INHA、INHBA 基因在單、多羔黔北麻羊不同組織的表達研究

張 艷 ，敖 葉，周志楠，韋仕南，陳 祥*，洪 磊，宋俊偉

（1.貴州大學高原山地動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室，貴州省動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，貴州貴陽 550025；2.貴州大學動物科學學院，貴州貴陽 550025；3.貴陽市花溪區(qū)農(nóng)業(yè)局，貴州貴陽 550025）

黔北麻羊是貴州省地方肉用山羊品種之一，有著獨特的生境特征、體貌特征及生產(chǎn)、繁殖性能特征。黔北麻羊產(chǎn)肉性能好，繁殖率高，抗病力強，適應山區(qū)粗放飼養(yǎng)，具有較大的發(fā)展?jié)摿Γ?011 年被列入《中國畜禽遺傳資源志·羊志》，成為國家級新遺傳資源[1]。

抑制素（Inhibin，INH）是由羊卵巢顆粒細胞和睪丸支持細胞分泌的糖蛋白激素，屬于轉(zhuǎn)化生長因子β（Transforming Growth Factor-β，TGFβ）超家族成員，在哺乳動物體內(nèi)分布廣泛。該家族主要調(diào)控細胞的生長與分化，由α亞基和β亞基（βA、βB）構(gòu)成。抑制素α亞基（INHA）由α亞基二硫鍵連接而成，抑制素βA亞基（INHBA）基因則由α亞基和βA亞基所組成[2-3]。抑制素可協(xié)同激活素通過內(nèi)分泌、旁分泌以及自分泌等途徑特異性抑制垂體前葉合成并分泌促卵泡素（FSH）與促黃體素（LH）進而影響雌性動物卵泡的發(fā)育和排卵的數(shù)量，但抑制素分泌過多則會抑制FSH 與LH 的分泌[4]。有研究表明，INHA基因主要在卵巢顆粒細胞中表達，可能會通過調(diào)節(jié)其mRNA 表達量的變化影響從江香豬卵巢的生長和卵泡的發(fā)育[5]。此外，在小尾寒羊上的研究發(fā)現(xiàn)INHA基因AB 型的平均產(chǎn)羔數(shù)比AA型多0.57 只，在卵泡生長發(fā)育的各個階段均能檢測到INHA基因的表達[6]。山羊INHBA基因位于3 號染色體的第4 個外顯子區(qū)域內(nèi)，有研究表明INHBA基因可能是控制山羊高繁殖力性狀的主效基因，或與之存在一定程度的連鎖[7]。Hiendleder[8]發(fā)現(xiàn)INHBA基因?qū)d羊產(chǎn)羔數(shù)有著顯著效應，INHBA基因也可以影響巴美肉羊的產(chǎn)羔數(shù)[9]。另外INHBA基因在牛卵泡顆粒細胞增殖、凋亡以及排卵過程中發(fā)揮重要作用[10]。目前，有研究顯示INHA、INHBA基因不僅在動物進化中比較保守，同時也已被確定為細毛羊多胎性狀的候選基因[11]，但兩者在黔北麻羊中的研究鮮見報道。本實驗以單、多羔黔北麻羊為研究對象，采用實時熒光定量PCR 技術(shù)檢測目的基因INHA、INHBA在單、多羔黔北麻羊不同組織中的表達量，為進一步探究INHA、INHBA基因與黔北麻羊產(chǎn)羔性狀的遺傳機制及基因功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 黔北麻羊來自貴州省習水縣富興畜牧業(yè)有限公司，本實驗選取經(jīng)產(chǎn)單、多羔黔北麻羊母羊各6只進行屠宰，采集子宮、輸卵管、垂體、下丘腦和卵巢等5 個組織，置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要儀器 紫外可見分光光度計，購自美國Thermo Fisher 有限公司；電泳儀（DYY-2C 型），購自北京市六一儀器廠；PCR 擴增儀（C1000 TouchTM）、實時熒光定量PCR 儀（型號為CFX96 Real-Time System）、凝膠成像系統(tǒng)（Universal Hood Ⅱ），均購自美國BIO-RAD 有限公司。

