鼓膜修補材料的研究進(jìn)展*

王冰 舒易來 陳兵

鼓膜 (tympanic membrane，TM)是一種半透明的菲薄結(jié)構(gòu)，由角質(zhì)化的鱗狀上皮外層、纖維狀中層和粘膜內(nèi)層三層結(jié)構(gòu)組成[1]。造成鼓膜穿孔的最常見病因有外傷、中耳炎和鼓膜置管術(shù)遺留的造口等。雖然大多數(shù)急性鼓膜穿孔是可以自愈的，但面積較大的穿孔或慢性穿孔需要外科手術(shù)干預(yù)才能修復(fù)。穿孔的鼓膜如果不能及時愈合，失去了阻擋外界細(xì)菌進(jìn)入中耳的有效屏障，中耳感染的幾率將大大增加，嚴(yán)重者還會引起耳溢液、傳導(dǎo)性聽力下降甚至膽脂瘤的形成等，造成嚴(yán)重的并發(fā)癥。鼓膜穿孔的自愈通過上皮細(xì)胞的移行而完成，但常缺少纖維中間層，相較于正常鼓膜，自愈后的鼓膜更加脆弱、傳聲性能不理想、較易形成內(nèi)陷袋，并且在一定的氣壓傷時有再次穿孔的可能。因此，重建類似原生鼓膜的三層結(jié)構(gòu)是十分必要的。

目前，雖有多種鼓膜修補材料和術(shù)式可供選擇，但對于修補鼓膜的最佳材料仍未達(dá)成共識，鼓膜修復(fù)手術(shù)也存在一定的禁忌癥和并發(fā)癥[2]。常用的修復(fù)鼓膜穿孔的手術(shù)主要有鼓室成形術(shù)和鼓膜成形術(shù)，鼓膜成形術(shù)作為鼓室成形術(shù)的重要內(nèi)容之一，與其他手術(shù)，如：聽骨鏈成形術(shù)等，組合構(gòu)成多種類型的單純性鼓室成形術(shù)，也可與各種類型的乳突切除術(shù)構(gòu)成多種類型的乳突切除伴鼓室成形術(shù)。既往鼓膜修補使用的材料有消毒后的紙片、軟硅膠、脂肪或明膠海綿等，但這類材料修復(fù)鼓膜的有效性存在差異[3，4]。目前最常見的是利用耳后顳肌筋膜或軟骨膜自體移植，成功率較高，但也有再次穿孔的可能[5]。

鼓室成形術(shù)多需在全身麻醉下完成，手術(shù)成本較高，顯微手術(shù)的難度對耳外科醫(yī)生也是一種挑戰(zhàn)[6]，術(shù)后發(fā)生鼓膜再次穿孔可能需要再次手術(shù)修復(fù)，反復(fù)自體取材可能還會導(dǎo)致供區(qū)的組織病變，使自體移植材料的可用性變差[7]。為了解決以上問題，用于鼓膜修補的新型輔助材料和組織工程技術(shù)已應(yīng)用于實驗和臨床，以替代患者自體取材移植[4]。組織工程的基本方法包括支架結(jié)構(gòu)材料、生物因子和干細(xì)胞等；理想的支架材料可為細(xì)胞附著、生長和發(fā)揮正常功能提供良好的環(huán)境，生物信號分子和生長因子有助于增強細(xì)胞功能和促進(jìn)整體組織的生長[8]。本文就鼓膜修補的組織工程學(xué)材料的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 結(jié)構(gòu)材料

通常結(jié)構(gòu)材料包括脫細(xì)胞組織和聚合物[1]，目前已有多種具有優(yōu)良特性的結(jié)構(gòu)材料供鼓膜穿孔修復(fù)手術(shù)選擇，比如：細(xì)胞外基質(zhì)、交聯(lián)水凝膠、蠶絲纖維蛋白等等。

1.1細(xì)胞外基質(zhì) 細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)是天然來源的材料，由多細(xì)胞生物的細(xì)胞合成并分泌到細(xì)胞外，分布在細(xì)胞表面或細(xì)胞之間的大分子，可以為組織工程和再生醫(yī)學(xué)提供具有誘導(dǎo)性的支架材料[8]，這些支架的結(jié)構(gòu)和功能蛋白可作為鼓膜重建和組織特異性修復(fù)的模板。

