肝移植腸道微生態(tài)研究進(jìn)展

孫紀(jì)三 謝炎 羅宇涵 蔣文濤

肝移植是目前治療各類型終末期肝病的唯一有效方法。術(shù)后感染、急慢性排斥反應(yīng)、膽道狹窄等并發(fā)癥嚴(yán)重影響病人手術(shù)預(yù)后。腸道微生態(tài)包括腸道菌群及菌群生活的環(huán)境，是人體最大的器官，其細(xì)菌總數(shù)超過(guò)1014，它參與人體免疫、代謝等多項(xiàng)功能。在肝移植人群中，由于肝病本身及肝移植手術(shù)的影響，腸道微生態(tài)會(huì)發(fā)生改變。這種改變與術(shù)后感染、排斥反應(yīng)等存在著密切聯(lián)系，既可以作為某些并發(fā)癥的敏感標(biāo)志物預(yù)測(cè)并發(fā)癥風(fēng)險(xiǎn)，又可以作為治療靶點(diǎn)幫助減少或減輕并發(fā)癥[1]。腸道穩(wěn)態(tài)失調(diào)還可造成缺血性膽道并發(fā)癥，它是肝移植術(shù)后最嚴(yán)重的并發(fā)癥，病情遷延反復(fù)，最終可發(fā)展為移植物失功，病人被迫接受二次移植。在肝移植圍術(shù)期的管理中，腸道微生態(tài)的作用不可忽視。本文擬從腸道微生態(tài)出發(fā)，分析總結(jié)肝移植與腸道微生態(tài)之間的聯(lián)系，為未來(lái)肝移植術(shù)后腸道微生態(tài)的臨床治療提供參考。

一、肝移植圍手術(shù)期腸道微生態(tài)

1.肝臟疾病與腸道微生態(tài)：腸上皮細(xì)胞是腸道的免疫基礎(chǔ)，在酒精性肝病(alcoholic liver disease，ALD)人群中，由于長(zhǎng)期攝入大量酒精，酒精及其代謝產(chǎn)物可改變腸道菌群結(jié)構(gòu)，破壞腸道屏障功能，導(dǎo)致腸道發(fā)生慢性炎性反應(yīng)[2]。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，采用酒精誘導(dǎo)的ALD小鼠腸道中厚壁菌屬/擬桿菌屬比值顯著下降[3]。酒精暴露還會(huì)促進(jìn)細(xì)菌移位，影響免疫系統(tǒng)對(duì)腸-肝循環(huán)體系中有害物質(zhì)的清除能力。在非酒精性肝病(non-alcoholic liver disease，NAFLD)人群中，肥胖病人腸道菌群與正常人有所不同。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明,將高脂飼料組小鼠腸道菌群移植到正常小鼠后，正常小鼠體重明顯增加，說(shuō)明腸道菌群在代謝相關(guān)疾病中發(fā)揮重要作用[4]。肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)的發(fā)生與腸道菌群之間也存在聯(lián)系。腸道菌群的次生產(chǎn)物可以與Toll樣受體結(jié)合，引起炎性反應(yīng)從而促進(jìn)腫瘤發(fā)生[5]。有研究表明，使用抗生素干擾小鼠腸道菌群，通過(guò)消耗腸道共生細(xì)菌，阻止初級(jí)膽汁酸轉(zhuǎn)化，上調(diào)肝臟中某些初級(jí)膽汁酸，進(jìn)而產(chǎn)生天然殺傷性T細(xì)胞的蓄積，可使正常組織免受腫瘤侵犯[6]。Th17細(xì)胞能促進(jìn)部分腫瘤的發(fā)生，腸道菌群與其所分泌的IL-17存在一定關(guān)系。有研究表明，通過(guò)改變腸道菌群可以下調(diào)IL-17，改變腫瘤生長(zhǎng)的微環(huán)境，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡[7]。這些研究都為腸道菌群與腫瘤發(fā)生發(fā)展間的聯(lián)系提供了參考。