1.3 主要試劑 RNA 提取試劑TRIzol、液氮（-196℃）、三氯甲烷、0.5×TAE 緩沖液、異丙醇、75% 乙醇、西班牙瓊脂糖購自貴州羅德宏信生物技術(shù)有限公司；熒光定量試劑2×Ts Master qRT-PCR Mix 購自擎科生物科技有限公司；cDNA 第一鏈合成逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 組織中提取RNA 及cDNA 的合成 按照TRIzol法提取單、多羔黔北麻羊子宮、輸卵管、垂體、下丘腦、卵巢組織中的總RNA，采用cDNA 第一鏈合成試劑盒對提取的組織總RNA 進行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA 第一鏈。將單、多羔母羊不同組織RNA 濃度分別定量至100 ng/μL，逆轉(zhuǎn)錄體系為20 μL：RNA 模板1 ng/μL，dNTP Mix 2.5 mM Each 4 μL，Primer Mix 2 μL，5×RT Buffer 4 μL，DTT（0.1 mol/L）2 μL，HiFi Script 1 μL，RNase-Free Water 6 μL。將以上體系加入無酶0.2 mL的PCR 小管，振蕩混勻，短暫離心后，于PCR 儀上42℃孵育50 min，85℃孵育5 min。反應結(jié)束后，取1 μL 反應產(chǎn)物于超微量紫外分光光度計進行濃度和純度檢測，-20℃保存，備用。

1.4.2 引物設計 根據(jù)GenBank 上傳的山羊INHA基因與INHBA基因序列，設計INHA基因、INHBA基因熒光定量引物（Primer Premier 5.0 軟件），以β-actin為熒光定量內(nèi)參基因，送生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物信息見表1。

1.4.3 實時熒光定量PCR 條件優(yōu)化及反應 運用qRTPCR 對INHA、INHBA基因在單、多羔黔北麻羊子宮、輸卵管、垂體、下丘腦、卵巢等組織的表達水平進行檢測，對退火溫度及引物進行摸索并優(yōu)化反應條件，確定最佳反應體系及退火溫度。β-actin為內(nèi)參基因，在每次實驗時設計3 個相同水平的重復，最終確定實時熒光定量PCR 實驗最佳條件，并將單、多羔黔北麻羊母羊的不同組織cDNA 等濃度稀釋（500 ng/μL），qRT-PCR 反應體系為10 μL：qPCR Mix 5 μL、上下游引物（10 pmol/L）各0.3 μL、cDNA 1 ng/μL、ddH2O 3.4 μL。反應程序為：95℃預變性135 s；95℃變性15 s；退火30 s（INHA、INHBA基因最佳退火溫度為56.7℃）；68℃延伸30 s；由機器自動設置（基礎溫度60℃ 每5 s 增加0.5℃擴增至95℃）進行熔解曲線分析。

1.4.4 統(tǒng)計分析 采用2-△△Ct法分析INHA、INHBA基因在單、多羔黔北麻羊子宮、輸卵管、垂體、下丘腦、卵巢中的差異表達量，用T 檢驗對INHA、INHBA基因在單、多羔黔北麻羊不同組織中的表達差異性并用單因素方差分析與最小顯著性差異檢驗表達水平。

2 結(jié)果與分析

2.1INHA、INHBA基因在各組織中PCR 擴增產(chǎn)物的檢測 以合成的cDNA 第一鏈為模板對INHA、INHBA基因進行普通PCR 擴增，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結(jié)果可見目的產(chǎn)物條帶透明、引物二聚體極弱，特異性強，與目的片段大小一致（圖1），可用于進行下一步實驗。

2.2 qRT-PCR 的擴增曲線和熔解曲線 由圖2、圖3 可知，經(jīng)過熒光定量PCR 反應后得到的擴增曲線和熔解曲線，在黔北麻羊各組織中INHA、INHBA基因擴增曲線呈現(xiàn)完好的“S”形狀，曲線平滑未出現(xiàn)特殊趨勢。循環(huán)閾值（CT）都處于擴增曲線的對數(shù)期，熔解曲線均呈單峰，峰值較好，無引物二聚體，特異性強，無雜峰。

