn)物。葛仙米作為一種傳統(tǒng)藥食兩用淡水微藻，有悠久的食用歷史，俗稱天仙米、天仙菜。學(xué)名為擬球狀念珠藻，屬藍(lán)藻綱，念珠藻科，念珠藻屬。野生葛仙米在世界上有極少分布，我國主要分布在湖北省鶴峰縣走馬坪鎮(zhèn)。目前我國已采用人工培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)葛仙米，其營養(yǎng)成分與野生葛仙米類似[5]。研究表明，葛仙米含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，尤其是富含膳食纖維以及蛋白質(zhì)、多種維生素和其它人體必需的元素錳、鈣、鋅、鐵、磷等成分，具有抗炎抗菌、抗癌、降血脂、潤腸通便等功效[5-8]。中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）和腸神經(jīng)系統(tǒng)（enteric nerves system，ENS）作為腦-腸軸的兩個“終端”，其結(jié)構(gòu)和功能的異常是影響腸道功能的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）、血管活性腸肽（vasoacticeintestinalpolypeptide，VIP）、P 物質(zhì) （substance P，SP）作為CNS和ENS信息傳遞中的重要神經(jīng)遞質(zhì)，在胃腸道功能的調(diào)節(jié)中起著重要的作用[9]。結(jié)腸吸收水分的功能與結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞水通道蛋白（aquaporins，AQPs）的表達(dá)有密切的關(guān)系[10-11]。Cajal間質(zhì)細(xì)胞是胃腸道的起搏細(xì)胞，其細(xì)胞膜上存在多種神經(jīng)遞質(zhì)受體，是參與神經(jīng)支配胃腸蠕動的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。Cajal間質(zhì)細(xì)胞（interstitial cell of Cajal，ICC）結(jié)構(gòu)、功能以及數(shù)量的改變也是影響胃腸動力的重要原因[12-13]。本實驗采用鹽酸洛哌丁胺制造大鼠便秘模型，通過研究便秘大鼠結(jié)腸ICC細(xì)胞、腸神經(jīng)遞質(zhì)5-HT、VIP以及SP分泌、結(jié)腸水通道蛋白AQP3、AQP4表達(dá)，探討葛仙米藻粉對便秘大鼠的通便作用及作用機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料

葛仙米超細(xì)粉：湖南炎帝生物公司，在-20℃將葛仙米研磨成超細(xì)粉，直接供本實驗使用，其中膳食纖維（47.3%）、蛋白質(zhì)（30.8%）、水分（5.54%）、灰分（5.7%）；鹽酸洛哌丁胺（每粒2 mg）：西安楊森制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H10910085。

1.2 試驗儀器

PL-203電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；JJ-12J脫水、JB-P5包埋機(jī)、JB-L5凍臺：武漢俊杰電子有限公司；RM2016病理切片機(jī)：上海徠卡儀器有限公司；KD-P組織攤片機(jī)：浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司；TSY-B脫色搖床、MX-F渦旋混合器：武漢賽維爾生物科技有限公司；GT1001組化筆：美國基因泰克公司；XSP-C204顯微鏡：徠卡顯微系統(tǒng)（上海）有限公司；JY92-Iin超聲細(xì)胞粉碎機(jī)：寧波新芝生物科技股份有限公司；Neofuge 15R臺式高速冷凍離心機(jī)：力康生物醫(yī)療科技控股有限公司；TL-420D水浴鍋：姜堰市天力醫(yī)療器械廠有限公司：RT3100自動洗板機(jī)：深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司；Epoch酶標(biāo)檢測儀：美國伯騰儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗動物