膀胱細(xì)胞外基質(zhì)可以用作鼓膜修補的組織工程支架材料。Parekh等[9]將豬的膀胱經(jīng)去細(xì)胞化處理產(chǎn)生膀胱基質(zhì)，然后作為貼片材料用于誘導(dǎo)鼓膜穿孔的修復(fù)；膀胱基質(zhì)貼片治療組和對照組(自然愈合組)愈合后的鼓膜均較原生鼓膜厚，但前者鼓膜組織學(xué)分析顯示為更透明、均勻的結(jié)構(gòu)，而對照組自然愈合后的新生鼓膜有小囊泡和纖維結(jié)節(jié)等不均勻區(qū)域；由于樣本量較小，無法進(jìn)行有意義的統(tǒng)計分析。此外，此研究缺乏對細(xì)胞提取后獲取的膀胱基質(zhì)這一修補材料的表征描述和相關(guān)特性的研究。

Deng等[10]在2009年利用豬真皮和硬腦膜進(jìn)行脫細(xì)胞處理，獲得無細(xì)胞的ECM支架，然后從豚鼠鼓膜中分離鼓膜成纖維細(xì)胞進(jìn)行接種，并且建立豚鼠鼓膜慢性穿孔的模型用于驗證這種材料的有效性；顯微鏡下觀察和組織學(xué)檢查顯示，隨著時間推移該支架能成功誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞的生長并使鼓膜愈合，并且組織切片染色結(jié)果顯示愈合的鼓膜具有與正常鼓膜相似的三層結(jié)構(gòu)，聽性腦干反應(yīng)(ABR)測試也顯示修復(fù)后的聽力有所提高[10]。隨著細(xì)胞提取技術(shù)的成功，脫細(xì)胞材料的生物相容性得到了充分的證明，異種生物材料可以用于鼓膜的組織工程學(xué)研究，利用此類移植物材料也可以減少手術(shù)時間和成本。另外，有國外文獻(xiàn)報道了對比脫細(xì)胞真皮與顳肌筋膜作為鼓膜移植物材料的療效[11]，對40例患者進(jìn)行前瞻性隨機(jī)非盲試驗，實驗組采用厚度0.03 mm的脫細(xì)胞真皮、對照組采用顳筋膜修補鼓膜；結(jié)果顯示實驗組手術(shù)時間較對照組明顯縮短且術(shù)后疼痛也明顯減輕，同時兩組移植成功率及聽力結(jié)果無明顯差異。這項研究將脫細(xì)胞真皮與臨床上最常用的自體組織作比較，十分有意義，但這項研究并非雙盲試驗，并且使用脫細(xì)胞真皮之類的新型移植物材料也存在著成本問題。

1.2交聯(lián)水凝膠 目前為止，已有多種水凝膠和海綿材料應(yīng)用于組織工程學(xué)研究，此類材料來源于糖胺聚糖，具有促進(jìn)傷口愈合和加速上皮化的能力，在修補組織缺損傷口的領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用[12]。Park等[13]在豚鼠急性鼓膜穿孔模型中比較了多種合成交聯(lián)水凝膠的療效，分別為Carbylan-SX、Gelatin-DTPH-PEGDA、Carbylan-S/GelatinDTPH、明膠海綿、外延膜、交聯(lián)硫代硫酸軟骨素，結(jié)果表明Carbylan-S/Gelatin-DTPH水凝膠、明膠海綿和硫代硫酸軟骨素修復(fù)的鼓膜穿孔愈合時間最短，其中硫酸軟骨素修補組出現(xiàn)了較強的炎癥反應(yīng)。Hakuba等[14]用水凝膠結(jié)合成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)對豚鼠急性鼓膜穿孔進(jìn)行修補，結(jié)果bFGF處理組修復(fù)率較高，并且形成了與原生鼓膜相似的三層結(jié)構(gòu)，而對照組(生理鹽水組)僅有粘膜層和上皮層的再生。

