不同發(fā)酵劑菌種對Mozzarella干酪成熟過程中蛋白降解及風味形成的影響

白建，趙建英，薛建娥，劉奧強，王亞捷

(呂梁學院 生命科學系，山西 呂梁 033001)

干酪成熟是在合適的溫度和濕度環(huán)境下，干酪基質(zhì)中的乳糖在發(fā)酵劑、非發(fā)酵劑作用下的代謝，蛋白質(zhì)在凝乳酶、蛋白酶、肽酶作用下進行的一系列降解反應以及脂肪的降解，其中蛋白質(zhì)的降解賦予干酪良好的質(zhì)構(gòu)、獨特的風味，而蛋白質(zhì)的降解一般與所使用的發(fā)酵劑種類及數(shù)量有很大的關(guān)系，此外發(fā)酵劑還影響干酪的產(chǎn)率、理化成分及最終產(chǎn)品的品質(zhì)。Rehman等發(fā)現(xiàn)發(fā)酵劑的類型比加工工藝對契達干酪風味形成的影響更重要[1]，劉瑛等研究發(fā)現(xiàn)嗜溫發(fā)酵劑對牦牛乳硬質(zhì)干酪蛋白降解最弱，嗜熱發(fā)酵劑對干酪蛋白降解能力最強，混合發(fā)酵劑對蛋白降解適中[2]。Pisano和Morea報道具有自溶特性的乳酸菌有利于干酪中蛋白的降解、氨基酸的生成及最終品質(zhì)的形成[3-4]，Morea研究報道從干酪中分離的Lactobacillusparacaseisubsp.paracasei和L.parabuchneristrains菌種所制作干酪較對照干酪形成了更多的氨基酸。Irigoyen A在添加Lactobacillusparacasei和Lactobacillusplantarum輔助發(fā)酵劑的羊奶奶酪中檢測出更多的游離氨基酸和風味物質(zhì)[5]。

Mozzarella(莫茲瑞拉)干酪是著名的干酪品種之一，按照水分含量其屬硬質(zhì)、半硬質(zhì)干酪，產(chǎn)品成熟后風味柔和，其加工過程常用的發(fā)酵劑為嗜溫型乳酸菌中的嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌，對不同發(fā)酵劑菌種特別是益生菌對Mozzarella干酪品質(zhì)的影響少有報道，本研究將幾種不同的發(fā)酵劑菌種應用在Mozzarella干酪中，通過對成熟過程中干酪質(zhì)構(gòu)、蛋白降解、風味等品質(zhì)特性的分析，評價不同菌種對Mozzarella干酪品質(zhì)的影響，為益生菌干酪的開發(fā)提供了理論借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

新鮮牛乳：各項指標符合要求，標準化后使C/F(酪蛋白∶脂肪)為0.76。Streptococcussalivariussubsp.thermophilus(唾液鏈球菌嗜熱亞種)CH9和Lactobacillusdelbrueckilsubsp.bulgaricus(保加利亞乳桿菌德氏亞種)LB、LPC-37(植物乳桿菌)、BI-07(雙歧桿菌)、LA-14(嗜酸乳桿菌)、凝乳酶Stamix 1150：CHR HANSEN生產(chǎn)，活力為35000 RU/g，丹尼斯克(北京)有限公司。

1.2 儀器

干酪槽(加工量為2 L)、干酪刀、干酪模具；DL-CJ-2F醫(yī)療型潔凈工作臺、HPP-9272恒溫培養(yǎng)箱 北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；H.H.S21-6電熱恒溫水浴鍋 上海醫(yī)療器械五廠；TDL-離心機 上海安亭科學儀器廠；DZQ400-2D單室真空包裝機 溫州市鼎力包裝機械制造有限公司；TCP2色差儀 北京新奧伊克光電技術(shù)有限公司；L-8900氨基酸自動分析儀 日本日立公司；GC6890-MS5973N氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國Agilent公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 干酪制作

