裙帶菜多糖的堿提取工藝研究

車環(huán)宇，郝鑫龍

裙帶菜（Undaria pinnatifida，Wakame），褐藻門、褐子綱、海帶目、翅藻科、裙帶菜屬［1］.近年的研究表明，裙帶菜多糖在抗腫瘤、抗病毒、抗凝血、促進(jìn)免疫等方面顯示出獨(dú)特的生物活性，其研究越來越受到人們的關(guān)注［2］.常用的裙帶菜多糖提取方法有復(fù)合酶解法、熱水浸提法、超聲波提取法和堿提取法［3］.本實(shí)驗(yàn)采用堿提取法提取裙帶菜多糖，并利用紫外可見分光光度法進(jìn)行定性定量分析，這種方法簡便，易于操作，且回收方便，回收率較高，在普通的實(shí)驗(yàn)室就可進(jìn)行.測定結(jié)果可靠穩(wěn)定.本實(shí)驗(yàn)以裙帶菜為原料，對堿提取法的工藝進(jìn)行了研究，為今后深入研究奠定了初步的基礎(chǔ).

1 儀器與試藥

1.1 儀器

紫外-可見分光光度計(jì)：UV-2102C 型，上海尤尼柯儀器有限責(zé)任公司；電子天平：AY120 型，日本島津公司；電子恒溫水浴鍋：HH-2 型，天津市泰斯特儀器有限公司；循環(huán)水式多用真空泵：SHB-B95 型，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱：101-1AB 型，天津市泰斯特儀器有限公司；量筒、試管、燒杯、漏斗、濾紙、玻璃棒、布氏漏斗、容量瓶、移液管、鐵架臺（鐵環(huán)和鐵夾）、膠頭滴管、濾紙.

1.2 試藥

裙帶菜干粉購自大連；無水葡萄糖（天津市天達(dá)凈化材料精細(xì)化工廠）；無水碳酸鈉（上?；瘜W(xué)試劑有限公司）；95%乙醇（天津化學(xué)試劑有限公司）；苯酚（中國上海試劑總廠）；濃硫酸（哈爾濱市化工試劑廠）；稀鹽酸（哈爾濱新春化工產(chǎn)品有限公司）；蒸餾水.

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 堿提取裙帶菜中多糖的工藝研究

（1）堿提取工藝.取裙帶菜干粉，按一定料液比加入1% Na2CO3溶液，恒溫水浴提取，3000 r/min 離心10 min，取上清液，加稀鹽酸攪拌至pH 2.0，析出凝膠，用95%乙醇洗滌脫水，得棕色粉末，干燥至恒重，精密稱重，計(jì)算得率.

（2）單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn).溫度選用50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃五個(gè)水平；提取時(shí)間選用2 h、4 h、6 h、8 h、10 h 五個(gè)水平；料液比選用1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70 五個(gè)水平.根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用L9（34）設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，篩選最佳提取工藝.

（3）多糖含量測定.①制備標(biāo)準(zhǔn)曲線.精密稱取約105 ℃干燥至恒重的無水葡萄糖100.0 mg，置于100 mL 容量瓶中加蒸餾水溶解并定容，搖勻，獲得對照品溶液備用.分別吸取上述溶液1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL、6 mL，置于100 mL 容量瓶加蒸餾水定容，得0.01 mg/mL、0.02 mg/mL、0.03 mg/mL、0.04 mg/mL、0.05 mg/mL、0.06 mg/mL 的6個(gè) 不 同 濃 度 的 對照品溶液. 精密吸取上述溶液各1 mL 置于10 mL 的試管中，用蒸餾水分別補(bǔ)至2 mL，加入苯酚1 mL 混勻，再迅速滴加5 mL 濃硫酸，混勻，置于50 ℃水浴中30 min，取出放置室溫，以蒸餾水同法操作為空白，在489 nm 處測定吸收度.②樣品溶液的制備.取粗多糖干品100.0 mg，用蒸餾水定容于100 mL 容量瓶，從中吸取10 mL 于50 mL 的容量瓶中定容.③裙帶菜多糖得率測定.吸取1 mL 裙帶菜多糖水溶液于試管中，按標(biāo)準(zhǔn)曲線制備步驟操作，測其吸光度，以標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算多糖含量.