表1 引物序列信息

圖1 瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果

圖2 INHA 基因擴增曲線與熔解曲線

圖3 INHBA 基因擴增曲線與熔解曲線

2.3INHA、INHBA基因在黔北麻羊不同組織中的表達分析 由圖4 可知，INHA基因在單、多羔黔北麻羊子宮、輸卵管、垂體、下丘腦、卵巢5 個組織中均有表達，在卵巢組織中表達量最高且表達高于其他組織（P＜0.01）。INHA基因在單羔黔北麻羊各組織中表達量依次為：卵巢＞輸卵管＞垂體＞下丘腦＞子宮，卵巢表達極顯著高于子宮、輸卵管、垂體和下丘腦4 個組織，輸卵管表達也高于子宮、垂體和下丘腦（P＜0.01），其余組織間的表達均未達到差異顯著水平；INHA基因在多羔黔北麻羊中表達量依次為：卵巢＞垂體＞下丘腦＞輸卵管＞子宮，垂體組織表達高于子宮和輸卵管（P＜0.01）。單、多羔組間對比分析可知單羔卵巢組織表達高于多羔卵巢組織（P＜0.01），單羔輸卵管表達高于多羔組（P＜0.01）；其中多羔組的垂體表達高于單羔組（P＜0.01），而多羔組下丘腦表達高于單羔組（P＜0.05），在子宮中表達差異未達到顯著水平。

由圖5 可知，INHBA基因在單、多羔黔北麻羊子宮、輸卵管、垂體、下丘腦、卵巢等5 個組織中均有表達，均在卵巢組織中的表達量最高且高于其他組織（P＜0.01）。INHBA基因在單羔黔北麻羊各組織中表達量依次為：卵巢＞輸卵管＞子宮＞垂體＞下丘腦，卵巢表達高于其余4 個組織（P＜0.01），子宮、輸卵管和卵巢組織表達均高于下丘腦組織（P＜0.01），而子宮表達高于垂體組織（P＜0.05），其余組織間均未達到差異顯著水平。INHBA基因在多羔黔北麻羊各組織中表達量依次為：卵巢＞子宮＞輸卵管＞垂體＞下丘腦，子宮表達量高于輸卵管、垂體和下丘腦組織（P＜0.01）；輸卵管和垂體表達均高于下丘腦（P＜0.05），其余組織間未達到差異顯著水平。單、多羔組間進行對比分析可知，多羔組卵巢和子宮的表達量均高于對應單羔組（P＜0.01）；且多羔組下丘腦表達高于單羔組（P＜0.01）；其余組織間未達到顯著水平。

圖4 INHA 基因在單、多羔黔北麻羊不同組織表達差異

圖5 INHBA 基因在單、多羔黔北麻羊不同組織表達差異

3 討 論

3.1INHA基因在黔北麻羊單、多羔性腺軸組織中的變化規(guī)律 本研究通過qRT-PCR 技術(shù)對INHA基因在單、多羔黔北麻羊各組織中的表達進行了檢測，均檢測到了不同程度的表達，而鄭杰等[12]研究也發(fā)現(xiàn)INHA基因在2 個不同山羊品種的卵巢、垂體均有表達，發(fā)現(xiàn)在單、多羔組內(nèi)均是卵巢組織表達極顯著高于其他組織，但2 個品種間無顯著性差異的結(jié)果與本實驗結(jié)果相反，可能基于不同品種及地理氣候環(huán)境間的差異導致。靳興濤等[13]研究發(fā)現(xiàn)INHA基因在多浪羊和卡拉庫爾羊卵巢組織皆有表達，推測該基因可能定位于山羊的卵巢組織，而本實驗發(fā)現(xiàn)INHA在單、多羔組黔北麻羊卵巢組織中表達量均最高，推測INHA基因可能與山羊的產(chǎn)羔率存在一定的相關(guān)性，但對其是否在黔北麻羊的卵泡發(fā)育過程中存在類似的功能還需進一步研究。Cui 等[14]研究發(fā)現(xiàn)，qRT-PCR 技術(shù)顯示INHA主要在雞第300 天的卵泡中表達，在排卵前第五大卵泡（F5）中發(fā)現(xiàn)最高的INHAmRNA 豐度，說明該基因的表達不是持續(xù)性表達，在排卵前的極高表達推測其可能有助于排卵，但本研究還未深入到卵泡發(fā)育及排卵階段，對于山羊是否也存在類似的現(xiàn)象有待深究；易凡利等[15]研究發(fā)現(xiàn)，與未發(fā)情期相比，INHA基因在發(fā)情期香豬卵巢中的表達水平極顯著升高，并且對卵巢組織有一定的調(diào)節(jié)作用；對于黔北麻羊而言，在不同卵泡發(fā)育階段INHA基因的表達是否存在差異性表達，甚至是不表達，尚不能定論。本研究結(jié)果顯示INHA基因在多羔組的卵巢組織表達極顯著高于單羔組卵巢組織，與趙中權(quán)[16]研究發(fā)現(xiàn)INHA基因在山羊性腺軸卵巢組織中表達水平均最高的實驗結(jié)果相同，說明INHA基因主要存在卵巢中，但對其在卵巢組織中具體發(fā)揮某種功能，以及是否有助于提高排卵率還需更深入的探究。