2.肝移植手術(shù)與腸道微生態(tài)：肝臟70%的血供來(lái)自門靜脈，門靜脈血流很大一部分來(lái)自結(jié)腸。因此，肝臟容易暴露在腸源性抗原刺激之下，它是抵擋腸源性抗原的防線[8]。肝移植手術(shù)與腸道菌群失調(diào)、移位密切相關(guān)。越來(lái)越多的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)與臨床試驗(yàn)結(jié)果表明，在肝移植手術(shù)前后，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物或臨床病人腸道微生態(tài)結(jié)構(gòu)、腸道菌群數(shù)目均發(fā)生明顯改變。在大鼠原位肝移植模型中，與非手術(shù)組相比，實(shí)驗(yàn)組在肝移植術(shù)后24小時(shí)發(fā)生了明顯的腸道菌群紊亂，表現(xiàn)為腸桿菌和腸球菌數(shù)量增加，乳酸桿菌和雙歧桿菌數(shù)量下降，腸黏膜上皮細(xì)胞微絨毛損傷，血漿內(nèi)毒素水平升高，細(xì)菌易位至肝臟、脾臟及腸系膜淋巴結(jié)。術(shù)后1個(gè)月使用變性梯度凝膠電泳(polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis,PCR-DGGE)法檢測(cè)腸道菌群，這些改變?nèi)圆荒芑謴?fù)至正常水平[9]。臨床研究中也有類似發(fā)現(xiàn)，移植術(shù)后病人糞便中，雙歧桿菌、柔嫩梭菌及乳酸桿菌數(shù)量下降，腸桿菌及腸球菌數(shù)量增加，并隨著手術(shù)后時(shí)間推移，菌群結(jié)構(gòu)與菌群數(shù)量會(huì)逐步緩慢恢復(fù)至正常[10]?？傮w來(lái)說(shuō)，肝移植術(shù)后腸道微生態(tài)的多樣性會(huì)被破壞，造成某些腸道菌群及其分泌物的缺乏，不利于術(shù)后恢復(fù)。

二、腸道微生態(tài)對(duì)肝移植術(shù)后恢復(fù)的影響

正常的腸道微生態(tài)有利于肝移植病人術(shù)后恢復(fù)。腸道微生態(tài)失衡則會(huì)導(dǎo)致一系列術(shù)后并發(fā)癥以及移植肝功能延遲恢復(fù)。

1.腸道微生態(tài)與膽道并發(fā)癥：腸道微生態(tài)失衡易引起膽道并發(fā)癥，以缺血性膽道病(ischemic type biliary lesion，ITBL)最為常見。ITBL又稱非吻合口膽道狹窄，是肝移植術(shù)后最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，表現(xiàn)為膽汁淤積和膽道感染，嚴(yán)重影響手術(shù)預(yù)后。病人常需反復(fù)住院治療，移植肝功能持續(xù)惡化，部分病人難以避免接受再次移植。研究表明，缺血再灌注損傷、免疫因素和膽汁酸均與ITBL的發(fā)生有關(guān)，而腸道微生態(tài)與這三者均存在聯(lián)系。腸道微生態(tài)與膽汁酸之間存在“腸-肝軸”的關(guān)系。一方面，腸道菌群可以調(diào)節(jié)膽汁酸代謝穩(wěn)態(tài)；另一方面，膽汁酸也可以影響腸道微生態(tài)構(gòu)成。初級(jí)膽汁酸進(jìn)入腸道后，需要在腸道多種細(xì)菌分泌的酶的作用下解離、脫羥基、異構(gòu)化、氧化來(lái)增加膽汁酸的親水性，使其不會(huì)通過(guò)疏水的腸道上皮丟失。同時(shí)，初級(jí)膽汁酸向次級(jí)膽汁酸轉(zhuǎn)化過(guò)程所需要的7α-脫羥基酶也由腸道細(xì)菌分泌產(chǎn)生[11]。一項(xiàng)臨床橫斷面研究發(fā)現(xiàn)，肝硬化病人的初級(jí)膽汁酸水平和腸桿菌數(shù)量均顯著增加，而產(chǎn)生7α-脫羥基的細(xì)菌均減少[12]?？傊c道微生態(tài)與膽汁酸之間存在相互作用，腸道菌群失調(diào)可影響正常膽汁酸代謝過(guò)程，膽汁酸代謝紊亂也會(huì)反過(guò)來(lái)導(dǎo)致腸道微生態(tài)失衡，而腸道菌群改變是導(dǎo)致ITBL的重要因素。

