基因編輯技術(shù)在提高豬瘦肉率中的應(yīng)用

任紅艷，王紫君，舒 暢，華再東，畢延震

（湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所/動物胚胎工程及分子育種湖北省重點實驗室，武漢 430064）

肌肉生長抑制素（Myostatin，MSTN）是肌細胞分泌的蛋白激素，對成肌細胞的生長和發(fā)育起負調(diào)控作用［1］。在自然界中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)具有雙肌型性狀的動物，其肌肉量明顯多于正常動物，分析發(fā)現(xiàn)其MSTN基因自然變異失活了［2］。Lee等［3］通過敲除MSTN，成功獲得了具有雙肌型的小鼠，進一步說明了該基因與動物的肌肉量有關(guān)。另外，還有研究表明胰島素樣生長因子2（Insulin-like growth factor-2，IGF2）第三內(nèi)含子（intron3）的G3072A位點的單堿基突變（G→A）同樣導(dǎo)致了瘦肉率的提升［4］。自然突變的動物經(jīng)過選育后形成了新的品種，其肉質(zhì)柔軟、蛋白質(zhì)含量較高，很受消費者青睞，但自然突變所需時間很長。隨著基因編輯技術(shù)的飛速發(fā)展，研究者發(fā)現(xiàn)可以利用該技術(shù)進行定點基因編輯，大大縮短了選育時間，且安全性有一定保障。

1 基因編輯技術(shù)概述

隨著近些年第一代基因編輯技術(shù)鋅指核酸酶（Zinc finger nucleases，ZFN）和第二代基因編輯技術(shù)轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)因子核酸酶（Transcription activatorlike effector nucleases，TALEN）的發(fā)展及應(yīng)用，第三代基因編輯技術(shù)規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)序列（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated 9，CRISPR/Cas9）應(yīng) 運 而生，并因其操作簡單，DNA雙鏈斷裂（Double-strand break，DSB）效率較高而得到了飛速發(fā)展［5，6］。CRISPR/Cas9只需要Cas9蛋白和向?qū)NA（guide RNA，gRNA）即可按照自己的意愿完成定點DSB，并通過細胞自身的非同源末端連接（Nonhomologous end joining，NHEJ）［7］通路發(fā)生Indel，從而產(chǎn)生移碼突變完成基因敲除，或通過同源重組（Homologous recombination，HR）［8］通路與同源臂供體（donor）完成定點基因敲入。通過以上技術(shù)可完成相關(guān)基因的失活，從而較快地得到MSTN基因編輯動物。但CRISPR/Cas9可能會脫靶從而引入潛在不需要的DSB，導(dǎo)致生物安全性問題，隨著技術(shù)的發(fā)展，后面又出現(xiàn)了更加安全的不發(fā)生DSB的堿基編輯技術(shù)（Base editing）和全新的精準基因編輯（Prime editing）等方法。

2 基因編輯在提高豬瘦肉率中的應(yīng)用

中國是世界上養(yǎng)豬最多和豬肉食用量最大的國家，每年卻要大量進口外國種公豬或其精子，主要是因為中國豬普遍具有飼料報酬低、貯脂力強、瘦肉率低等許多缺點，現(xiàn)代人們喜食瘦肉，中國不得不大量進口瘦肉率較高的外國豬以滿足人們越來越高的需求。因此亟需培育高瘦肉率的本土豬，但常規(guī)選育通常費時費力，隨著基因編輯技術(shù)的飛速發(fā)展，這一高速便捷的分子育種方式得以應(yīng)用。

MSTN基因包括3個外顯子和2個內(nèi)含子（NCBI），第三外顯子最終決定了起作用的肌肉抑制素成熟肽，故一般破壞第三外顯子以失活MSTN。IGF2基因包括9個外顯子和8個內(nèi)含子（NCBI），研究表明是第三內(nèi)含子的單堿基突變導(dǎo)致瘦肉率提高。本文對通過CRISPR/Cas9、Base editing和Prime editing等方法敲除MSTN基因和突變IGF2基因以得到高瘦肉率豬進行綜述。

2.1 CRISPR/Cas9的應(yīng)用

2012年人類就開始研究CRISPR/Cas9［9］，由于人類已經(jīng)弄清楚提高瘦肉率與MSTN基因失活密切相關(guān)，所以便開始利用此技術(shù)開展MSTN敲除的研究，以期獲得高瘦肉率豬，但該技術(shù)對于IGF2的單堿基突變則無能為力。獲得基因敲除動物一般有以下途徑：通過顯微注射gRNA和Cas9 mRNA到受精卵中獲得基因編輯動物（通常用于小型動物），或通過先制備基因敲除細胞再進行體細胞克隆得到基因編輯動物（通常用于大型動物）。運用CRISPR/Cas9使MSTN失活主要有以下3種方法：①單gRNA產(chǎn)生單DSB法利用Indel發(fā)生移碼突變使其失活；②雙gRNA產(chǎn)生雙DSB法利用較大片段的丟失使其失活；③通過基因敲入熒光報告系統(tǒng)輔助篩選陽性細胞和Cre/LoxP重組系統(tǒng)刪除熒光標(biāo)記殘留34bp序列達到翻譯錯誤使其失活等。

