正交試驗(yàn)優(yōu)化黑米黃酮的提取工藝

劉麗珍，劉建霞，劉文英，米智*，車鋒，田計(jì)軍

(1.山西大同大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 大同 037009；2.山西大同大學(xué) 應(yīng)用生物技術(shù)研究所，山西 大同 037009)

黑米是一種黑稻加工產(chǎn)品，為禾本科植物非糯性稻，經(jīng)長(zhǎng)期培育而成[1-2]。與普通白米相比，黑米所含無(wú)機(jī)鹽高1～3倍；蛋白質(zhì)高46%～66%，其氨基酸組成接近于人體；更含有白米缺乏的特殊成分，如花青素、胡蘿卜素、葉綠素和強(qiáng)心甙等[3-4]，因而更具營(yíng)養(yǎng)和保健功能[5]，素有“黑珍珠”和“世界米中之王”的美譽(yù)。黑米還具有清除自由基、抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)、免疫調(diào)節(jié)、降低動(dòng)脈硬化、預(yù)防心腦血管疾病等多種生理功能[6-7]?！侗静菥V目》記載：黑米有“滋陰補(bǔ)腎，健身暖胃，明目活血，補(bǔ)肺緩筋”等藥效；對(duì)頭昏目眩、腰膝酸軟、夜盲耳鳴癥等的療效尤佳。黃酮類化合物的基本母核是2-苯基色原酮[8]，為植物的重要次生代謝產(chǎn)物，無(wú)法自主合成，只能從日常食物中攝取，多存在于水果、蔬菜、谷物、豆類和茶葉中[9-11]，具有高度的化學(xué)反應(yīng)性能，能夠清除體內(nèi)自由基、抗菌消炎、改善血液循環(huán)等[12-14]。黑米黃酮化合物可維持血管的滲透壓，降低血管脆性，防止血管破裂，消炎止血及提高免疫力等。

目前，黃酮的提取方法有長(zhǎng)期浸出法、超聲波提取法、酶提取法、水蒸氣蒸餾法等，這些方法花費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)、溶劑用量大、效率不高。本試驗(yàn)采用的索氏提取法具有選擇性好、能耗低、設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方便等優(yōu)點(diǎn)。黃酮易溶于甲醇、乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑，但甲醇、丙酮有一定的毒性，乙醇無(wú)毒、沸點(diǎn)低，且作為提取劑回收利用方便，可降低成本[15-17]。本研究以黑米為原料，利用索式提取法提取黃酮并通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化最佳提取條件，為黑米黃酮在食品、藥品研究領(lǐng)域提供了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑米：山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院高寒區(qū)作物研究所；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(純度>98%)：上海源葉生物科技有限公司；無(wú)水乙醇、Al(NO3)3·9H2O、NaNO2、NaOH：均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

9070MBE型電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；XFB-200型小型中藥粉粹機(jī) 吉首市中誠(chéng)制藥機(jī)械廠；JA5003B型精密電子分析天平 上海精科天美科學(xué)儀器有限公司；SHSL型電熱套 上海樹立儀器儀表有限公司；250 mL索氏提取器、UV-1200型紫外可見分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

稱取10 mg干燥的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，加無(wú)水乙醇搖勻，充分溶解并定容至50 mL，得 0.2 mg/mL 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液，置于4 ℃冰箱中保存。同時(shí)做空白對(duì)照，在510 nm處測(cè)其吸光度，重復(fù)3次，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，見表1。

表1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作Table 1 The making of rutin standard curve

1.3.2 黑米的選擇及黃酮提取工藝

選用有光澤、米粒大小均勻、無(wú)爆腰、飽滿度好、無(wú)蟲、不含雜質(zhì)的黑米。將黑米用小型中藥粉碎機(jī)粉碎后過(guò)60目篩，包濾紙分裝，收集于干凈的塑封袋中。粉末稱重→索式提取→提取液定容→測(cè)吸光度→計(jì)算提取率。