原料乳(標準化)→巴氏殺菌(63 ℃，30 min)→冷卻(至36 ℃)→加發(fā)酵劑(按原料乳量的0.5%加入)→加凝乳酶(添加由2%食鹽水配成的1%凝乳酶溶液)→凝乳→切割→加熱收縮(溫度由36 ℃緩慢升到38 ℃)→排乳清(pH值6.3)→堆釀→加鹽(加鹽量為1.8%)→熱燙、拉伸→冷卻→真空包裝→成熟(4 ℃)。

加入CH9∶LB為1∶1組成的混合發(fā)酵劑，加入LPC-37(植物乳桿菌)、BI-07(雙歧桿菌)、LA-14(嗜酸乳桿菌)發(fā)酵劑各0.50%的干酪分別記為SL、LPC、BI、LA。

1.3.2 測定項目及方法

蛋白質(zhì)含量采用凱式定氮法測定；脂肪含量按GB/T 5009.6-2003中方法測定；水分含量按GB/T 5009.3-2003中方法測定；鹽含量采用硝酸銀滴定法；pH測定參考Giannoglou等的方法[6]；出品率按照以下公式進行計算。

WSN、12% TCA-SN、5% PTA-N、FAA的測定：WSN參考Bütikofer等的方法[7]，10 g干酪加入50 mL純凈水在40 ℃下勻漿1 h，然后在4 ℃下，3000 g×30 min，上清液用濾紙過濾，凱氏定氮法測定氮含量。12% TCA-SN參考劉會平等的方法[8]，稱取1.5 g干酪，與45 mL 12%的TCA溶液充分混合、勻漿，以4000 r/min離心20 min，取上清液定量地移入凱氏消化瓶中，進行半凱氏定氮。5% PTA-N 參考Bütikofer 等和Katsiari等的方法[9]，10 mL水溶性提取液加入3.95 mol/L硫酸7 mL和330 g/L磷酸3 mL，充分混合后于4 ℃放置過夜，濾紙過濾，采用凱氏定氮法測定上清液中氮含量。FAA 參考Dimitrellou等的方法[10]，取 20 g干酪加入純凈水210 mL，在40 ℃下勻漿并過濾，測定上清液中水溶性游離氨基酸含量。

風味物質(zhì)的檢測：稱取3 g干酪放在萃取瓶中，在80 ℃下萃取，吸附30 min，然后進行GC-MS檢測。HP-5色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，載氣為氦氣，流速為1 mL/min。不分流方式進樣，進樣口溫度維持在250 ℃。程序升溫條件：首先以40 ℃保持10 min，然后以5 ℃/min的速率升溫至110 ℃，最后以10 ℃/min的升溫速率升至240 ℃，保持10 min，以電子轟擊方式，能量為70 eV進行MS運行，壓力為1650 V，數(shù)據(jù)以35～400 amu的掃描范圍進行收集，通過比較揮發(fā)性風味物質(zhì)的質(zhì)譜數(shù)據(jù)與計算機標準譜圖庫NIST 98中的數(shù)據(jù)以及與以前文獻報道過的成分相對照，對干酪中的揮發(fā)性風味物質(zhì)進行定性、半定量分析[11-14]，以匹配度確定化合物的名稱。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同菌種對干酪組成成分的影響

表1 不同菌種制作干酪的基本成分Table 1 The basic components of cheeses made by various strains

續(xù) 表

由表1可知，不同菌種制作干酪的水分含量、S/M雖然有差異，但彼此間不顯著(P>0.05)，而脂肪含量、蛋白質(zhì)含量、出品率和pH值彼此間差異顯著 (P<0.05)，SL和LPC干酪的脂肪含量顯著高于LA和BI干酪(P<0.05)，LPC、LA、BI干酪的蛋白質(zhì)含量、出品率和pH值顯著低于SL干酪?？赡芘c益生菌代謝乳糖的機制不同進而生成乳酸的量不同，不同的pH值環(huán)境影響干酪凝膠的組織結(jié)構(gòu)，進而影響干酪基質(zhì)中的干物質(zhì)含量。添加益生菌的干酪減少了乳酸的生成，Leroy和 De Vuyst發(fā)現(xiàn)添加益生菌的干酪成熟過程中生成的乳酸較少，主要是因為益生菌缺少β-半乳糖苷酶，進而對乳糖的分解利用能力變差[15-16]，Mc Brearty 等報道Lactobacillus和Bifidobacterium在乳糖濃度較低時可以利用異型代謝途徑生成乳酸和醋酸[17]，Ong等發(fā)現(xiàn)添加益生菌干酪中的醋酸含量較高[18]。