2.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算

多糖含量計(jì)算公式為：w=cFV/m×100%，式中：w為多糖樣品含量，%；c為溶液濃度，μg/mL；F為溶液的稀釋倍數(shù)；V為溶液體積，mL；m為稱取的樣品質(zhì)量，mg.

（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備.以吸光度（A）為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品濃度（C）為橫坐標(biāo)，得標(biāo)準(zhǔn)曲線.經(jīng)回歸處理的線性回歸方程：Y=2.7858X+0.1262，R2=0.9947，X為在Y吸光度下根據(jù)回歸方程計(jì)算所得的值.結(jié)果見圖1.

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

（2）單因素試驗(yàn).①提取溫度對多糖提取率的影響.保持提取時(shí)間2 h，料液比1∶60，Na2CO3溶液濃度1%，提取溫度分別為50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃條件下提取裙帶菜多糖.②提取時(shí)間對多糖提取率的影響.保持提取溫度60 ℃，料液比1∶60，Na2CO3溶液濃度1%，提取時(shí)間分別為2 h、4 h、6 h、8 h、10 h 條件下提取裙帶菜多糖.③料液比對多糖提取率的影響.保持提取溫度60 ℃，提取時(shí)間2 h，Na2CO3溶液濃度1%，料液比分別為1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70 條件下提取裙帶菜多糖.

（3）堿提取裙帶菜多糖的正交試驗(yàn).根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)，用L9（34）正交實(shí)驗(yàn)考察提取時(shí)間、提取溫度和料液比對褐藻酸提取率的影響.

2.3 實(shí)驗(yàn)方法學(xué)考察

（1）精密度試驗(yàn).精密稱取適量裙帶菜多糖，用蒸餾水定容，按照操作步驟測定5 次.

（2）穩(wěn)定性試驗(yàn).取樣品溶液，分別在0 h、0.5 h、1 h、1.5 h、2 h 內(nèi)對其吸光度進(jìn)行測定.

（3）重復(fù)性試驗(yàn).取相同質(zhì)量裙帶菜粉末5 份，按樣品含量測定方法進(jìn)行測定.

（4）回收率試驗(yàn).精密稱取裙帶菜多糖樣品，共5 份，每份1 mg，分別加入無水葡萄糖1 mg，按樣品的含量測定方法進(jìn)行測定.

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 單因素試驗(yàn)

（1）提取溫度對多糖提取率的影響.保持提取時(shí)間2 h，料液比1∶60，Na2CO3溶液濃度1%，提取溫度分別為50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃條件下提取裙帶菜多糖，結(jié)果見表1.

表1 提取溫度對多糖提取率的影響

從表1 可以看出，當(dāng)提取溫度達(dá)到70 ℃時(shí)得率達(dá)到最高值，超過70 ℃提取率下降.因此選擇溫度60 ℃、70 ℃、80 ℃三個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn).

（2）提取時(shí)間對多糖提取率的影響.保持提取溫度60 ℃，料液比1∶60，Na2CO3溶液濃度1%，提取時(shí)間分別為2 h、4 h、6 h、8 h、10 h條件下提取裙帶菜多糖，結(jié)果見表2.

表2 提取時(shí)間對多糖提取率的影響

從表2 可以看出，提取時(shí)間為8 h 時(shí)，多糖得率最高，此后下降.因此選擇提取時(shí)間6 h、8 h、10 h 三個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn).

（3）料液比對多糖提取率的影響.保持提取溫度60 ℃，提取時(shí)間2 h，Na2CO3溶液濃度1%，料液比分別為1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70條件下提取裙帶菜多糖，結(jié)果見表3.

表3 料液比對多糖提取率的影響

由表3 可以看出，隨著提取溶劑的增加，裙帶菜多糖提取率先升后降，料液比為1∶50時(shí)得率最高.因此，選擇料液比1∶40、1∶50、1∶60 三個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn).

3.2 堿提取裙帶菜多糖的正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)，用L9（34）正交實(shí)驗(yàn)考察提取時(shí)間、提取溫度和料液比對褐藻酸提取率的影響.因素水平設(shè)置見表4，正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5，方差分析見表6.

