利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建人HIF-1α基因敲除細(xì)胞株

楊 芳， 張寶云， 向 偉， 王憑青， 向遠(yuǎn)彩

(1. 西南醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 瀘州 646000; 2. 重慶大學(xué) 生物工程學(xué)院， 重慶 400000)

低氧誘導(dǎo)因子(Hypoxia inducible factor，HIF)是哺乳動物細(xì)胞內(nèi)存在的一類介導(dǎo)低氧適應(yīng)性反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子，能夠激活響應(yīng)低氧應(yīng)激基因的表達(dá)。研究揭示，介導(dǎo)此過程的主要分子是HIF-1，它由敏感型的α亞基和組成型的β亞基構(gòu)成異二聚體[1-2]。由于HIF-1能夠參與卵泡的發(fā)育、成熟、排卵以及隨后的黃體早期發(fā)育等排卵事件，因而它對哺乳動物排卵過程的正常進(jìn)行具有重要作用[3-4]。除了在正常排卵過程中扮演著重要角色外，HIF-1還能促進(jìn)卵巢腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移及其發(fā)展[5-6]，因而眾多研究者[7-8]認(rèn)為HIF-1可能是切斷卵巢腫瘤轉(zhuǎn)移的潛在靶點(diǎn)。HIF-1既能維持正常的排卵過程又能參與如卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌等腫瘤的發(fā)展，這種看似矛盾的作用機(jī)制恰恰提示其在卵巢中的重要性。因此，了解HIF-1如何在不同細(xì)胞的不同時期對卵巢進(jìn)行精準(zhǔn)調(diào)控具有重要的研究價(jià)值。為了探明HIF-1在卵巢中的復(fù)雜調(diào)控機(jī)制，亟需獲得高效快速的方法在不同細(xì)胞中構(gòu)建HIF-1功能缺失的穩(wěn)定細(xì)胞株。

基因編輯技術(shù)是一項(xiàng)以基因靶向修飾為基礎(chǔ)的可對生物基因組進(jìn)行改造的新技術(shù)。隨著近幾年的發(fā)展，基因編輯技術(shù)有了巨大的飛躍，目前CRISPR/Cas9系統(tǒng)因其便捷、高效的特性已逐漸取代傳統(tǒng)的TALEN和ZFN技術(shù)，并廣泛運(yùn)用于人類細(xì)胞、斑馬魚、小鼠以及細(xì)菌的基因組等精確修飾[9-13]。因此，本實(shí)驗(yàn)采取CRISPR/Cas9技術(shù)靶向編輯HIF-1敏感性α亞基(HIF-1α)的策略來達(dá)到失活HIF-1的目的：首先將編輯質(zhì)粒轉(zhuǎn)入KGN細(xì)胞，用嘌呤霉素篩選出特異性敲除細(xì)胞株并對其鑒定；再用氯化鈷模擬低氧環(huán)境處理正常和敲除細(xì)胞株，檢測HIF-1下游基因的表達(dá)，以驗(yàn)證HIF-1α缺失后對HIF-1功能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

KGN細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存(成都中科院贈予)；pCAG-T7-cas9+gRNA-pgk-Pro-T2A-GFP載體(CRISPR/Cas9敲除質(zhì)粒，簡寫Cas9-gRNA)、引物、Oligos均購自北京唯尚立德公司；基因組試劑盒(康為世紀(jì)生物科技有限公司)；嘌呤霉素(sigma公司)；T7核酸內(nèi)切酶I(T7E1，TAKARA公司)；HIF-1α抗體(NOVUS biological)；β-actin抗體(中山金橋)；PPARγ(Proteintech公司)和ELISA試劑盒(百蕊生物公司)。

1.2 sgRNA設(shè)計(jì)和Cas 9-gRNA- HIF-1α表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建