2.2 不同菌種對干酪成熟過程中蛋白降解的影響

圖1 不同菌種制作Mozzarella干酪成熟過程中 蛋白降解的變化Fig.1 Changes of proteolysis for Mozzarella cheese made by different strains during ripening process

蛋白降解是干酪成熟過程中重要的反應，Mozzarella干酪中由蛋白質(zhì)降解轉(zhuǎn)化而來的風味化合物包括肽類、氨基酸以及氨基酸在轉(zhuǎn)氨酶、脫羧酶等作用下進一步代謝生成的酮、酸、醛、醇、酚、醚、吲哚、胺等。不同發(fā)酵劑的蛋白水解酶系及肽類轉(zhuǎn)運系統(tǒng)不同，進而其蛋白水解的程度不同，表現(xiàn)在蛋白水解的深度和廣度不同。常用評價蛋白水解的指標包括水溶性氮、12%三氯乙酸溶解性氮、5%磷鎢酸氮以及游離氨基酸的量。由圖1可知，4種發(fā)酵劑菌種制作干酪成熟過程中的可溶性蛋白及游離氨基酸含量都隨著成熟時間的延長而增加，與Giannoglou 等研究發(fā)現(xiàn)高壓處理菌種制作干酪及高壓處理干酪后溶解性氮含量顯著增加的結(jié)果相似。BI干酪在成熟過程中WSN/TN、PTA-N/TN含量顯著高于其他組干酪，成熟120 d時BI和LPC干酪組TCA-N/TN高于SL和LA組，整個成熟期間BI、LA、LPC組干酪FAA含量都顯著高于SL干酪(P<0.05)，益生菌LPC、LA、BI對干酪中蛋白降解影響較大，與Bezerra等的研究報道添加益生菌BB-12的羊奶Coalho干酪在28 d的成熟過程中水溶性氮含量極顯著高于其他幾種益生菌干酪一致[19]，Albenzio等報道動物雙歧桿菌BB-12對干酪中蛋白水解作用較強，在干酪成熟過程中可以形成大量的游離氨基酸和水溶性肽，添加益生菌的干酪在28 d的成熟過程中蛋白水解深度指數(shù)較高，幾種益生菌混合干酪的蛋白水解深度指數(shù)在整個成熟過程中高于其他干酪相似[20]，歸因于多種益生菌對蛋白水解的協(xié)同作用，益生菌干酪的蛋白水解深度指數(shù)高于普通菌種干酪，充分說明益生菌的蛋白水解活性高于普通菌種。Albenzio和Randazzo發(fā)現(xiàn)益生菌具有光譜的酶系，這些酶催化的生化反應形成的物質(zhì)有利于干酪質(zhì)構(gòu)及良好風味的形成，進而提高干酪的感官及營養(yǎng)價值[21]。Irigoyen等發(fā)現(xiàn)添加L.paracasei和L.plantarum干酪中的亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、絲氨酸、丙氨酸的含量高于Lactococcuslactissubsp.lactis和Lactococcuslactissubsp.cremoris菌種制作的干酪。

2.3 不同菌種對干酪成熟過程中風味的影響

表2 不同菌種制作Mozzarella干酪成熟120 d時的 揮發(fā)性風味化合物含量Table 2 The content of volatile compounds in Mozzarella cheese made by different strains at ripening for 120 days