SPF級健康SD大鼠24只（體質(zhì)量130 g～150 g，雄性）：北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號：SCXK（京）2014-0004。將大鼠置于SPF級動物房中，溫度（22±2）℃，濕度 50%～60%，每日光照和黑暗各12 h，大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)將大鼠分為3組：對照組6只，模型組6只，葛仙米組12只。分組后各組體重之間無顯著性差異，大鼠均單籠飼養(yǎng)。實驗進(jìn)行4周。第1周至第3周：每天上午9∶00，葛仙米組大鼠給予0.8 g/kg劑量葛仙米灌胃，對照組與模型組給予等量生理鹽水進(jìn)行灌胃；第4周：模型組每天早上7∶00灌胃鹽酸洛哌丁胺（3 mg/kg），2 h后等量生理鹽水進(jìn)行灌胃；葛仙米組每天早上7∶00灌胃鹽酸洛哌丁胺（3 mg/kg），2 h后灌胃0.8 g/kg的葛仙米；對照組每天早上7∶00和9∶00灌胃等量生理鹽水。

1.3.2 大鼠體重及進(jìn)食量變化

大鼠喂養(yǎng)期間，記錄大鼠體重以及進(jìn)食量的變化。

1.3.3 腸道動力實驗

實驗第4周末，早上7∶00模型組和葛仙米組大鼠給予鹽酸洛哌丁胺灌胃，對照組給予等量生理鹽水灌胃，9∶00各組給予墨汁灌胃，正常飲食，每間隔30 min觀察1次，記錄首粒黑便時間。

1.3.4 ELISA實驗測定結(jié)腸組織中5-HT、VIP、SP水平

用10%水合氯醛0.5 mL/100 g將大鼠麻醉后，腹主動脈放血處死大鼠，取大鼠結(jié)腸組織用生理鹽水清洗，研磨制備10%的組織勻漿，4 000 r/min，20 min離心吸取上清，然后按照ELISA實驗說明書測定組織勻漿中的 5-HT、VIP、SP 含量。

1.3.5 免疫組化實驗測定結(jié)腸組織中c-kit含量

取大鼠結(jié)腸組織，PBS沖洗、4%多聚甲醛固定，常規(guī)包埋、切片、脫蠟、水化、抗原修復(fù)。滴加c-kit一抗，37℃孵育2 h，4℃過夜。分別滴加生物素標(biāo)記的二抗和過氧化物酶溶液15 min，二氨基聯(lián)苯胺（3，3’-di aminobenzidine，DAB）顯色 10 min。常規(guī)脫水透明，封片。CKX41倒置熒光顯微鏡觀察，腸組織切片出現(xiàn)特異性的棕褐染色為陽性。分析：每組內(nèi)每張切片隨機(jī)挑選400倍視野進(jìn)行拍照。拍照時盡量讓組織充滿整個視野，保證每張照片的背景光一致。應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0軟件選取相同的棕黃色作為判斷所有照片陽性的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，對每張照片進(jìn)行分析得出每張照片陽性的累積光密度值（integrated optical density，IOD）以及組織的像素面積AREA。并求出平均光密度值（average optical，AO 值），AO=IOD/AREA，AO 值越大表明陽性表達(dá)水平越高。

1.3.6 免疫組化法測結(jié)腸組織中AQP3、AQP4含量

采用免疫組化法檢測各組小鼠結(jié)腸組織中AQP3、AQP4表達(dá)情況：組織制成石蠟切片，將石蠟切片置于烘箱中58℃烤2 h～4 h；石蠟切片脫蠟至水，PBS洗3 min×3 min；0.01 mol/L檸檬酸鈉抗原修復(fù)液pH 6.0煮沸熱修復(fù)（95℃15 min），保溫15 min，室溫自然冷卻，PBS洗3 min×3 min；3%H2O2抑制內(nèi)源性過氧化物酶室溫孵育10 min；PBS洗3 min×3 min；10%正常胎牛血清室溫孵育30 min，PBS洗3 min×3 min；一抗4℃孵育過夜；PBS洗3 min×3 min；二抗37℃孵育1.5 h；PBS洗3 min×3 min；DAB顯色3 min～5 min；蘇木素復(fù)染30 s，鹽酸酒精分化1 s；脫水吹干后，樹脂封片；分析：每組內(nèi)每張切片隨機(jī)挑選400倍視野進(jìn)行拍照。拍照時盡量讓組織充滿整個視野，保證每張照片的背景光一致。應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0軟件選取相同的棕黃色作為判斷所有照片陽性的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，對每張照片進(jìn)行分析得出每張照片陽性的累積光密度值（integrated optical density，IOD）以及組織的像素面積（AREA）。并求出平均光密度值（average optical，AO值），AO=IOD/AREA，AO值越大表明陽性表達(dá)水平越高。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計，數(shù)據(jù)采用xˉ±s表示，組間比較采用單因素方差分析；組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義時，采用最小顯著法進(jìn)行組間的兩兩比較，以p＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 葛仙米對大鼠體重與進(jìn)食量的影響