2.腸道微生態(tài)與術(shù)后感染：肝移植圍手術(shù)期腸道微生態(tài)發(fā)生變化，可導(dǎo)致腸道菌群多樣性下降，失去其正常屏障功能，一些本不該出現(xiàn)的腸道菌群大量繁殖，增加了移植術(shù)后病人的感染風(fēng)險(xiǎn)。一項(xiàng)回顧性臨床研究顯示，通過(guò)比較分析肝移植病人術(shù)前和術(shù)后1個(gè)月內(nèi)腸道菌群變化，發(fā)現(xiàn)腸道菌群多樣性降低與術(shù)后感染并發(fā)癥密切相關(guān)[13]。PCR-DGGE檢測(cè)病人糞便發(fā)現(xiàn)，術(shù)后住院時(shí)間較短的病人的腸道菌群僅有輕微變化。此外，在2例術(shù)后腹腔感染的病人糞便中還發(fā)現(xiàn)了齒雙歧桿菌，這是一種主要存在于口腔的定植菌，只有在病理狀態(tài)下才會(huì)在腸道中出現(xiàn)。肝移植手術(shù)會(huì)造成腸道菌群移位。一項(xiàng)研究通過(guò)脈沖場(chǎng)凝膠電泳技術(shù)(pulsed field gel electrophoresis，PFGE)分析肝移植受者術(shù)后15天的腸道菌群發(fā)現(xiàn)，未進(jìn)行腸道微生態(tài)干預(yù)的病人腸道菌群移位發(fā)生率為32%，其中腹腔感染6例，口服乳酸菌和雙歧桿菌治療的干預(yù)組腸道菌群移位發(fā)生率為8%，其中腹腔感染1例，可見腸道微生態(tài)與肝移植術(shù)后腹腔感染相關(guān)，微生態(tài)調(diào)節(jié)治療可有效降低感染發(fā)生率[14]。

3.腸道微生態(tài)與免疫排斥：肝移植術(shù)后排斥反應(yīng)與免疫系統(tǒng)密切相關(guān)，多由T細(xì)胞介導(dǎo)產(chǎn)生。有研究顯示，腸內(nèi)乳酸菌和雙歧桿菌可以減輕急性排斥反應(yīng)中的免疫損傷，這可能是由于腸道益生菌對(duì)T細(xì)胞 、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β及CD4/CD8比例的影響造成的[15]。還有研究證實(shí)腸道菌群能夠促進(jìn)T細(xì)胞分化，調(diào)節(jié)自然殺傷T細(xì)胞(natural killer T cell，NK-T)和自然殺傷細(xì)胞(natural killer cell，NK)的發(fā)育成熟過(guò)程，而NK-T細(xì)胞、NK細(xì)胞均與移植術(shù)后的免疫排斥相關(guān)[16]。大量研究已證實(shí)，肝移植術(shù)后病人腸道菌群改變與急性排斥反應(yīng)的發(fā)生有關(guān)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中也有類似發(fā)現(xiàn)，發(fā)生急性排斥反應(yīng)的肝移植大鼠，其腸道菌群特點(diǎn)為擬桿菌屬和瘤胃球菌屬過(guò)度增殖，這種改變可能是由血清內(nèi)毒素水平升高和腸道菌群移位造成的。Ren等[17]研究肝移植大鼠回盲腸內(nèi)容物后發(fā)現(xiàn)，急性排斥反應(yīng)發(fā)生時(shí)微生物數(shù)量及多樣性均下降，其中厚壁菌門減少，而擬桿菌門增加。肝功能尚正常時(shí)急性排斥反應(yīng)可能已經(jīng)發(fā)生，此時(shí)腸道菌群與急性排斥反應(yīng)進(jìn)展期相似，檢測(cè)腸道菌群改變可能比肝功能指標(biāo)能更早地提示急性排斥反應(yīng)。

