以豬膽囊為原料提取膽紅素

顧文杰，朱 旗，舒春鴿，李 超，張 宇，薛洪寶,，高 敏，劉志祥

（1.蚌埠醫(yī)學(xué)院公共基礎(chǔ)學(xué)院，安徽蚌埠233030；2.安徽宏業(yè)藥業(yè)有限公司生產(chǎn)技術(shù)部，安徽蚌埠233045）

中醫(yī)藥典籍《中華本草》曰：豬苦膽自然陰干，陰陽瓦微火焙干，研末沖服，具有清熱、潤(rùn)燥、解毒以及主熱病燥渴、大便秘結(jié)、咳嗽、哮喘、目赤、目翳、泄痢、黃疸、喉痹、聤耳、癰疽疔瘡、鼠瘺、濕疹、頭癬的功效?！侗静菥V目》《本草匯言》也有類似記載。膽色素為膽汁中的色素總稱，包括膽紅素和膽綠素，也是膽結(jié)石的主要成分，其化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1[1]。本實(shí)驗(yàn)以豬膽囊為原料提取膽紅素。

膽紅素（Bilirubin）作為豬膽囊中的主要成分，其分子是由四個(gè)吡咯環(huán)通過亞甲基和次甲基連在一起的開鏈所組成的。血紅蛋白的原卟啉經(jīng)氧化使α-次甲基鍵斷開，形成膽綠素，再經(jīng)還原為膽色素的其他成分。膽色素可以分為四類，即膽色烷、次甲膽色素、二次甲膽色素和三次甲膽色素，它們分別含有0、1、2 和3 個(gè)次甲橋。除膽色烷無色外，其他皆有顏色。膽紅素是二次甲膽色素，膽綠素為三次甲膽色素，圖1可反映其結(jié)構(gòu)。

膽紅素為橙色至暗紅棕色的粉末或結(jié)晶體[2-3]，加熱時(shí)逐漸變黑但不熔融。0.001%的氯仿溶液，在波長(zhǎng)400～490 nm 處有選擇性吸收，最大吸收波長(zhǎng)在449～451 nm 處。膽紅素具備多種藥理作用，是制造人工牛黃的主要原料，具有抗氧劑以及有效的過氧化氫基清除劑的功能，保護(hù)細(xì)胞膜脂質(zhì)免于活性基的氧化作用。膽紅素為干燥固體時(shí)較穩(wěn)定，在氯仿溶液中避光保存也較穩(wěn)定，在堿溶液中或遇Fe3+等極不穩(wěn)定，很容易被氧化。

膽紅素的主要來源及提取方法包括以下部分：從人的膽汁中提取膽紅素的直快法，因涉及到倫理道德方面，不為人類社會(huì)所允許；高分子樹脂型膽紅素常溫制取工藝方法，目前技術(shù)尚不成熟；狗、棕熊、活豬體等生物體引流提取膽紅素的方法涉及到傷害野生動(dòng)物方面，不為人類社會(huì)所允許；利用人的廢膽結(jié)石提取膽紅素的方法，由于利用人體病變組織，有感染其他病毒、細(xì)菌等風(fēng)險(xiǎn)，且涉及到倫理道德方面，亦不能推廣；酶法合成膽紅素，目前技術(shù)尚不成熟；豬、牛等家畜膽汁提取膽紅素的生產(chǎn)工藝是目前的主要來源途徑，且成本低廉[4-5]；此外，其他技術(shù)如雙管體內(nèi)合成膽紅素的技術(shù)、獺貍膽紅素和獺貍血紅素及其制取技術(shù)、血液分解法生產(chǎn)膽紅素新技術(shù)等受到成本較高、技術(shù)不成熟等因素限制，尚不能推廣。

圖1 膽色素化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structure of bile pigment

膽紅素不溶于水，溶于苯、氯仿、氯苯、二硫化碳，微溶于乙醇、乙醚等有機(jī)溶劑，且分子中有兩個(gè)丙酸基側(cè)鏈，呈弱酸性，能與堿土金屬離子如Ca2+生成不溶性鹽（習(xí)慣上稱膽鈣鹽）。這種不溶性鹽與強(qiáng)酸如鹽酸反應(yīng)，可置換出膽紅素，這是本實(shí)驗(yàn)的主要提取方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

儀器設(shè)備：DF-101S 型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，河南省鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；250 mL電熱套，上海越眾儀器設(shè)備有限公司；水浴系列JC-ZFRE5000 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，山東省青島聚創(chuàng)環(huán)保集團(tuán)有限公司；SHZ-D（Ⅲ）型循環(huán)水式多用真空泵，河南省鄭州科豐儀器設(shè)備有限公司。

試劑材料：豬膽囊，新采集或冰箱冷凍存放，安徽省某肉類聯(lián)合加工廠有限公司；氧化鈣，分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠；亞硫酸氫鈉，分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠；濃鹽酸，優(yōu)級(jí)純，天津市大茂化學(xué)試劑廠；95%的乙醇，分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠；氯仿，分析純，河南祥德商貿(mào)有限公司；乙醚，分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠；純化水，電導(dǎo)率≥18 Ω。

1.2 工藝路線

提取工藝路線參照某公司原有豬胰臟來源膽紅素原料藥提取工藝基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化，見圖2。

1.3 提取步驟

（1）制鈣鹽

取新鮮豬膽汁200 mL，加入3～4倍量的澄清飽和石灰水?dāng)嚢杈鶆?。加熱至沸，撇取浮于液面的橙紅色膽鈣鹽（內(nèi)含膽色素鈣鹽），趁熱壓干[6-7]。

（2）酸化

于鈣鹽中加入適量水，搗成糊狀，過65 目篩，加入1%的亞硫酸氫鈉[8]。在攪拌下緩緩滴加濃鹽酸溶液，至pH 值為1～2，靜置30 min。用雙層紗布瀝去酸水，得泥狀物。