1.3.3 黑米總黃酮的測(cè)定方法

準(zhǔn)確吸取1 mL的上述待測(cè)液，用分光光度計(jì)測(cè)樣品液的吸光度，重復(fù)3次，方法同1.3.1，代入回歸方程計(jì)算出黑米黃酮的提取率。

式中：P表示提取液黃酮質(zhì)量濃度，mg/mL；N表示稀釋倍數(shù)；V表示提取液總體積，mL；M表示樣品質(zhì)量，mg。

1.3.4 單因素試驗(yàn)1.3.4.1 乙醇濃度

準(zhǔn)確稱取黑米粉末(4.000±0.001) g，在液料比為30∶1、回流時(shí)間為2 h、提取次數(shù)為3次的條件下，設(shè)定乙醇濃度為30%、40%、50%、60%、70%、80%索式提取黑米總黃酮，測(cè)定所提取溶液的吸光度?？疾觳煌掖紳舛葧r(shí)黃酮的提取率。

1.3.4.2 液料比

準(zhǔn)確稱取黑米粉末(4.000±0.001) g，在乙醇濃度為60%、回流時(shí)間為2 h、提取次數(shù)為3次的條件下，設(shè)定液料比為20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1 (mL/g)索式提取黑米中的總黃酮，測(cè)定所得溶液的吸光度?？疾觳煌毫媳葧r(shí)黃酮的提取率。

1.3.4.3 提取次數(shù)

準(zhǔn)確稱取黑米粉末(4.000±0.001) g，在乙醇濃度為60%、回流時(shí)間為2 h、液料比為30∶1的條件下，設(shè)定提取次數(shù)為1，2，3，4，5次提取黑米中的總黃酮，測(cè)定所得溶液的吸光度。考察不同提取次數(shù)時(shí)黃酮的提取率。

1.3.4.4 回流時(shí)間

準(zhǔn)確稱取黑米粉末(4.000±0.001) g，在乙醇濃度為60%、液料比為30∶1、提取次數(shù)為3次的條件下，設(shè)定回流時(shí)間為0.5，1，1.5，2，2.5 h提取黑米中的總黃酮，測(cè)定所得溶液的吸光度?？疾觳煌亓鲿r(shí)間時(shí)黃酮的提取率。

1.3.5 黑米總黃酮提取工藝的正交試驗(yàn)

在乙醇濃度、液料比、提取次數(shù)和回流時(shí)間 4個(gè)單因素中，分別選取3個(gè)影響最大的因素為水平，做 L9(34)正交試驗(yàn)，重復(fù)3次，以考察黑米黃酮的最佳提取條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of rutin

由圖1可知，標(biāo)準(zhǔn)曲線的橫坐標(biāo)為蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品濃度(P，m/V)，縱坐標(biāo)為其吸光度值，得到回歸方程：y=12.473x+0.0151，R2=0.9955，呈良好的線性關(guān)系。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 乙醇濃度對(duì)黑米黃酮提取率的影響

圖2 乙醇濃度對(duì)黃酮提取率的影響Fig.2 The effect of ethanol concentration on the extraction rate of flavonoids

由圖2可知，黑米黃酮提取率隨著乙醇濃度的不斷加大而增加；乙醇濃度在60%時(shí)，黃酮的提取率為最大值4.46%；之后乙醇濃度繼續(xù)加大，黃酮的提取率反而下降。這可能是因?yàn)槿軇w積分?jǐn)?shù)的升高增加了乙醇對(duì)黑米的滲透性和對(duì)細(xì)胞膜的破壞性，從而增大了黃酮類化合物的溶解度，提取率也相應(yīng)增大；在乙醇濃度為60%時(shí)，提取率達(dá)到最高；當(dāng)乙醇濃度繼續(xù)增加會(huì)使一些醇溶性色素、脂溶性物質(zhì)和糖類等雜質(zhì)溶出，從而降低了黃酮物質(zhì)的溶解，導(dǎo)致黑米黃酮類物質(zhì)提取率下降[18]。因此在做正交試驗(yàn)時(shí)，分別選取乙醇濃度為 50%、60%、70%做3個(gè)水平。

