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    里氏木霉液體深層發(fā)酵纖維素酶及其酶促打漿工藝

    2020-12-22 01:16:32胡惠仁,張正健,劉廷志
    天津造紙 2020年1期
    關(guān)鍵詞:里氏木霉營(yíng)養(yǎng)元素

    權(quán)利要求書(shū)

    1. 一種纖維素酶的制備方法, 其特征在于:所述纖維素酶使用的生產(chǎn)菌株為里氏木霉(Trichoderma reesei),其保藏單位為中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心,地址是北京市朝陽(yáng)區(qū)大屯路,中國(guó)科學(xué)院微生物研究所,保藏日期2008年11月25日,保藏號(hào)為CGMCC No.2785。

    所述纖維素酶的制備方法如下:將里氏木霉試管斜面菌種接入液體種子發(fā)酵罐(1)中進(jìn)行種子發(fā)酵得到所需要的液體種子,然后按照一定的接種量將液體種子接入纖維素酶發(fā)酵罐(2),并且在一定的發(fā)酵工藝條件下發(fā)酵,最后經(jīng)過(guò)離心分離制得所需纖維素酶酶液,并將其儲(chǔ)存在纖維素酶存儲(chǔ)罐(3)中以備用。 所述發(fā)酵工藝參數(shù)如下:

    (1)里氏木霉試管斜面培養(yǎng)基:1%~2%CMC,4%~8%營(yíng)養(yǎng)元素液,0.1%~0.5%微量元素液,2%~3%瓊脂,pH=6.0;

    (2)里氏木霉菌種的培養(yǎng):將菌種接于斜面培養(yǎng)基上,在培養(yǎng)箱中于(29±1) ℃條件下培養(yǎng)4~7 d 后使用或4 ℃下保存?zhèn)溆茫?/p>

    (3)液體種子發(fā)酵培養(yǎng)基:1%~3%葡萄糖,4%~8%營(yíng)養(yǎng)元素液,1%~4%麩皮,0.1%~0.4%微量元素液;

    (4)纖維素酶發(fā)酵培養(yǎng)基:碳源為0.1%~3%速生材硫酸鹽漿,8%~10%營(yíng)養(yǎng)元素液,0.2%~0.5%微量元素液,1%~4%麩皮,0.1%~0.2%表面活性劑Tween-80;

    (5)液體種子發(fā)酵條件:溫度30~40 ℃,pH=5~7,攪拌速度250~300 r/min,通風(fēng)量0.2~0.3 m3/h,發(fā)酵時(shí)間36~48 h;

    (6)纖維素酶發(fā)酵條件:溫度30~40 ℃,pH=5~8,接種量2%~3%,攪拌速度250~300 r/min,通風(fēng)量0.2~0.3 m3/h,發(fā)酵時(shí)間72~96 h。

    所述營(yíng)養(yǎng)元素液其配方為:3~10 g 檸檬酸鈉,5~20 g 磷酸二氫鉀,1~10 g 硫酸銨,0.5~5 g 硫酸鎂,0.1~5 g 氯化鈣,溶解后定容至100 mL。

    所述微量元素液配方為:1~5 g 硫酸亞鐵,0.1~1 g硫酸錳,0.1~1 g 氯化鋅,0.5~5 g 氯化鈷,1~10 mL 2 mol/L 的HCl,溶解后定容到100 mL;上述所有百分比均以質(zhì)量計(jì)。

    2. 權(quán)利要求1 所述的方法,其特征在于:所述碳源為思茅松硫酸鹽漿。

    3. 權(quán)利要求 所述的方法,其特征在于:酶液的制備過(guò)程中,種子發(fā)酵培養(yǎng)基采用1%葡萄糖、4%營(yíng)養(yǎng)元素液、1%麩皮、0.1%微量元素液,在溫度30 ℃、pH=6、攪拌速度250 r/min、通風(fēng)量0.2 m3/h 的條件下發(fā)酵48 h,得到所需要的液體種子;然后按照2%的接種量,將種子接入纖維素酶發(fā)酵罐(2),發(fā)酵培養(yǎng)基采用碳源為0.1%的速生材硫酸鹽漿、8%營(yíng)養(yǎng)元素液、0.2%微量元素液、1%麩皮、0.2%表面活性劑Tween-80,在溫度30 ℃、pH=6、接種量2%、攪拌速度300 r/min、通風(fēng)量0.3 m3/h 的條件下發(fā)酵96 h。