在該基因的外顯子序列中尋找PAM序列(NGG)，選取該序列上游緊鄰的20 bp堿基序列作為sgRNA。將選好的sgRNA序列在NCBI系統(tǒng)中進(jìn)行BLAST比對，排除單核苷酸多態(tài)性的序列，根據(jù)CRISPR/Cas9敲除質(zhì)粒設(shè)計(jì)說明，在sgRNA的末端加上黏性末端AAACACCG(正義鏈5′端)和AAACACCG(反義鏈5′端)。所設(shè)計(jì)的sgRNA序列為：HIF-1asg-sense：5′-AAACACCGAAGTGTACCCTAACTAGCCG-3′；HIF-1asg-anti：5′-CTCTAAAACCGGCTAGTTAGGGTACACTT-3′。將設(shè)計(jì)好的Oligo經(jīng)退火形成二聚體后，與質(zhì)粒骨架連接并進(jìn)行轉(zhuǎn)化。挑3～5個白色菌落搖菌，提取質(zhì)粒并測序驗(yàn)證，測序引物序列為：5′-TGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAG-3′。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

將一定數(shù)量KGN細(xì)胞種于6孔板中，待細(xì)胞密度達(dá)到70%～80%時進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染時，將2 μg Cas9-gRNA-HIF-1α表達(dá)質(zhì)粒與125 μL無血清轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基混合，同時，將5 μL轉(zhuǎn)染試劑lipofectamin 3000與125 μL無血清轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基混合。5 min后，將兩者等比例混勻，并在室溫放置20 min，最后將此混合物加入到6孔板中，并用無血清轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基補(bǔ)齊至1 mL，輕晃混勻，并于37 ℃培養(yǎng)8 h后更換為正常培養(yǎng)基，24 h后可進(jìn)行熒光檢測和藥物篩選。

1.4 細(xì)胞分選

由于Cas9-gRNA-HIF-1α表達(dá)質(zhì)粒的同時表達(dá)抗性標(biāo)簽(Puromycin)和熒光蛋白(GFP)，故細(xì)胞分選時選擇藥物篩選，具體如下：待轉(zhuǎn)染24 h后，在熒光顯微鏡下觀察以確定轉(zhuǎn)染效率，隨即加入嘌呤霉素(2.5 μg/μL)進(jìn)行藥篩，待對照組細(xì)胞完全死亡時，加入正常培養(yǎng)基進(jìn)行恢復(fù)培養(yǎng)。待細(xì)胞恢復(fù)一段時間后，用胰酶消化，并采用有限稀釋法將單個細(xì)胞轉(zhuǎn)移到96孔板中進(jìn)行培養(yǎng)，按正常情況更換培養(yǎng)基。待篩選出的單個細(xì)胞長成細(xì)胞團(tuán)后逐次擴(kuò)大培養(yǎng)至24孔板。同時，收集一部分細(xì)胞提取基因組DNA用于PCR進(jìn)行目的片段擴(kuò)增(引物F：5′-GCTGGAGTGAGTAAAAGGGGA-3′，R：5′-CAAAGCCAACTGATTAAGCCTGG-3′)。

1.5 T7E1酶切實(shí)驗(yàn)及單克隆鑒定

以基因組DNA為模板，根據(jù)gRNA兩側(cè)堿基特點(diǎn)設(shè)計(jì)包含該靶點(diǎn)的克隆引物，通過PCR獲得克隆產(chǎn)物。將敲除組PCR產(chǎn)物與野生型PCR產(chǎn)物等量混合，并退火雜交：若產(chǎn)生非配對的DNA片段，那么，這些片段能被T7E1剪切；若沒有發(fā)生突變，將產(chǎn)生配對的片段，該酶無法進(jìn)行剪切。退火后，在各反應(yīng)體系中分別加入0.5 μL T7E1，37 ℃反應(yīng)30 min后，用2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，分析酶切結(jié)果，并對有剪切條帶產(chǎn)生的單克隆PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序鑒定。

1.6 Western Blot檢測

將一定數(shù)量的正常細(xì)胞和敲除細(xì)胞種于6孔板中，待細(xì)胞生長至80%左右時，用氯化鈷處理12 h，棄培養(yǎng)基并用PBS清洗，隨即加入100 μL裂解液(蛋白抑制劑PMSF∶RIPA裂解液=1∶100)，用細(xì)胞刮反復(fù)刮擦，使細(xì)胞完全脫落后轉(zhuǎn)移至無菌的離心管中，冰上孵育30 min后于4 ℃離心15 min (12 000 r/min)，取上清液。加入5×上樣緩沖液，100 ℃水浴10 min。用10%的SDS-PAGE凝膠進(jìn)行電泳，并經(jīng)轉(zhuǎn)膜、封閉1 h、孵育一抗過夜、TBST漂洗、孵育二抗、TBST再漂洗及ECL顯色等步驟檢測目的蛋白的變化。