1.3蠶絲 絲素是蠶絲中含有的一種具有彈性、可降解性和生物相容性的蛋白質(zhì)聚合物，這種特性使得蠶絲已被用于鼓膜組織工程學(xué)的支架材料研究[15, 16]。2010年，Ghassemifar等[15]在含血清培養(yǎng)基中，分別在蠶絲蛋白貼片(取自家蠶)和組織培養(yǎng)塑料薄膜(對照組)上培養(yǎng)人類鼓膜細(xì)胞15天，結(jié)果表明，與對照組相比，蠶絲蛋白貼片支持的鼓膜細(xì)胞生長計數(shù)水平要高于對照組，并且免疫熒光化學(xué)分析明確表明，蠶絲蛋白貼片組支持的細(xì)胞之間的接觸與粘附情況也優(yōu)于對照組；所以認(rèn)為蠶絲蛋白是一種更適合于人類鼓膜細(xì)胞的支架材料，可以應(yīng)用于鼓膜組織工程學(xué)研究[15]。但是上述研究僅限于體外細(xì)胞的培養(yǎng)，而缺乏有效的體內(nèi)模型驗證。Kim等[16]對大鼠急性鼓膜穿孔模型進(jìn)行修補處理，一側(cè)耳用蠶絲貼片修補，對側(cè)耳用紙貼片進(jìn)行修補，結(jié)果示蠶絲貼片與紙貼片處理的鼓膜穿孔平均愈合時間分別為7.2天和9.1天，有統(tǒng)計學(xué)差異，組織學(xué)分析顯示，蠶絲貼片修補組有與天然鼓膜更相似的結(jié)構(gòu)[16]。此外，Levin等[17,18]對絲素對鼓膜再生的影響進(jìn)行了研究，體外研究表明蠶絲貼片可以支持人類鼓膜角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖和粘附?？偟膩碚f蠶絲可作為一種較為理想的天然材料用于鼓膜穿孔的修補。

2 影響鼓膜再生的生長因子

目前已有多種生長因子被廣泛用于鼓膜穿孔愈合的研究,其中被廣泛研究的生長因子有表皮生長因子[19～21]、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)[22～25]、透明質(zhì)酸(HA)[26,27]，且大多數(shù)研究表明，這些生物因子對鼓膜的再生有顯著療效。

2.1透明質(zhì)酸 透明質(zhì)酸(hyaluronic acid，HA)是一種具有粘彈性的天然胞外多糖物質(zhì)[28]。MeroGel 是一種商業(yè)可用的酯化透明質(zhì)酸,Ozturk等[29]建立大鼠急性鼓膜穿孔模型來評估MeroGel和HA的有效性,結(jié)果顯示，MeroGel和HA處理組的鼓膜穿孔愈合率明顯高于對照組，并且這兩組效果無明顯差異；免疫組化分析結(jié)果示，MeroGel和HA處理組的成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)含量明顯升高，所以MeroGel被認(rèn)為是一種較為理想的鼓膜修補材料。

2.2表皮生長因子 Ramalho等[30]在亞急性鼓膜穿孔的栗鼠模型中研究表皮生長因子(epidermal growth factor, EGF)和己酮可可堿的作用，己酮可可堿是一種能夠增加局部微循環(huán)缺陷組織血流量和氧張力的藥物；實驗分為4組：對照組(n=9)：外用蒸餾水；A組(n=8)：局部外用EGF；B組(n=13)：口服己酮可可堿，每12小時10 mg/kg，連續(xù)10天；D組(n= 10)：外用EGF + 己酮可可堿。每組每隔72小時給藥一次，持續(xù)10天，所有動物均在鼓膜穿孔處放置可吸收的明膠海綿。結(jié)果鼓膜愈合率分別為：對照組8.7%，A組30.3%，B組3.6%，D組16.5%，提示EGF促進(jìn)了鼓膜愈合，但是己酮可可堿沒有顯示出積極的結(jié)果，EGF和己酮可可堿之間也并無協(xié)同作用。此外，還有研究[31]對大鼠進(jìn)行急性鼓膜穿孔造模后，分別用浸泡過透明質(zhì)酸和EGF的明膠海綿修復(fù)穿孔，結(jié)果顯示，與自然愈合的鼓膜穿孔相比，HA和EGF明顯縮短了鼓膜愈合的時間，但是HA和EGF兩組間差異不顯著；在組織病理學(xué)檢查中，治療組與對照組在鼓膜厚度、新生血管生成等方面亦無明顯差異?？梢姡砥どL因子能夠有效促進(jìn)鼓膜穿孔的愈合。