    4. 一種采用權(quán)利要求1 所述方法制得的纖維素酶用于酶促打漿的方法,其特征在于:紙漿為速生材硫酸鹽漿, 按照權(quán)利要求1 所述的方法制備纖維素酶并將其儲(chǔ)存在纖維素酶存儲(chǔ)罐中以備用, 將纖維素酶存儲(chǔ)罐(3)中的酶液通過(guò)計(jì)量泵以7 u/g 的酶用量以FPA 酶活為單位,輸送到紙漿反應(yīng)池(4)對(duì)紙漿進(jìn)行預(yù)處理,處理?xiàng)l件為漿濃10%、溫度50 ℃、pH=7.8、處理時(shí)間1 h,經(jīng)纖維素酶處理后的紙漿輸送到盤(pán)磨機(jī)(5)進(jìn)行打漿。

    技術(shù)領(lǐng)域

    本發(fā)明涉及一種纖維素酶酶促打漿工藝, 尤其涉及一種里氏木霉液體深層發(fā)酵纖維素酶及其酶促打漿工藝。

    背景技術(shù)

    打漿是制漿造紙過(guò)程的重要環(huán)節(jié), 對(duì)紙幅的物理性能產(chǎn)生效應(yīng)。然而,打漿是一耗能工段。為了得到所需要的紙漿性質(zhì), 打漿或磨漿將消耗大量的能源,大約占從原料到成紙所需總能源的18%。 因此,任何能夠顯著降低打漿或磨漿能耗的紙漿處理方法將對(duì)整個(gè)能量輸入產(chǎn)生有益影響。

    Pratima Bajpai 發(fā)表在《TAPPI Journa1》2006年第5 卷11 期第25—32 頁(yè)“Use of enzymes for reduction in refining energy-laboratory studies”一文的研究表明:印度Biocon 公司的Biorefine L 纖維素酶和美國(guó)Dyadic 國(guó)際公司的FiberZyme LBR 纖維素酶能夠有利地降低打漿能耗, 并且紙漿的強(qiáng)度性能沒(méi)有受到影響。

    鞠成民發(fā)表在《中國(guó)造紙》2006年第25 卷1 期第71—72 頁(yè) “生物酶對(duì)未漂針葉木打漿性能的影響” 一文中介紹了N613、N476、N342、HC、D401 和D501 等諾維信商品纖維素酶和半纖維素酶在提高打漿性能和改善紙漿強(qiáng)度方面的影響。

    上述研究所用的纖維素酶都為商品酶, 并非根據(jù)實(shí)際情況而自制纖維素酶用于酶促打漿。 由于現(xiàn)在商品纖維素酶價(jià)格比較高, 使得工廠使用起來(lái)成本很高;此外,國(guó)內(nèi)的造紙?jiān)隙倘?,大部分速生木材如馬尾松、 落葉松和思茅松等針葉木的纖維又粗又長(zhǎng),其硫酸鹽漿很難打漿,使得商品漿的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力弱,經(jīng)濟(jì)效益差。 為此,紙業(yè)界亟待開(kāi)發(fā)根據(jù)生產(chǎn)廠的具體情況, 采用就地自制的纖維素酶酶液進(jìn)行酶促打漿工藝, 以達(dá)到降低生產(chǎn)成本和打漿能耗的效果。

    發(fā)明內(nèi)容

    本發(fā)明的目的在于提供一種里氏木霉液體深層發(fā)酵纖維素酶及其酶促打漿工藝, 使用里氏木霉液體深層發(fā)酵纖維素酶對(duì)速生材硫酸鹽漿進(jìn)行酶促打漿,可降低打漿能耗和生產(chǎn)成本。

    本發(fā)明為實(shí)現(xiàn)上述目的,采用的技術(shù)方案如下:

    一種纖維素酶, 其特征在于所使用的生產(chǎn)菌株為里氏木霉(Trichoderma reesei),保藏單位為中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心, 地址是北京市朝陽(yáng)區(qū)大屯路,中國(guó)科學(xué)院微生物研究所,保藏日期2008年11月25日,保藏號(hào)為CGMCCNo.2785。 里氏木霉為好氧菌,生長(zhǎng)環(huán)境粗放,適應(yīng)性較強(qiáng),易于控制,便于管理,其代謝物安全無(wú)毒,不會(huì)影響生產(chǎn)人員和環(huán)境,所產(chǎn)纖維素酶的穩(wěn)定性好,不宜退化。

    纖維素酶的制備方法如下: 將里氏木霉試管斜面菌種接入液體種子發(fā)酵罐中進(jìn)行種子發(fā)酵得到所需要的液體種子; 然后按照一定的接種量將液體種子接入纖維素酶發(fā)酵罐, 并且在一定的發(fā)酵條件下發(fā)酵,最后經(jīng)過(guò)離心分離制得所需纖維素酶酶液,并將其儲(chǔ)存在纖維素酶存儲(chǔ)罐中以備用。