各組大鼠生長期間飲食量變化見表1，各組大鼠體重變化見表2。由表1看出，各組大鼠初始體重?zé)o差別，在后續(xù)生長過程中雖然葛仙米組大鼠與模型組和對照組大鼠相比略有下降，但并無顯著性差異。表示葛仙米對大鼠生長無明顯影響。實驗結(jié)束時對照組與葛仙米組動物活動正常，毛發(fā)狀況良好，模型組大鼠有毛皮光澤暗淡、喜臥、嗜睡等現(xiàn)象。表2中顯示，大鼠在實驗中進(jìn)食量無顯著性差異，灌胃鹽酸洛哌丁胺的一周中，大鼠進(jìn)食量稍有減少，但無顯著性差異。

表1 各組大鼠生長期間飲食量變化Table 1 Changes in dietary dose during growth of each group of rats

表2 各組大鼠體重變化Table 2 Changes in body weight during growth of each group of rats

2.2 葛仙米對大鼠首次產(chǎn)生黑便時間的影響

葛仙米對大鼠產(chǎn)生首粒黑便影響見表3。

表3 葛仙米對大鼠產(chǎn)生首粒黑便影響Table 3 Effects of Nostoc sphaeroides kiitzing on the first black stool in rats

由表3可知，與對照組相比，模型組首粒黑便產(chǎn)生時間極顯著延長（p<0.01），表明大鼠便秘模型成立。葛仙米組與模型組大鼠相比，首粒黑便產(chǎn)生時間極顯著縮短（p<0.01），表明葛仙米有助于腸道推進(jìn)。

2.3 葛仙米對結(jié)腸組織5-HT、VIP、SP含量的影響

葛仙米對結(jié)腸組織5-HT、VIP、SP含量的影響見圖1。

與對照組比較，模型組結(jié)腸組織中神經(jīng)遞質(zhì)5-HT、SP含量顯著降低，差異具有極顯著性（p<0.01），VIP含量顯著升高，差異具有顯著性（p<0.05）。與模型組相比，葛仙米組結(jié)腸組織中神經(jīng)遞質(zhì)SP含量顯著性升高（p<0.05），5-HT 含量極顯著升高（p<0.01），而VIP含量顯著降低（p<0.05）。

圖1 葛仙米對結(jié)腸組織5-HT、VIP、SP含量的影響Fig.1 Effect of Nostoc sphaeroides kiitzing on the contents of 5-HT，VIP and SP in colonic tissue

2.4 葛仙米對結(jié)腸ICC的影響

免疫組化觀察大鼠結(jié)腸c-kit表達(dá)見圖2。

圖2 免疫組化觀察大鼠結(jié)腸c-kit表達(dá)（400×）Fig.2 Immunohistochemical observation of c-kit expression in rat colon（400×）