1.7 排卵相關(guān)基因的檢測

將細(xì)胞種于6孔板，待細(xì)胞密度達(dá)到80%左右時，用氯化鈷處理正常和HIF-1α特異性敲除細(xì)胞12 h后，分別提取RNA和蛋白并進(jìn)行檢測。RNA的檢測：取出細(xì)胞，吸除培養(yǎng)液，PBS清洗2次，加1 mL RL裂解液，轉(zhuǎn)移至離心管中，每1 mL RL加0.2 mL氯仿，離心，試劑盒提取RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。按照檢測基因的數(shù)目配制合適的體系，進(jìn)行定量檢測，分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果(相關(guān)基因及引物信息詳見表1)。蛋白的檢測：PPARγ檢測方法同1.6，Edn2則用ELISA試劑盒進(jìn)行檢測。

表1 排卵相關(guān)基因引物

2 結(jié)果與分析

2.1 sgRNA的選取及質(zhì)粒的構(gòu)建

在NCBI中查找HIF-1α(Gene ID: 3091)，發(fā)現(xiàn)該基因位于14號染色體q23.2區(qū)域，編碼區(qū)域長52 746 bp。其中，包括16個外顯子和15個內(nèi)含子，編碼826個氨基酸，蛋白質(zhì)大小約為120 ku。已有報(bào)道[14-16]顯示，HIF-1α通過PAS結(jié)構(gòu)域(Per-ARNT-Sim domain，93-339 aa)與HIF-1β結(jié)合以二聚體的形式發(fā)揮作用。為此，在HIF-1α的PAS區(qū)域內(nèi)尋找靶點(diǎn)以破壞HIF-1α的功能。依據(jù)設(shè)計(jì)原則，最終在Exon 5區(qū)域內(nèi)發(fā)現(xiàn)適合的靶序列AAGTGTACCCTAACTAGCCG(對應(yīng)195-201 aa)，該靶點(diǎn)位于PASa(106-162 aa)與PASb(249-300 aa)之間[圖1(a)和(b)]，理論上具有可行性。將設(shè)計(jì)好的Oligo(HIF-1αsgRNA)退火以形成Oligo二聚體，并與Cas9-gRNA載體連接后(即Cas9-gRNA-HIF-1α)，經(jīng)轉(zhuǎn)化、涂板、測序驗(yàn)證[圖1(c)]。

2.2 HIF-1α基因敲除細(xì)胞株構(gòu)建

將Cas9-gRNA-HIF-1α質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到KGN細(xì)胞中，用熒光顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)該質(zhì)粒在KGN細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率約為20%[圖2(a)]。為檢測該質(zhì)粒是否有編輯作用，提取轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的DNA，經(jīng)PCR克隆后測序，發(fā)現(xiàn)在靶點(diǎn)序列附近出現(xiàn)套峰[圖2(b)]，而且在另一細(xì)胞系A(chǔ)2780中也得到類似的結(jié)果(數(shù)據(jù)未展示)，這說明該質(zhì)粒具有編輯HIF-1α的能力。為進(jìn)一步快速獲得單克隆細(xì)胞，用嘌呤霉素進(jìn)行篩選。其間共篩選了21個單克隆細(xì)胞，隨即通過PCR擴(kuò)增編輯區(qū)域片段，并用T7E1酶切法進(jìn)行酶切。若編輯細(xì)胞與野生型細(xì)胞擴(kuò)增片段配對的產(chǎn)物能在短時間內(nèi)被酶切處理后產(chǎn)生3條不同大小的DNA片段(從上到下依次為全長、酶切大片段、酶切小片段)，則說明潛在的突變型已被成功編輯[圖2(c)第3泳道]；若對目標(biāo)樣PCR產(chǎn)物單獨(dú)加酶處理也出現(xiàn)3條帶，則說明該樣品內(nèi)存在編輯后突變的亞型，所提取的細(xì)胞來源并非來自一個單克隆或挑選的單克隆為雜合子[圖2(c)第4泳道]，還需要繼續(xù)挑選單克隆。實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)T7酶切鑒定后，最終獲得5株酶切較微弱的細(xì)胞株(H1、H5、H10、H11和H21)和1株有純合子現(xiàn)象的細(xì)胞株(H20)。為進(jìn)一步明確這些細(xì)胞中編輯HIF-1α的具體位置，分別將它們的PCR克隆產(chǎn)物連接于T載體后，選取10個菌落測序。測序結(jié)果顯示：這6株細(xì)胞的HIF-1α均發(fā)生了編輯。其中，H1插入了1個堿基、H5缺失3個堿基且1個堿基被替換、H10缺失5個堿基、H11有6個被替換堿基、H20缺失4個堿基、H21缺失3個堿基[圖2(d)]。進(jìn)一步分析來源于不同細(xì)胞株的10個單克隆發(fā)現(xiàn)，僅H20為純合子(表2)。

