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    蟲草素的分離純化研究進展

    2020-12-22 21:23:09周啟林孫永健
    食用菌 2020年4期
    關(guān)鍵詞:蟲草大孔純度

    周啟林 孫永健

    (1天津天獅學(xué)院醫(yī)學(xué)院,天津301700;2天津天獅學(xué)院食品工程學(xué)院,天津301700)

    蟲草素學(xué)名為3'-脫氧腺苷,分子式為C10H13N5O3,可以溶于水、乙醇、甲醇,但不溶于苯、乙醚等溶劑,屬于嘌呤類生物堿。1951年,CUNNINGHAM等[1]從蛹蟲草的培養(yǎng)濾液中,用離子交換樹脂柱和活性炭柱層析法首次分離蟲草素。蟲草素具有抑菌[2]、抗病毒[3-4]、調(diào)節(jié)機體免疫力[5]、抗惡性腫瘤[6]與治療白血病[7]等多種功效。蟲草素的研究已成為生物醫(yī)藥及保健食品等領(lǐng)域中一個熱點,尤其在臨床抗腫瘤方面更為突出。YOSHIKAWA 等[8]深入研究了蟲草素對接種B16-BL6 黑色素瘤細胞小鼠的影響,結(jié)果表明,將15 mg/kg的蟲草素通過灌胃給藥,可以有效抑制瘤塊的生長,抑制率高達36%,而且并未在體內(nèi)引發(fā)毒性反應(yīng),說明蟲草素作為腫瘤藥物制劑很安全。丁蔚等[9]對40 只小鼠做了對照試驗,結(jié)果表明,蟲草素可能通過PI3K/AKT/mTOR 通路有效抑制炎癥反應(yīng),對亞硝基二乙基胺誘導(dǎo)的小鼠出現(xiàn)的原發(fā)性肝癌現(xiàn)象表現(xiàn)出了明顯的防護作用。LEE 等[10]進行了蟲草素對促進人類結(jié)腸癌細胞凋亡的研究,結(jié)果顯示,在蟲草素治療后的18 h,p53、Bax、DR3、caspase-8、caspase - 1、裂 解 的caspase-3、裂解的PARP 表達增加,表明蟲草素可以誘導(dǎo)人類結(jié)腸癌細胞HT-29凋亡。

    目前,蟲草素主要通過以下幾個方面獲?。阂皇菑挠枷x草或九州蟲草等天然蟲草的菌蟲復(fù)合體中直接提取[11];二是從固體或液體發(fā)酵培養(yǎng)物中提取[12];三是人工化學(xué)合成,但化學(xué)合成工藝復(fù)雜,且投入的設(shè)備和化學(xué)試劑等成本相對昂貴[13],產(chǎn)率也比較低[14],所以很難實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)。蟲草素的廣泛應(yīng)用及在現(xiàn)代醫(yī)藥學(xué)上的卓著功效,使之價格越來越高。當前,市場價格已達上千元每克(純度98%以上)。正因蟲草素的貴而稀,其提取和分離純化的研究成為當今的熱點。

    1 蟲草素的提取方法

    目前,蟲草素較好的提取方法有微波輔助法、超聲輔助法、超臨界萃取法和加速溶劑萃取法等。

    1.1 微波輔助浸提法

    曹慶穗等[15]試驗得到最佳工藝條件為微波功率405~741 W,時間為4 min,液(mL)料(g)比為39.924,提取1 次,蟲草素提取率可達1.17%。與熱水提取法相比,微波法提取的蟲草素得率高,提取速度快。黃子琪等[16]得到微波法提取最佳條件為功率500 W,pH7,溶劑的比例(水∶乙醇)為1∶3,時間為3 min,蟲草素得率可達1.735 mg/g。同時發(fā)現(xiàn),采用微波法提取,提取時間不宜太長,微波功率不宜太高。

    1.2 超聲輔助浸提法

    該方法無須加熱,不影響蟲草素的生物活性,同時組織破碎的效率高;但不足之處是,提取蟲草素的速度比微波法慢得多。房天琪[17]以蟲草素平均得率作為指標,比較了超聲提取法、熱回流法提取蟲草素效果,結(jié)果超聲提取法比熱回流法提取蟲草素效果更好,蟲草素平均得率達1.209 g/100 mL。李喆[18]使用KQ-500DE 超聲清洗器的正交試驗結(jié)果,最佳提取條件是溫度60°C,料液比為1∶300,含水量為20%,提取50 min,此條件下蟲草素得率為84.2%。

    1.3 超臨界萃取法

    近年來超臨界流體萃取技術(shù)(SFE)發(fā)展迅速。相比傳統(tǒng)工藝,超臨界萃取法具有無毒、萃取溫度低和分離效率高等優(yōu)點,被人們稱為“綠色分離”,適于提取生物資源中的有效成分。陳順志等[19]以人工培養(yǎng)的蟲草發(fā)酵物為原料,用超臨界流體萃取法提取蟲草素,并對蟲草素的光譜特征做了分析驗證,結(jié)果發(fā)現(xiàn),萃取得到的結(jié)晶物純度在98%以上。但該方法提取蟲草素的成本較高,不適合規(guī)模化提取蟲草素。