如圖2所示，光鏡下觀察組織結(jié)構(gòu)，模型組ICC陽性細(xì)胞胞體較小，著色較淺，相鄰ICC陽性細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)不連續(xù)。與模型組比較，葛仙米組ICC陽性細(xì)胞胞體較大，著色較深?；窘咏趯φ战M。結(jié)腸c-kit表達(dá)情況，模型組大鼠極顯著低于對照組，而葛仙米組極顯著高于模型組（p<0.01），與對照組基本一致。

2.5 葛仙米對AQP3、AQP4影響

免疫組化觀察大鼠結(jié)腸組織中AQP3、AQP4表達(dá)見圖3。

圖3 免疫組化觀察大鼠結(jié)腸組織中AQP3、AQP4表達(dá)（400×）Fig.3 Immunohistochemical observation of AQP3 and AQP4 expression in rat colon tissue（400×）

從圖3可以看出，AQP3在結(jié)腸頂膜處陽性表達(dá)更為明顯，陽性部分為黃褐色。AQP4在結(jié)腸中均有陽性表達(dá)，其中暗黃色部分為陽性表達(dá)區(qū)域。與對照組比較，模型組結(jié)腸AQP3極顯著降低，AQP4極顯著升高（p<0.01）。葛仙米組AQP3水平極顯著高于模型組、AQP4水平極顯著低于模型組（p<0.01）。

3 討論與結(jié)論

便秘是常見的胃腸疾病之一，老年人尤為常見。便秘往往給患者帶來明顯的身體不適，可引起肛裂、肛周感染、肛瘺以及腸梗阻等，此外便秘也是老年人心腦血管疾病的死亡誘導(dǎo)原因之一，可以誘發(fā)血管破裂、心律失常，使患者產(chǎn)生煩躁抑郁等不良情緒[14-16]。葛仙米為藥食同源藍(lán)藻，富含多糖類膳食纖維（多糖類含量高達(dá)50%左右），且主要由甘露糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖以β-（1，4）糖苷鍵組成[17-18]。該多糖具有吸水性強(qiáng)、黏度大、膨脹率高的特點(diǎn)，進(jìn)入腸胃后可吸收胃腸中的水分，使內(nèi)容物體積膨脹，增加腸道容積，并且使腸道潤滑，利于排便。

胃腸運(yùn)動除了通過交感和副交感神經(jīng)的去甲腎上腺素和乙酰膽堿進(jìn)行調(diào)節(jié)外，還有許多神經(jīng)遞質(zhì)包括VIP，SP物質(zhì)等從中樞和外周調(diào)節(jié)著胃腸道的運(yùn)動功能。ENS是局部獨(dú)立的神經(jīng)系統(tǒng)，其作用在于協(xié)調(diào)平滑肌細(xì)胞和ICC，三者共同組成胃腸道調(diào)控結(jié)構(gòu)，保證胃腸道各項功能協(xié)調(diào)運(yùn)行[19]。5-HT主要在胃腸道合成，嗜鉻細(xì)胞感受腸腔內(nèi)刺激后釋放大量5-HT，通過受體發(fā)揮作用，調(diào)節(jié)CNS與ENS之間的感覺傳遞[20]。SP廣泛分布于中樞和周圍神經(jīng)纖維內(nèi)，在神經(jīng)受刺激后，末梢將釋放SP發(fā)揮一系列生理作用，對胃腸道平滑肌產(chǎn)生強(qiáng)烈的刺激作用，促進(jìn)腸蠕動、增加結(jié)腸內(nèi)壓力、加速排瀉，同時SP還可以刺激5-HT的釋放，激活肥大細(xì)胞釋放組胺，從而發(fā)揮其對消化道平滑肌的強(qiáng)刺激作用。反過來5-HT、組胺又能促進(jìn)感覺神經(jīng)末梢分泌SP。VIP是一種由副交感神經(jīng)節(jié)后纖維釋放的多肽類激素，在結(jié)腸黏膜下神經(jīng)叢的表達(dá)最多。VIP可舒張腸道平滑肌、促進(jìn)腸道水分和電解質(zhì)的分泌，但過度分泌會抑制腸道運(yùn)動、舒張平滑肌[21，22]。本實驗中，模型組灌胃鹽酸洛哌丁胺1周后，大鼠產(chǎn)生首粒黑便的時間顯著大于對照組，且結(jié)腸組織5-HT及SP水平顯著降低、VIP水平顯著升高，引起便秘。葛仙米組采用先灌胃葛仙米3周，第4周灌胃葛仙米的同時再灌胃鹽酸洛哌丁胺，葛仙米組大鼠產(chǎn)生首粒黑便的時間顯著小于模型組，且結(jié)腸組織5-HT及SP水平顯著升高、VIP水平顯著降低，便秘癥狀得到緩解。這些結(jié)果提示，在葛仙米緩解大鼠便秘的作用機(jī)制中，腸神經(jīng)遞質(zhì)5-HT、SP以及VIP可能起著重要的作用。