表4 因素水平表

表5 正交試驗(yàn)結(jié)果

表6 方差分析表

由正交試驗(yàn)表可知，A2B2C3 為提取裙帶菜多糖的最佳工藝組合，即提取溫度70 ℃，提取時(shí)間8 h，料液比1∶60.極差分析R值表明，各因素影響裙帶菜多糖得率效果的主次順序?yàn)樘崛囟龋咎崛r(shí)間＞料液比，提取溫度對多糖得率的影響最大.

3.3 實(shí)驗(yàn)方法學(xué)考察

（1）精密度試驗(yàn).精密稱取適量裙帶菜多糖，用蒸餾水定容，按照操作步驟測定5 次，測定結(jié)果的RSD 為0.20%，說明該方法的精密度較高.結(jié)果見表7.

表7 精密度試驗(yàn)考察結(jié)果

（2）穩(wěn)定性試驗(yàn).取樣品溶液，分別在0 h、0.5 h、1 h、1.5 h、2 h 內(nèi)對其吸光度進(jìn)行測定，測定結(jié)果的RSD 達(dá)到0.45%，表明裙帶菜多糖的水溶液至少在2 h 內(nèi)穩(wěn)定.結(jié)果見表8.

表8 穩(wěn)定性試驗(yàn)考察結(jié)果

（3）重復(fù)性試驗(yàn).取相同質(zhì)量的裙帶菜粉末5 份，按樣品含量測定方法進(jìn)行測定，測定結(jié)果的RSD 達(dá)到0.50%，表明實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性較好.結(jié)果見表9.

表9 重復(fù)性試驗(yàn)考察結(jié)果

（4）回收率試驗(yàn).精密稱取裙帶菜多糖樣品5 份，每份1 mg，分別加入無水葡萄糖1 mg，按樣品的含量測定方法進(jìn)行測定，平均回收率為99.2%.結(jié)果見表10.

表10 回收率試驗(yàn)考察結(jié)果

4 討論與結(jié)論

4.1 討論

本實(shí)驗(yàn)所用的儀器、試驗(yàn)方法以及結(jié)果和以往裙帶菜多糖的提取相比較，能節(jié)省時(shí)間，有效提升提取率，實(shí)驗(yàn)過程順利，測定結(jié)果可靠穩(wěn)定，為今后深入研究奠定了基礎(chǔ).但是在對提取物進(jìn)行離心時(shí)發(fā)現(xiàn)，由于裙帶菜經(jīng)過水浴加熱后過于粘稠，無法順利得到上清液，沉淀部分仍有可分離的提取溶液，容易造成浪費(fèi).因此，在以后的相關(guān)實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)考慮采用何種方法能夠降低裙帶菜多糖提取溶液的粘度，以便在大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)中能夠最大限度地利用裙帶菜原料提取多糖.在制備標(biāo)準(zhǔn)品溶液和樣品含量測定時(shí)，需用到苯酚溶液和濃硫酸溶液.由于苯酚極易被氧化，因此需現(xiàn)配現(xiàn)用.如果苯酚晶體已接觸空氣，須重蒸苯酚，得到182 ℃的餾分，再配成6%的溶液.苯酚-硫酸法顯色后要盡快測定，以免長時(shí)間放置，吸光度有所變化，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果.

4.2 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)使用紫外分光光度法對裙帶菜中褐藻膠進(jìn)行定性定量分析，最大吸收波長為489 nm.不同提取條件下提取出來的裙帶菜多糖含量相差較大.本文探討了與堿提取法作用相關(guān)的提取時(shí)間、提取溫度和料液比因素對多糖提取率的影響，同時(shí)采用正交試驗(yàn)確立最佳條件.正交優(yōu)化條件為：在提取時(shí)間為8 h、提取溫度為70 ℃、料液比為1∶60 的條件下，所提取的裙帶菜多糖含量最高.堿提取裙帶菜多糖的方法簡便，易于操作，是今后常用的裙帶菜多糖提取方法之一.通過方法學(xué)考察可知，本實(shí)驗(yàn)所采用的方法穩(wěn)定可靠，具有較好的精確度、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性和準(zhǔn)確性，可用于裙帶菜多糖提取的含量測定.