圖1 sgRNA選取與質(zhì)粒的構(gòu)建

細(xì)胞編號Cell number測序結(jié)果Results from sequencing analysis基因型GenetypeH1點(diǎn)突變∶野生型=3∶7突變雜合子H5點(diǎn)突變∶野生型=6∶4突變雜合子H10點(diǎn)突變∶野生型=7∶3突變雜合子H11點(diǎn)突變∶野生型=2∶8突變雜合子H20點(diǎn)突變∶野生型=10∶0突變純合子H21無義突變∶點(diǎn)突變∶野生型=3∶2∶5突變雜合子

2.3 Western Blot 檢測HIF-1α蛋白表達(dá)

為進(jìn)一步驗(yàn)證H20細(xì)胞中HIF-1α蛋白的表達(dá)情況，用氯化鈷處理野生型(HIF-1α+/+)和敲除細(xì)胞(HIF-1α-/-)。免疫印跡結(jié)果(圖3)顯示，氯化鈷可明顯誘導(dǎo)野生型細(xì)胞中的HIF-1α。然而，與正常細(xì)胞相比，H20細(xì)胞中HIF-1α幾乎不表達(dá)，這說明H20細(xì)胞是HIF-1α缺失的穩(wěn)定細(xì)胞株。

(a)熒光檢測Cas9-gRNA-HIF-1α的轉(zhuǎn)染效率；(b)基因編輯后，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測序峰圖；(c)將敲除組靶點(diǎn)附近的PCR產(chǎn)物與野生型PCR產(chǎn)物等量混合，并退火雜交，用T7E1酶切鑒定獲得的單克隆細(xì)胞(黑色箭頭所指條帶表示擴(kuò)增序列完全配對的野生型條帶，紅色和白色箭頭表示T7E1酶從未完全互補(bǔ)配對處酶切后產(chǎn)生的兩個片段)；(d)測序后獲得6組有編輯效果單克隆的序列信息

(a)用氯化鈷(CoCl2)處理野生型(HIF-1α+/+)和H20細(xì)胞(HIF-1α-/-)12 h后，HIF-1α蛋白表達(dá)的免疫印跡；(b)相對定量統(tǒng)計(jì)。**，P<0.01

2.4 HIF-1α基因定點(diǎn)突變細(xì)胞株中相關(guān)基因的表達(dá)

為驗(yàn)證HIF-1α缺失后對HIF-1功能的影響，用氯化鈷處理野生型細(xì)胞和穩(wěn)定敲除細(xì)胞12 h后，檢測HIF-1的下游基因Vegfa、Edn2和PPARγ的表達(dá)。實(shí)時熒光定量PCR結(jié)果顯示[圖4(a)～(c)]：與對照組相比，氯化鈷處理后，這3個基因在野生型細(xì)胞中的表達(dá)量均顯著性升高，然而，在相同情況下，敲除細(xì)胞中Vegfa、Edn2與PPARγ的表達(dá)量明顯下降(其中Edn2和PPARγ最為顯著)。進(jìn)一步在蛋白水平上檢測發(fā)現(xiàn)：當(dāng)氯化鈷處理HIF-1α+/+細(xì)胞時，Edn2和PPARγ的蛋白表達(dá)量明顯增加；而在氯化鈷處理HIF-1α-/-細(xì)胞時，與HIF-1α+/+細(xì)胞相比，兩者的表達(dá)量顯著降低，幾乎與未處理的對照組一致[圖4(d)和(e)]。