AQPs是蛋白質(zhì)家族中一組特異性轉(zhuǎn)運(yùn)水的蛋白質(zhì)，參與組織水的分泌、吸收及平衡細(xì)胞內(nèi)外壓，有幫助水分子快速通過細(xì)胞膜作用，AQPs在哺乳動物消化道中有9種亞型，其中AQP3主要分布在結(jié)腸組織黏膜頂部，AQP4主要存在于小腸隱窩細(xì)胞和結(jié)腸表面上皮細(xì)胞的基底外側(cè)膜，它們在結(jié)腸水液代謝過程中起到重要作用，如果AQPs表達(dá)異常，就可導(dǎo)致腸道水液平衡紊亂[23-24]。本實驗中，模型組灌胃鹽酸洛哌丁胺1周后，結(jié)腸組織AQP3水平顯著低于對照組，AQP4水平顯著高于對照組。葛仙米組結(jié)腸組織AQP3水平顯著高于模型組，AQP4水平顯著低于模型組。此結(jié)果表明，葛仙米可能通過上調(diào)AQP3水平、下調(diào)AQP4水平來調(diào)節(jié)腸道水液代謝，從而增加糞便含水量，利于糞便的排除。

ICC是一種非神經(jīng)但又與神經(jīng)密切相關(guān)的特殊間質(zhì)細(xì)胞，廣泛存在于哺乳動物和人的消化道管壁內(nèi)，ICC是腸道慢波信號起搏細(xì)胞，參與調(diào)控了腸神經(jīng)信號傳遞過程。ICC的缺失會引起胃腸功能的異常。c-kit為原癌基因，編碼Kit受體，幾乎在所有的ICC都表達(dá)，因此也成為檢測Cajal間質(zhì)細(xì)胞存在的重要標(biāo)志。Cajal間質(zhì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)、功能、數(shù)量及分布的改變是胃腸動力障礙的主要原因[25-26]。本實驗中，模型組灌胃鹽酸洛哌丁胺1周后，結(jié)腸組織c-kit陽性細(xì)胞減少，而葛仙米組結(jié)腸組織c-kit陽性細(xì)胞上調(diào)，這可能與葛仙米參與介導(dǎo)Cajal間質(zhì)細(xì)胞數(shù)量而調(diào)節(jié)腸道動力，這個結(jié)果與腸道推進(jìn)實驗結(jié)果相吻合，進(jìn)一步證實葛仙米具有促進(jìn)腸道運(yùn)動的作用。總之，從目前研究的結(jié)果分析，葛仙米可通過調(diào)控腸神經(jīng)遞質(zhì)，水通道蛋白以及Cajal間質(zhì)細(xì)胞，有效緩解便秘的癥狀。

此外，大量研究表明，便秘的發(fā)生與腸道菌群的變化也有一定關(guān)系[27-28]，因此，將進(jìn)一步研究葛仙米對便秘動物腸道菌群以及代謝產(chǎn)物的影響，多方面探討和闡明葛仙米緩解便秘的作用和機(jī)理。