2.3血小板源性生長因子(platelet derived growth factor,PDGF) 血小板源性生長因子和血管內(nèi)皮生長因子(vascular endogrowth factor, VEGF)形成了一個具有高度保守性的PDGF/VEGF同源結(jié)構(gòu)域，目前在鼓膜修補方面，關(guān)于PDGF和VEGF的研究還較為有限。Yeo等[32]研究了PDGF在鼓膜穿孔修補中的應(yīng)用，分別用PDGF(實驗組)和磷酸鹽緩沖液(對照組)處理大鼠急性鼓膜穿孔，結(jié)果示PDGF組穿孔鼓膜較對照組更快愈合，且組織學(xué)檢查顯示PDGF組處理后的新生鼓膜更接近原生鼓膜的三層結(jié)構(gòu)。Roosli等[33]首次在臨床試驗中研究PDGF對鼓膜再生的作用，對20例鼓膜穿孔患者隨機(jī)進(jìn)行PDGF局部治療(用PDGF浸泡的消毒紙片處理穿孔鼓膜)和安慰劑治療，治療6周，結(jié)果顯示PDGF治療組與對照組相比沒有顯示任何優(yōu)勢。血小板源性生長因子對鼓膜穿孔愈合的研究目前較為有限，還有待更多的探索。

3 干細(xì)胞

用于鼓膜生物工程研究的細(xì)胞可以從原始組織、細(xì)胞系或干細(xì)胞中獲得，這些細(xì)胞可以在植入前注射或在體外植入[34]。目前，用于生物支架研究的細(xì)胞研究較為有限,除了上述已提及的Deng等[10]的研究外，von Unge等[35]在沙鼠急性鼓膜穿孔模型中，應(yīng)用小鼠胚胎干細(xì)胞處理鼓膜穿孔，結(jié)果顯示小鼠胚胎干細(xì)胞能夠改善鼓膜愈合。然而，當(dāng)此法應(yīng)用于大鼠模型中時，未發(fā)現(xiàn)胚胎干細(xì)胞對鼓膜穿孔愈合起到促進(jìn)作用； 6個月后觀察修復(fù)后的鼓膜，處理組和未處理組新生鼓膜強度和剛度相似，但干細(xì)胞處理組鼓膜中層較厚[36]。隨后，此研究組又進(jìn)一步將人間充質(zhì)干細(xì)胞應(yīng)用于豚鼠慢性鼓膜穿孔模型，結(jié)果顯示人間充質(zhì)干細(xì)胞處理后的鼓膜穿孔愈合率為40%，未處理組愈合率僅為10%；但免疫抑制劑(他克莫司)處理組呈現(xiàn)出愈合不良，并且中耳腔充滿了炎性肉芽和組織粘連[37]。近年的研究發(fā)現(xiàn)，人類的鼓膜祖細(xì)胞在鼓膜臍部、鼓環(huán)以及錘骨柄部位，表明這些部位具有再生鼓膜干細(xì)胞的可能[38]。

干細(xì)胞在促進(jìn)鼓膜再生方面顯示出了巨大潛能，經(jīng)過處理的干細(xì)胞結(jié)構(gòu)與原生鼓膜的結(jié)構(gòu)似乎十分相似，這對于鼓膜修復(fù)、重建聽功能和防止再次穿孔至關(guān)重要。然而，干細(xì)胞治療也存在倫理和成本方面的問題；因此，未來其他來源的細(xì)胞，如：自體角質(zhì)形成細(xì)胞也將成為重要研究方向。

4 展望

總的來說，各種原因?qū)е碌墓哪ご┛自谂R床上十分常見，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。目前對鼓膜穿孔修復(fù)的研究包括生物材料、生物因子、干細(xì)胞以及各種術(shù)式的選擇，存在各種挑戰(zhàn)，比如：生物材料的性能有待優(yōu)化，從而能適配鼓膜原有的生物力學(xué)和聲學(xué)特性；脫細(xì)胞基質(zhì)的選擇可能會涉及倫理問題，需要對患者充分告知；各種修復(fù)材料等尚需要進(jìn)一步的研究和應(yīng)用。隨著各種新型材料的出現(xiàn)和改進(jìn)，各種研究的不斷深入和臨床應(yīng)用終將對這一領(lǐng)域帶來光明的前景。