3.2INHBA基因在黔北麻羊單、多羔性腺軸組織中的變化規(guī)律 Chen 等[17]研究發(fā)現(xiàn)INHBA主要作用于母羊的卵巢組織，可能是影響母羊卵泡生長、排卵的相關(guān)基因；Yang 等[18]研究發(fā)現(xiàn)INHBA基因與綿羊繁殖性狀相關(guān)，能直接或間接的調(diào)控mRNA 的表達；而在本實驗中發(fā)現(xiàn)INHBA基因均在黔北麻羊單、多羔組的卵巢組織表達量最高，且大量在多羔卵巢組織中表達，推測其主要作用于卵巢組織，可能與黔北麻羊的高繁殖性能存在一定的關(guān)聯(lián)性。索峰[19]通過qRT-PCR 方法檢測出INHBA和INHA基因在巴美肉羊發(fā)情后1 h、12 h 和24 h 時間點子宮和卵巢組織中存在差異表達，表達量先升高后降低；在排卵期抑制素表達量變化較大，經(jīng)產(chǎn)雙羔巴美肉羊發(fā)情后比經(jīng)產(chǎn)單羔巴美肉羊提前排卵，且排卵數(shù)量多于經(jīng)產(chǎn)單羔母羊；INHBA基因在子宮中的表達量變化隨卵巢變化而變化，說明INHBA基因在一定程度上也作用于子宮，但作者對于在子宮的具體功能未做深入研究；INHBA基因在經(jīng)產(chǎn)多羔山羊子宮和卵巢組織中的大量表達，提示該基因可能有助于提高有效排卵率，從而間接影響著山羊的繁殖性能。Onagbesan[20]等通過qRT-PCR 檢測發(fā)現(xiàn)在雞的整個性成熟前直至18周齡，所有抑制素亞型的mRNA 均能夠在雞的睪丸中表達，但在卵巢中INHBA基因的表達量較低；這與本實驗得出的結(jié)果相反，推測是不同物種所致，INHBA基因在單胃動物雞與反芻動物黔北麻羊的卵巢中表達量存在較大差異，但具體機理還有待進一步研究。相反的是Safi[21]等通過qRT-PCR 檢測發(fā)現(xiàn)雞INHBA、INHA基因均在雞卵巢組織中有表達；且在所有年齡段，卵巢中INHBA基因的表達均顯著高于INHA基因。孫君衛(wèi)[22]等研究發(fā)現(xiàn)INHBA基因隨著卵泡的發(fā)育表達量逐漸升高，且在卵泡顆粒細胞中的表達量最高，這提示INHBA基因定位卵巢，并對卵泡發(fā)育有著重要影響。這些結(jié)果均顯示INHBA基因在卵巢有表達，并一定程度上調(diào)控卵泡的生長發(fā)育；INHBA基因在黔北麻羊卵巢和子宮組織中表達，并且表達量均極顯著高于單羔組，推測INHBA基因可能參與黔北麻羊卵巢組織的生殖調(diào)控且對多羔性狀有一定程度的影響。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果顯示，INHA、INHBA基因在單、多羔黔北麻羊各組織中均有表達，且均在卵巢組織中的表達最高，INHA基因在子宮中的表達最低；INHBA在下丘腦中的表達最低，說明INHA、INHBA基因可能作用于卵巢中，并在卵巢中發(fā)揮一定的作用，結(jié)果提示可為后續(xù)研究山羊高繁殖性能提供實驗依據(jù)。