（3）乙醇處理

泥狀物中加入95%的乙醇搗成稀糊狀，再加入約20 g 95%的乙醇和0.01 g亞硫酸氫鈉水溶液，充分?jǐn)嚢杈鶆?。乙醇液的pH 值約在3.0～3.5。于約3℃靜置沉淀18 h。去除上層乙醇。于下層中加入45℃～50℃溫水，靜置分層，富集膽紅素的懸浮物即浮于液面[9]，去除下層廢水。

（4）提取

于懸浮物中加入氯仿約30 g，回流提取2 h。將提取液置于分液漏斗中分層，下層氯仿液過濾后，于常壓下蒸發(fā)出氯仿，盡量蒸干。于殘余物中加入適量95%乙醇，繼續(xù)蒸發(fā)至餾出乙醇中幾乎不帶氯仿氣味。過濾分取膽紅素，在過濾器上用溫?zé)岬囊掖己鸵颐严礈?，抽干，即得成品膽紅素[10-11]。

2 結(jié)果與討論

實(shí)驗(yàn)產(chǎn)物呈橙色或淡黃色粉末，不溶于水，可溶于氯仿等有機(jī)溶劑，從物理化學(xué)性質(zhì)方面判斷與膽紅素性質(zhì)相同。

圖2 豬胰臟來源膽紅素原料藥提取工藝路線框圖Fig.2 Extraction process roadmap of bilirubin from pig pancreas

膽紅素和重氮化的對(duì)-氨基苯磺酸反應(yīng)，產(chǎn)生偶氮染料。這種偶氮染料在強(qiáng)酸中呈藍(lán)紫色，在pH 值2.0～5.5之間呈紅色，在pH值5.5以上則呈綠色。

（1）重氮化試劑的配制

溶液甲：對(duì)-氨基苯磺酸10 g，加濃鹽酸15 mL，水985 mL。

溶液乙：0.5%亞硝酸鈉溶液。

臨用時(shí)取10 mL甲溶液加0.3 mL乙溶液，混勻。

（2）膽紅素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制[11-12]

精密稱取膽紅素標(biāo)準(zhǔn)品10.0 mg，用氯仿溶解后，轉(zhuǎn)移至100 mL棕色容量瓶中，加氯仿至刻度。量取氯仿溶液10 mL，置于50 mL容量瓶中，加乙醇至刻度，此即為標(biāo)準(zhǔn)品溶液，標(biāo)準(zhǔn)溶液膽紅素為0.000 02 g/mL。精密量取標(biāo)準(zhǔn)品溶液0 mL、1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL于帶塞比色管中，分別加入乙醇9 mL、8 mL、7 mL、6 mL、5 mL、4 mL，使總體積均為9 mL，再加入重氮化試劑1 mL，混勻。于20℃暗處靜置60 min（或30℃暗處靜置30 min）后，于波長(zhǎng)520 nm處測(cè)定吸收度。以吸收度為縱坐標(biāo)，以各管中膽紅素的量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，見圖3。線性相關(guān)系數(shù)為R2=0.993 99，線性方程：Y=1.020±0.035 46×X+0.028±0.013 81，檢測(cè)下限：1.38×10-7g/mL。

圖3 膽紅素含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curve of bilirubin content determination

（3）樣品測(cè)定[13]

另精密稱取供試品25.0 mg，用氯仿溶解后，轉(zhuǎn)移至250 mL容量瓶中，邊加氯仿邊振搖，使溶解完全并加至刻度。量取氯仿溶液10 mL，置于50 mL 容量瓶中，加乙醇至刻度，搖勻。精密量取5 mL于帶塞比色管中，加乙醇4 mL，使總體積為9 mL，混勻，再加入重氮化試劑1.0 mL。與標(biāo)準(zhǔn)品在相同條件下顯色后，于波長(zhǎng)520 nm處測(cè)定吸收度?？捎蓸?biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)應(yīng)的線性方程直接計(jì)算出供試品的含量。

3 結(jié)論

經(jīng)多次平行試驗(yàn)知，豬膽囊提取之前要保證新鮮，以免有效成分損失，提取過程中不能有鐵器接觸豬膽囊，以防產(chǎn)品氧化、變性，提取過程中使用的澄清石灰水在空氣中極容易變質(zhì)，使用時(shí)需現(xiàn)用現(xiàn)配，濃度過低或雜質(zhì)過多可能會(huì)導(dǎo)致鈣鹽不能全部漂浮出來，影響最終產(chǎn)品的收率。提取過程產(chǎn)生的強(qiáng)酸、強(qiáng)堿性物質(zhì)后處理不善可能會(huì)對(duì)環(huán)境造成不利影響[12]。在實(shí)驗(yàn)室小試階段過程中以濃鹽酸替代1∶1 的工業(yè)級(jí)鹽酸效果更佳。膽汁液沸騰后要立即趁熱過濾，因?yàn)槟戔}鹽的溶解度會(huì)隨溫度的升高而降低。如果溫度過低，橙紅色的膽鈣鹽溶解在溶液中，不易析出，導(dǎo)致成品產(chǎn)率較低。回流過程中要注意設(shè)備的密閉性，以防氯仿外泄；回流過程中不能完全蒸干，否則會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)品過熱而分解變質(zhì)，收率明顯降低。

通過實(shí)驗(yàn)證明，以豬膽囊為原料生產(chǎn)膽紅素工藝技術(shù)路線可行，為肉類聯(lián)合加工企業(yè)的生產(chǎn)廢料——豬膽囊的無公害資源化處理，即以其為原料生產(chǎn)膽紅素提供了技術(shù)參考。