2.2.2 液料比對(duì)黑米黃酮提取率的影響

圖3 液料比對(duì)黃酮提取率的影響Fig.3 The effect of liquid to solid ratio on the extraction rate of flavonoids

由圖3可知，黑米黃酮提取率隨著液料比的增加而增大；當(dāng)液料比為30∶1時(shí)，黑米黃酮提取率達(dá)到最大值，約為4.46%；隨著液料比的繼續(xù)增加，黃酮提取率反而降低?？赡苁且?yàn)橐毫媳冗^(guò)小時(shí)，溶劑尚未與樣品充分接觸；隨著液料比的增大，溶劑與樣品接觸達(dá)到最大；之后隨著液料比的進(jìn)一步加大，細(xì)胞破裂程度下降，黑米黃酮類物質(zhì)分子的溶出已達(dá)飽和，溶出的其他雜質(zhì)與黃酮溶出物形成競(jìng)爭(zhēng)，且被溶解的黃酮發(fā)生變性分解，這些導(dǎo)致了黃酮提取率的下降[19]。因此在做正交試驗(yàn)時(shí)，選取液料比為20∶1、30∶1、40∶1做3個(gè)水平。

2.2.3 提取次數(shù)對(duì)黑米黃酮提取率的影響

圖4 提取次數(shù)對(duì)黃酮提取率的影響Fig.4 The effect of extraction times on the extraction rate of flavonoids

由圖4可知，隨著黑米黃酮提取次數(shù)的增加,提取率呈上升趨勢(shì)，當(dāng)提取次數(shù)為4次時(shí)，黃酮的提取率達(dá)到最大，約為3.47%；超過(guò)4次后，黑米黃酮的提取率開始下降。因此做正交試驗(yàn)時(shí)，選擇提取次數(shù)為3，4，5次做3個(gè)水平。

2.2.4 回流時(shí)間對(duì)黑米黃酮提取率的影響

圖5 回流時(shí)間對(duì)黃酮提取率的影響Fig.5 The effect of reflux time on the extraction rate of flavonoids

由圖5可知，回流時(shí)間在0.5～1.5 h之內(nèi)，黑米黃酮的提取率呈上升趨勢(shì)；1.5 h時(shí)，黑米黃酮提取率達(dá)到最高值，約為5.42%；當(dāng)回流時(shí)間超過(guò)1.5 h時(shí)，黑米黃酮的提取率開始下降。因此選擇回流時(shí)間為1，1.5，2 h做正交試驗(yàn)。

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果

綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，以乙醇濃度、液料比、提取次數(shù)、回流時(shí)間為考察因素，以黃酮提取率為指標(biāo)，做4因素3水平正交試驗(yàn)，重復(fù)3次，結(jié)果見表2。

表2 L9(34)正交試驗(yàn)因素水平表Table 2 The factors and levels of L9(34)orthogonal test

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 3 The results and analysis of orthogonal test

由表3可知，黑米黃酮的最佳組合為A1B2C2D2，由極差值R可知，索式提取黑米黃酮的影響順序?yàn)锽>D>A>C。即乙醇濃度為50%，液料比為30∶1，提取次數(shù)為4次，回流時(shí)間為1.5 h時(shí)，黃酮的提取率最大。用優(yōu)化的組合重復(fù)3 次做驗(yàn)證試驗(yàn)，得出的提取率為 5.71%。

表4 方差分析表Table 4 Analysis of variance table

由表4可知，索式提取法提取黑米黃酮的4個(gè)因素對(duì)黃酮的提取率影響不顯著。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)運(yùn)用索式提取法提取黑米中的黃酮，根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果和正交試驗(yàn)得出了最佳工藝條件：乙醇濃度為50%，液料比為30∶1，提取次數(shù)為4次，回流時(shí)間為1.5 h時(shí)，該條件下，黃酮提取率最高，達(dá)5.71%。影響順序?yàn)锽>D>A>C，4個(gè)因素對(duì)黑米黃酮提取的影響均不顯著。驗(yàn)證試驗(yàn)說(shuō)明該結(jié)果可靠，為黑米黃酮的進(jìn)一步研究提供了理論依據(jù)。