(a)～(c)收集樣本后提取RNA，用定量PCR檢測Vegf、PPARγ和Edn2的mRNA變化；(d)收集蛋白樣品，檢測HIF-1α和PPARγ蛋白表達(dá)；(e)同樣的蛋白樣品通過ELISA檢測Edn2的蛋白表達(dá)情況。*，P<0.05；**，P<0.01

3 討論與結(jié)論

本文主要利用CRISPR/Cas9技術(shù)靶向編輯KGN細(xì)胞中HIF-1α基因的PAS區(qū)域，通過基因編輯破壞HIF-1α的結(jié)構(gòu)域，從而使HIF-1功能失活。經(jīng)T7核酸內(nèi)切酶I酶切、測序比對、檢測目的基因及蛋白表達(dá)，最終挑選出一株純合子細(xì)胞株(H20)。

所用CRISPR/Cas9系統(tǒng)的組成較為簡單，只需要單個Cas9蛋白、PAM位點(diǎn)(通常為NGG)和gRNA進(jìn)行識別編輯[10, 17]。用該技術(shù)進(jìn)行基因編輯時，通過gRNA識別靶位點(diǎn)，并由Cas9蛋白結(jié)合至靶點(diǎn)進(jìn)行切割，產(chǎn)生DNA雙鏈缺口，進(jìn)而啟動兩種自身修復(fù)機(jī)制——非同源末端連接和同源重組修復(fù)。其中，非同源末端連接在DNA修復(fù)中發(fā)揮主要作用，由于在修復(fù)連接時易發(fā)生堿基插入或缺失突變，因而，常用于單位點(diǎn)基因敲除或大片段的刪除，這一點(diǎn)在單克隆測序結(jié)果中也能得到體現(xiàn)。鑒于KGN細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率較低，用嘌呤霉素篩選已編輯的細(xì)胞，并通過有限稀釋法挑選出單克隆細(xì)胞。該方法與病毒轉(zhuǎn)染、流式細(xì)胞儀篩選相比，相對簡單，易于操作。為最大程度地對HIF-1α進(jìn)行編輯，將CRISPR/Cas9系統(tǒng)編輯靶點(diǎn)選定于靠近氨基端的PAS區(qū)域，試圖通過編輯使該區(qū)域發(fā)生移碼突變達(dá)到失活HIF-1α的目的，獲得了HIF-1α因缺失4 bp而發(fā)生移碼突變的純合細(xì)胞株(H20)。用免疫印跡檢測時發(fā)現(xiàn)，該細(xì)胞中的HIF-1α幾乎完全缺失，與此同時，其參與調(diào)控的下游基因PPARγ和Edn2也顯著性降低，這說明選擇該靶點(diǎn)對HIF-1α敲除具有較強(qiáng)的可行性。需要說明的是，在檢測Edn2蛋白水平的過程中，通過免疫印跡法并未檢測出Edn2，這可能與其在細(xì)胞中的本底水平較低有關(guān)，抑或是Edn2蛋白質(zhì)本身不穩(wěn)定，迅速降解導(dǎo)致其蛋白水平低而無法檢測，具體原因有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

值得一提的是，CRISPR/Cas9系統(tǒng)的出現(xiàn)給基因研究帶來了光明的前景，目前，該系統(tǒng)已開發(fā)出病毒性、非病毒性和物理介導(dǎo)等多種導(dǎo)入方式以適用于不同的研究[18]。盡管如此，其在基因編輯過程中易出現(xiàn)插入突變、致免疫性和脫靶等的特性仍然極大地限制了CRISPR/Cas9系統(tǒng)的運(yùn)用[13]。有研究人員[19-20]新開發(fā)了一種高精確度的基因編輯技術(shù)——單堿基編輯技術(shù)，無需依賴DNA模板便可有效實(shí)現(xiàn)數(shù)種單堿基的自由轉(zhuǎn)換和多堿基的精準(zhǔn)插入與刪除，這或許為解決目前CRISPR基因編輯技術(shù)的瓶頸打開了一扇窗，值得進(jìn)一步關(guān)注。

本研究在HIF-1α的PAS區(qū)域設(shè)計(jì)特異性靶點(diǎn)，挑選出HIF-1α特異性敲除細(xì)胞株，為在其他細(xì)胞中通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)特異性敲除HIF-1α提供方法借鑒，同時也為繼續(xù)探究HIF-1在由正常排卵事件演變成卵巢腫瘤過程中的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。