2015年，湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所運用CRISPR/Cas9技術(shù)，通過單gRNA法獲得了MSTN基因敲除細胞系，并通過體細胞克隆得到了中國首例超級瘦肉豬——中超916新品系［10］。2017年，該所又利用CRISPR/Cas9基因敲入和Cre/LoxP技術(shù)連用獲得了豬肌肉生長抑制素雙等位基因敲除細胞系［11］。2019年，該所利用雙gRNA法且無選擇標(biāo)記法獲得了MSTN雙等位基因純合子敲除細胞系，并得到了克隆豬。

通過以上方法，雖可以較為快速地獲得MSTN敲除動物，但由于產(chǎn)生了DSB，存在潛在的脫靶等生物安全性問題，需要進一步尋找更加安全的技術(shù)。

2.2 Base editing的應(yīng)用

由于常規(guī)CRISPR/Cas9有產(chǎn)生DSB的不利性，不產(chǎn)生DSB的基因編輯改進型——堿基編輯應(yīng)運而生［12］。堿基編輯分為胞嘧啶堿基編輯器（cytosine base editor，CBE）和腺嘌呤堿基編輯器（adenine base editor，ABE）。最新的CBE4和ABE4編輯器基于CRISPR/Cas系統(tǒng)，通過在nCas9上連接上胞嘧啶和腺嘌呤脫氨酶形成融合蛋白，即可完成C-T（G-A）或A-G（T-C）的堿基替換，從而實現(xiàn)單堿基編輯。相較于常規(guī)CRISPR/Cas9基因編輯，該堿基編輯不會發(fā)生DSB，所以理論上不會出現(xiàn)潛在的DNA脫靶而產(chǎn)生永久的DNA編輯，提高了生物安全性。

許多人類疾病都與堿基突變有關(guān)，所以該方法對于基因疾病的治療有巨大的發(fā)展?jié)摿ΑＭ瑫r，此方法正好可以與IGF2的單堿基突變相結(jié)合，以獲得IGF2-G3072A位點的單堿基編輯細胞系，從而獲得具有高生物安全性的高瘦肉率基因編輯豬。除此之外，還可以利用單堿基編輯在MSTN基因上引入提前終止密碼子以達到基因敲除的效果。

然而，2019年中國科學(xué)院神經(jīng)科學(xué)研究所楊輝團隊在Science發(fā)表的GOTI技術(shù)發(fā)現(xiàn)單堿基編輯存在大量不可預(yù)測的脫靶［13］，隨后該團隊通過定點突變來優(yōu)化編輯工具，獲得了高編輯效率且低脫靶性的新型堿基編輯工具，從而可以獲得更具生物安全性的基因編輯豬。

2.3 Prime editing的應(yīng)用

單堿基編輯由于沒有DSB，降低了DNA脫靶，但其只能實現(xiàn)單個堿基的固定替換，具有一定的局限性。2019年Anzalone等［14］發(fā)明了全新的精準基因編輯工具PE（Prime Editors），最新的PE3/PE3b編輯器基于CRISPR/Cas系統(tǒng)，通過在Cas9/nCas9上連接上逆轉(zhuǎn)錄酶形成融合蛋白，即可完成堿基變換/堿基插入與刪除，是一種比較全面的編輯工具。該編輯不需要DNA模板就可以實現(xiàn)12種單堿基的自由變換，而且還能實現(xiàn)最多44 bp的插入和80 bp的刪除。相較于傳統(tǒng)的CRISPR/Cas9，同樣沒有引入DSB而具有較高生物安全性，與堿基編輯相比其可以進行單堿基的自由變換，同時還可以進行定點刪除和插入，應(yīng)用十分廣泛，在基因編輯領(lǐng)域帶來了重大變革。與基因編輯豬相結(jié)合，可以利用該系統(tǒng)對豬MSTN進行堿基的刪除或插入從而引起移碼突變導(dǎo)致其失活，或通過堿基變換引入提前終止密碼子導(dǎo)致其失活；另外，還可以運用該系統(tǒng)對IGF2-G3072A位點進行堿基變換，從而得到單堿基編輯細胞系。該系統(tǒng)還可以用于與影響豬瘦肉率的相關(guān)基因的研究，最終獲得高瘦肉率且高生物安全性的基因編輯豬。除此之外，該系統(tǒng)在人類基因疾病的治療上也具有廣泛的前景。但該系統(tǒng)以逆轉(zhuǎn)錄酶為主要原件，在細胞內(nèi)過量表達，其生物安全性仍然是一個需要考慮的問題。

3 展望

隨著基因編輯技術(shù)的飛速發(fā)展，出現(xiàn)了越來越多簡單易操作、運用廣泛且安全的新型編輯技術(shù)，可以快速獲得單堿基編輯、基因敲除或敲入的細胞系，并通過體細胞克隆等技術(shù)獲得基因編輯動物。運用以上技術(shù)達到分子育種的目的，以快速獲得具有優(yōu)良性狀的動物。在獲得高瘦肉率的優(yōu)良性狀豬上，基因編輯在其中扮演著十分重要的角色，相信隨著基因編輯技術(shù)的發(fā)展與完善，可以為人類生活做出更大的貢獻。