    1.4 加速溶劑萃取法

    陳方圓等[20]使用加速溶劑萃取儀(ASE)提取蛹蟲草中蟲草素,對溫度、靜態(tài)萃取時間、乙醇濃度和循環(huán)次數(shù)4 個因素進行3 水平的正交試驗優(yōu)化,結(jié)果表明加速萃取法提取蟲草素的最適條件為溫度70 ℃,時間 5 min,乙醇濃度 20%,循環(huán)次數(shù) 2 次。ASE技術(shù)一般在20 min內(nèi)自動從樣品中完成提取目標分析物,可取代超聲萃取、微波萃取、索氏提取、煮沸法等多種傳統(tǒng)方法。

    2 分離純化方法

    國內(nèi)外對于蟲草素的分離純化方法已有不少研究。目前比較高效高收率的方法有大孔樹脂吸附、離子樹脂吸附、新興的高速逆流色譜法以及聯(lián)合純化等。

    2.1 離子交換樹脂法

    陳星[21]在pH11 的條件下,使用717 離子交換吸附樹脂,用蒸餾水洗脫,在4 ℃靜置一段時間后,過濾得蟲草素晶體,然后反復(fù)使用溶液過飽和的方法制備高純度晶體。毛寧等[22]使用了717 陰離子樹脂純化蟲草素,也成功得到了較高純度的蟲草素晶體。韋會平等[23]采用732 陽離子樹脂純化法,從廢棄蛹蟲草大米培養(yǎng)基中提取蟲草素,純度可達98.0%以上,且產(chǎn)率達66.0%以上。離子交換法的吸附能力較好,并且裝置簡單,但用于純化蟲草素時,該方法的解吸率低于大孔吸附法[24],因此近幾年的應(yīng)用研究逐漸減少。

    2.2 大孔吸附樹脂法

    大孔樹脂的孔徑與比表面積都較大,內(nèi)部有三維立體孔結(jié)構(gòu),具有吸附容量大、再生處理方便等諸多優(yōu)點;但是有機殘留物高,預(yù)處理的難度高。關(guān)海晴等[25]在30 g/L 的葡萄糖發(fā)酵體系中,使用大孔樹脂吸附耦合的方法將產(chǎn)量提高到了32.07%,在補料的發(fā)酵體系中,該方法將產(chǎn)量提高到了35.78%。李從鎮(zhèn)等[26]通過試驗發(fā)現(xiàn),最佳解析條件為pH9~12,50%乙醇為洗脫劑,流速3 BV/h,同樣使用NKA-II 大孔樹脂,結(jié)果解析率可以達95%以上。譚琪明[27]以AB-8大孔樹脂為吸附樹脂,先用純水洗雜,然后用2倍柱體積的30%酒精洗脫,可完全富集小麥培養(yǎng)基中的蟲草素。張虎成等[28]利用大孔吸附樹脂AB-8 及十八烷基鍵合硅膠反相層析柱分離蛹蟲草發(fā)酵液中蟲草素,經(jīng)大孔樹脂吸附后解吸、硅膠分離后洗脫、結(jié)晶和重結(jié)晶三步,得到的蟲草素純度分別達到40%、90%、99%。周靖等[29]采用大孔吸附樹脂聯(lián)用KB-2 微球柱層析法對蟲草素分離純化的工藝進行優(yōu)化,結(jié)果表明,經(jīng)大孔吸附樹脂XDA-8D吸附后,再用體積分數(shù)30%的乙醇解吸附,蟲草素純度從0.4%提高至10.53%,聯(lián)用KB-2 微球柱層析法分離蟲草素,可將純度提高至66.94%。

    2.3 高速逆流色譜法

    高速逆流色譜法(HSCCC)的優(yōu)點主要在于其分離速度快,一般在十幾分鐘到幾十分鐘即可完成,并且分離量大,可以輕松實現(xiàn)數(shù)十克級的制備分離,但是要達到千克數(shù)量級,儀器放大的一些技術(shù)問題有待研究解決。目前,已有諸多科技人員在研究用HSCCC 方法分離純化蟲草素,相信在不久的將來,該方法將發(fā)展成為一種可產(chǎn)業(yè)化的高效分離技術(shù)。胡瑕等[30]對高速逆流色譜法的溶劑進行了篩選,用高速逆流色譜法在400 mg 蛹蟲草發(fā)酵液粗提物中,分離獲得了43.8 mg(質(zhì)量分數(shù)為98.7%)的蟲草素,實現(xiàn)高純度制備蟲草素目標。陳麗冰[31]采用陶瓷膜對蛹蟲草培養(yǎng)基的超高壓提取液過濾除雜后,用高速逆流色譜法對蟲草素粗提物進行分離純化,分離時間少于3 h,分離效果良好,蟲草素純度達到97.6%。張忠等[32]采取高速逆流色譜法結(jié)合NKA-Ⅱ型大孔樹脂吸附,在200 mg 蛹蟲草子實體中分離得到10.8 mg 蟲草素,純度高于98%,同樣實現(xiàn)高純度制備蟲草素的目標。