    發(fā)酵工藝參數(shù)如下:

    (1)里氏木霉試管斜面培養(yǎng)基:1%~2% CMC,4%~8%營(yíng)養(yǎng)元素液,0.1%~0.5%微量元素液,2%~3%瓊脂,pH=6.0;

    (2)里氏木霉菌種的培養(yǎng):將菌種接于斜面培養(yǎng)基上,在培養(yǎng)箱中于(29±1) ℃條件下培養(yǎng)4~7 d 后使用或4 ℃下保存?zhèn)溆茫?/p>

    (3) 液體種子發(fā)酵培養(yǎng)基:1%~3%葡萄糖,4%~8%營(yíng)養(yǎng)元素液,1%~4%麩皮,0.1%~0.4%微量元素液;

    (4)纖維素酶發(fā)酵培養(yǎng)基:碳源為0.1%~3%速生材硫酸鹽漿,8%~10%營(yíng)養(yǎng)元素液,0.2%~0.5%微量元素液,1%~4%麩皮,0.1%~0.2%表面活性劑Tween-80 ;

    (5)液體種子發(fā)酵條件:溫度30~40 ℃,pH=5~7,攪拌速度250~300 r/min,通風(fēng)量0.2~0.3 m3/h,發(fā)酵時(shí)間36~48 h;

    (6)纖維素酶發(fā)酵條件:溫度30~40 ℃,pH=5~8,接種量2%~3%,攪拌速度250~300 r/min,通風(fēng)量0.2~0.3 m3/h,發(fā)酵時(shí)間72~96 h;

    所述營(yíng)養(yǎng)元素液的配方為:取3~10 g 檸檬酸鈉,5~20 g 磷酸二氫鉀,1~10 g 硫酸銨,0.5~5 g 硫酸鎂,0.1~5 g 氯化鈣,溶解后定容至100 mL;

    所述微量元素液配方為:1~5 g 硫酸亞鐵,0.1~1 g硫酸錳,0.1~1 g 氯化鋅,0.5~5 g 氯化鈷,1~10 mL 2 mol/L 的HCl,溶解后定溶到100 mL;上述所有百分比均以質(zhì)量計(jì)。

    在本發(fā)明的纖維素酶的制備方法中, 所用的發(fā)酵碳源為思茅松硫酸鹽漿。

    在本發(fā)明的纖維素酶的制備方法中,其酶液的制備過(guò)程中, 種子發(fā)酵培養(yǎng)基采用:1%葡萄糖,4%營(yíng)養(yǎng)元素液,1%麩皮,0.1%微量元素液,在溫度30 ℃,pH=6,攪拌速度250 r/min,通風(fēng)量0.2 m3/h 的條件下發(fā)酵48 h, 得到所需要的液體種子; 然后按照2%的接種量,將種子接入纖維素酶發(fā)酵罐,發(fā)酵培養(yǎng)基采用:碳源為0.1%的速生材硫酸鹽漿,8%營(yíng)養(yǎng)元素液,0.2%微量元素液,1%麩皮,0.2%表面活性劑Tween-80, 在溫度30℃,pH=6;接種量2%,攪拌速度300 r/min;通風(fēng)量0.3m3/h 的條件下發(fā)酵96 h。

    用本發(fā)明的纖維素酶的制備方法所制得的纖維素酶產(chǎn)品的性能:纖維素酶酶液的酶活分別為FPA 酶活為900~1500 u/mL,Cx 酶活為3000~4000 u/mL,Cb酶活為10~100 u/mL,Cl 酶活為500~1000 u/mL。

    采用本發(fā)明制得的纖維素酶用于酶促打漿,其打漿工藝為:紙漿為速生材硫酸鹽漿,按照本發(fā)明所述的方法制備纖維素酶并將其儲(chǔ)存在纖維素酶存儲(chǔ)罐中以備用, 將纖維素酶存儲(chǔ)罐中的酶液通過(guò)計(jì)量泵以3~9 u/g 的酶用量(以FPA 酶活為單位),輸送到紙漿反應(yīng)池對(duì)紙漿進(jìn)行預(yù)處理。

    處理?xiàng)l件為:漿濃3%~10%、溫度40~60 ℃、pH=6~8、處理時(shí)間1~2 h,經(jīng)纖維素酶處理后的紙漿輸送到盤(pán)磨機(jī)進(jìn)行打漿。

    在本發(fā)明的打漿工藝中,所述速生材硫酸鹽漿為思茅松硫酸鹽漿,酶用量7 u/g(以FPA 酶活為單位),將濃10%,溫度50 ℃,pH=7.8(紙漿本身pH),處理時(shí)間1 h。