由表2可知，從4種不同菌種制作干酪中鑒定到了30種主要的揮發(fā)性風味化合物，包括3種烷烴、5種醇類、4種醛類、6種酮類、3種酸類、6種酯類、3種其他化合物，這些化合物是干酪中主要的揮發(fā)性風味物質(zhì)。在LPC、LA、BI干酪中2-甲基丁烷、癸烷、己烷含量都低于SL干酪，而BI干酪中的含量更低。乙醇、己醇、辛醇的含量在LPC、LA、BI干酪中低于SL干酪，而壬醇和2-呋喃甲醇含量高于SL干酪，BI干酪中醇類的含量低于LPC和LA。醇類中的1-丙醇具有辛辣的酒精味道，1-丁醇具有芳香的水果味道[22]。干酪成熟過程中，醛類是不穩(wěn)定的物質(zhì)，容易被還原成醇類和氧化成酸類，庚醛、辛醛、癸醛、苯甲醛、2-戊烯醛、2,4-二烯醛含量高會導致干酪的不良風味[23]，n-丁醛具有青草的味道，濃度高時有不愉快的味道。苯乙醛、2-甲基丁醛在LPC、LA、BI干酪中的含量低于SL，庚醛和丙醛在BI中低于SL。酮類在LPC、LA、BI干酪中的含量都低于SL，而BI干酪中的酮類低于LPC和LA，Bezerra等發(fā)現(xiàn)由L.paracasei菌種制作羊奶干酪成熟28 d時酮類的含量最高[24]。2-庚酮作為藍紋干酪主要的香味物質(zhì)在4種干酪中也被檢測到，含量都相對較高且彼此間差異不大。2,3-丁二酮、3-羥基-2-丁酮和2-丁酮主要是微生物通過代謝檸檬酸和雙乙酰而形成，2-丁酮被認為具有奶油和酯香的味道，2,3-丁二酮具有黃油、奶酪和焦糖的味道[25]。辛酸、癸酸、醋酸的含量在LPC、LA、BI干酪中高于SL干酪，這與報道的結(jié)果一致。益生菌在干酪成熟的后期更有利于生成各種酸類，LPC、LA、BI屬厭氧菌，在干酪相對厭氧的環(huán)境中能很好進行殘留乳糖的代謝進而生成酸類。酯類是干酪中的主要風味物質(zhì)，主要通過醇(主要是乙醇)和酸的酯化反應形成，乙酯類賦予干酪水果的香味，在4種干酪檢測到了常見的酯類物質(zhì)，除十八醇酸丁酯和十六烷酸丁酯外，其他的酯類特別是乙酸乙酯、己酸乙酯和癸酸乙酯在LPC、LA、BI干酪中的含量明顯高于SL干酪，而LPC、LA中酯類的含量又高于BI，Bezerra等研究發(fā)現(xiàn)由L.acidophilus制作的羊奶奶酪成熟28 d時癸酸乙酯的含量最高。檸檬烯的含量在SL干酪中較高，而吲哚和2-甲基吲哚的含量在BI干酪中含量較高。Irigoyen發(fā)現(xiàn)添加L.paracasei和L.plantarum干酪中的17種烴類、17 種醇類、2 種含硫化合物、11種醛類、12 種酮類、6種酸類和8 種酯類風味物質(zhì)含量顯著高于Lactococcuslactissubsp.lactis和Lactococcuslactissubsp.cremoris菌種制作干酪。Albenzio和Randazzo也報道干酪中的益生菌代謝形成的酶催化的生化反應對干酪質(zhì)構(gòu)和風味的形成影響較大，添加益生菌能夠提高低脂契達干酪的風味。Banks等發(fā)現(xiàn)L.casei和L.paracasei可以降低契達干酪中的苦味而提高干酪的風味[26]，Ryh?nen等發(fā)現(xiàn)雙歧桿菌可以使干酪生成良好的風味而避免醋酸的不良風味，添加益生菌的低脂契達干酪形成了水果的味道同時提高了其口感[27]。

3 結(jié)論

不同發(fā)酵劑菌種顯著影響干酪成品的蛋白質(zhì)含量、脂肪含量、pH值、出品率，對水分含量、S/M的影響不顯著。BI干酪在成熟過程中WSN/TN、PTA-N/TN含量顯著高于其他組干酪，成熟120 d時BI和LPC干酪組TCA-N/TN高于SL和LA組，整個成熟期間BI、LA、LPC組干酪FAA含量都顯著高于SL干酪(P<0.05)。成熟120 d的LPC、LA、BI干酪中烷烴類、酮類、部分醇類(乙醇、己醇、辛醇)和苯乙醛、2-甲基丁醛的含量低于SL干酪，而酸類和酯類(除十八醇酸丁酯和十六烷酸丁酯)外的含量高于SL干酪。