    應(yīng)用單一的固定相分離純化蟲草素難度較高,且比較繁瑣。所以,為了進一步加強分離純化的質(zhì)量、效率以及高回收率,上述方法可組合應(yīng)用。

    3 蟲草素的測定方法

    近年來,定量測定蟲草素的方法有高效液相色譜法、超高效液相色譜法、色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、近紅外光譜-線性回歸分析結(jié)合法等。

    3.1 高效液相色譜法

    高效液相色譜法(HPLC)的分離效率高,選擇性好,且檢測靈敏度高,可以高效地檢測蟲草素的含量及回收率。李兵等[33]采用HPLC 法,配合SGE protecol C18 色譜柱,做了蟲草素加樣回收率試驗,測定出加樣的平均回收率為100.2%,RSD為1.61%。牛世莉等[34]采用高效液相色譜法,配合使用Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18 色譜柱,對退化蛹蟲草菌株中蟲草素含量進行了測定,結(jié)果表明退化的蛹蟲草菌株,產(chǎn)生蟲草素的能力均會下降。蔣發(fā)飛[35]采用HPLC 法測定一種冬蟲夏草(來自云南省巧家縣),結(jié)果表明每克樣品冬蟲夏草中蟲草素的含量為6.9 μg,RSD為0.804%。

    3.2 超高效液相色譜法及色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法

    雷萍等[36]采用超高效液相色譜法(UPLC)對固體及液體兩相蟲草產(chǎn)品中的蟲草素進行了連續(xù)回收試驗,5 次測得的固液兩相回收率為97%~102%,RSD 為1.7%~3.3%。逄世峰等[37]采用UPLC 法進行了6 組連續(xù)蟲草素測定試驗,并配合使用ACQUITY UPLC HSS T3 色譜柱,得到了加樣的平均回收率為95.79%,RSD為4.43%。

    當前對于UPLC 法測定蟲草素的研究尚少,該方法與傳統(tǒng)方法相比,具有簡便、高效等優(yōu)點,且無須在液相中加入緩沖鹽,未來前景非常廣闊。

    張銘雅等[38]采用色譜法-串聯(lián)質(zhì)譜(HILICMS/MS)的方法,測定蛹蟲草中蟲草素,線性范圍為0.02~5 μg/mL(R2=0.9953),結(jié)果精密度小于10.0%,準確度在8.0%左右,具有較好的特異性、靈敏度、重現(xiàn)性,可以用于蟲草素等相關(guān)成分的微量檢測。

    3.3 近紅外光譜-線性回歸分析結(jié)合法

    王世成等[39]采用近紅外光譜和偏最小二乘法相結(jié)合,建立了蛹蟲草中蟲草素的定量分析校正模型,蟲草素含量的預(yù)測結(jié)果與HPLC 檢測結(jié)果的相關(guān)系數(shù)為0.9919,校正模型的定標均方差為102 mg/kg,預(yù)測均方差為281 mg/kg,該方法可用于蛹蟲草中蟲草素的快速無損檢測。郭偉良[40]在4 個攪拌式發(fā)酵罐39次蛹蟲草發(fā)酵試驗中,采用蒙特卡羅偏最小二乘法(MCPLS)識別異常樣本,并且采用偏最小二乘法(PLS)建立蛹蟲草中各成分的相關(guān)模型,用于測定菌絲體各成分的含量,結(jié)果表明菌絲體蟲草素含量的PLS 模型校正相關(guān)系數(shù)Rc值為0.7786,相對于具有龐雜成分及固液氣三相不斷變化的這兩個復(fù)雜因素來說,可以取得較好回歸結(jié)果。該方法可以為實現(xiàn)近紅外光譜(NIR)技術(shù)在線監(jiān)測真菌發(fā)酵關(guān)鍵參數(shù)做出重要貢獻。

    4 小結(jié)

    大量研究表明,蟲草素在生物醫(yī)藥及保健食品等領(lǐng)域有著很廣闊的應(yīng)用前景。但存在問題是蟲草素的產(chǎn)量較低,高純度的產(chǎn)品不易獲得,價格較為昂貴。盡管在蟲草素的提取、分離純化和檢測等方面已經(jīng)有了較多的成果,但每種方法各有利弊。如何高效、高產(chǎn)分離純化蟲草素,科學(xué)家們還要做更多努力。筆者認為,多種方法組合來制備高純度的蟲草素是必然選擇。

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