    本發(fā)明的有益效果是:1. 工藝簡(jiǎn)單, 生產(chǎn)成本低;2. 采用所要處理的紙漿為發(fā)酵碳源能夠顯著提高酶液的適應(yīng)性;3. 纖維素酶的酶活高、用量少、針對(duì)性強(qiáng)、效果好;4. 降低打漿能耗,對(duì)纖維本身的損傷小。

    具體實(shí)施方式

    圖1 是本發(fā)明纖維素酶酶促打漿工藝流程示意圖。 以下結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明詳細(xì)說(shuō)明。

    圖1 纖維素酶酶促打漿工藝流程示意圖

    實(shí)施例1

    參見(jiàn)圖1,一種纖維素酶的制備,其使用的生產(chǎn)菌株為里氏木霉。 將里氏木霉試管斜面菌種接入液體種子發(fā)酵罐1 中進(jìn)行種子發(fā)酵得到所需要的液體種子; 然后按照一定的接種量將液體種子接入纖維素酶發(fā)酵罐2,并且在一定的發(fā)酵條件下發(fā)酵,最后經(jīng)過(guò)離心分離制得所需纖維素酶酶液, 并將其儲(chǔ)存在纖維素酶存儲(chǔ)罐3 中以備用。

    酶液的具體制備: 將里氏木霉試管斜面菌種接入液體種子發(fā)酵罐1 中, 種子發(fā)酵培養(yǎng)基采用1%葡萄糖、4%營(yíng)養(yǎng)元素液、1%麩皮和0.1%微量元素液,在溫度30 ℃、pH=5.76、攪拌速度250 r/min、通風(fēng)量0.2 m3/h 的條件下發(fā)酵48 h 得到所需要的液體種子; 然后按照2%的接種量將種子接入纖維素酶發(fā)酵罐2; 發(fā)酵培養(yǎng)基采用0.1%思茅松硫酸鹽漿、8%營(yíng)養(yǎng)元素液、0.2%微量元素液、1%麩皮和加入量為0.2%的表面活性劑Tween-80,在溫度30 ℃、pH=6、攪拌速度300 r/min、通風(fēng)量0.2 m3/h 的條件下發(fā)酵96 h, 然后經(jīng)過(guò)離心分離制得所需纖維素酶酶液,并將其儲(chǔ)存在纖維素酶存儲(chǔ)罐3 中以備用。 所制纖維素酶酶液的酶活分別為:FPA 酶活981.67 u/mL,Cx 酶活3083.19 u/mL,Cb 酶活為27.79 u/mL,Cl 酶活571.42 u/mL。

    酶促打漿工藝:紙漿為思茅松硫酸鹽漿,將纖維素酶存儲(chǔ)罐3 中的酶液通過(guò)計(jì)量泵以7 u/g 的酶用量(以FPA 酶活為單位)輸送到紙漿反應(yīng)池4,對(duì)紙漿進(jìn)行預(yù)處理,處理?xiàng)l件為漿濃10%、溫度50 ℃、pH=7.8(紙漿本身pH 值)、處理時(shí)間1 h,經(jīng)纖維酶處理以后的紙漿輸送到盤(pán)磨機(jī)5 進(jìn)行打漿。

    實(shí)施例2

    比照漿樣分別采用空白漿樣和商品纖維素酶酶促打漿漿樣。 按本技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法制備空白漿樣, 即不使用本發(fā)明的纖維素酶對(duì)紙漿進(jìn)行打漿。 在相同處理?xiàng)l件下, 采用商品纖維素酶進(jìn)行酶促打漿。

    按照國(guó)家紙漿物理性能檢測(cè)方法, 測(cè)定本發(fā)明打漿漿樣、 空白漿樣和商品纖維素酶打漿漿樣的物理性能,結(jié)果見(jiàn)表1。

    表1 不同漿樣的物理性能

    從表1 中可以看出, 本發(fā)明的酶處理漿樣能夠明顯降低磨漿機(jī)負(fù)荷, 從而節(jié)省磨漿能耗, 節(jié)能約25%,與商品纖維酶打漿的節(jié)能值相當(dāng),并且紙漿的物理性能沒(méi)有受到太大影響。

    采用里氏木霉發(fā)酵纖維素酶進(jìn)行速生材硫酸鹽漿酶促打漿,其工藝簡(jiǎn)單、設(shè)備投資少、成本低、工藝流程緊湊,具有降低打漿能耗的效果,適合應(yīng)用于我國(guó)現(xiàn)有造紙?jiān)辖Y(jié)構(gòu)狀況下的制漿原料的打漿工藝。

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