4.腸道微生態(tài)與缺血再灌注損傷：腸道微生態(tài)改變還可能與術(shù)后腸道和移植肝的缺血再灌注損傷有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，小鼠腸道細(xì)菌能通過(guò)釋放一系列小分子物質(zhì)至循環(huán)系統(tǒng)，上調(diào)肝竇內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞間黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1)的表達(dá)，從而提高離體肝臟對(duì)冷保存和缺血再灌注損傷的敏感性[18]。另一項(xiàng)研究表明，在大鼠肝移植前對(duì)移植肝進(jìn)行缺血預(yù)處理可以保護(hù)受體大鼠的腸道菌群，預(yù)處理后肝移植大鼠術(shù)后的腸道菌群與未移植大鼠的腸道菌群相似，而直接行肝移植的大鼠腸道菌群會(huì)顯著改變，證明了移植肝缺血預(yù)處理對(duì)正常腸道菌群的保護(hù)價(jià)值，也證明了腸道菌群與缺血再灌注損傷之間的聯(lián)系[19]。另外，在小鼠研究中發(fā)現(xiàn)，通過(guò)限時(shí)喂養(yǎng)(time-restricted feeding，TRF)，即每天動(dòng)物禁食14～16小時(shí)，可以在滿足營(yíng)養(yǎng)的同時(shí)通過(guò)影響腸道微生態(tài)達(dá)到減輕肝缺血再灌注損傷的目的[19]。與正常進(jìn)食小鼠相比，TRF小鼠的腸道菌群與上皮連接更為緊密，減少了細(xì)菌移位，且術(shù)后肝功能恢復(fù)更迅速。一項(xiàng)臨床研究發(fā)現(xiàn)，在肝移植術(shù)后應(yīng)用利福昔明可以通過(guò)調(diào)節(jié)腸道菌群來(lái)減輕肝缺血再灌注損傷[20]。使用利福昔明的病人術(shù)后血清轉(zhuǎn)氨酶水平恢復(fù)更快，術(shù)后肝活檢巨噬細(xì)胞標(biāo)志物、中性粒細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)也較低，這些都表明肝缺血再灌注損傷更輕。腸道微生態(tài)的穩(wěn)定可以通過(guò)抑制移植物中的炎癥細(xì)胞活化而發(fā)揮對(duì)肝缺血再灌注損傷的保護(hù)功能。

三、 腸道微生態(tài)治療的可行性與展望

腸道微生態(tài)的重要性已經(jīng)被越來(lái)越多的專家學(xué)者證實(shí)。人們逐漸將腸道微生物作為治療靶點(diǎn)，通過(guò)改善肝移植后腸道微生態(tài)失衡，促進(jìn)腸道環(huán)境恢復(fù)正常，將有助于減少和治療術(shù)后并發(fā)癥，這類療法統(tǒng)稱為腸道菌群干預(yù)。目前，如何通過(guò)腸道微生態(tài)治療來(lái)促進(jìn)肝移植術(shù)后恢復(fù)仍處在探索階段。應(yīng)用最廣泛的是直接影響腸道菌群的抗生素和益生菌。此外，腸道去污染，術(shù)前腸道缺血預(yù)處理，糞便菌群移植等方案也有研究報(bào)道。

1.抗生素與腸道去污染：在肝移植術(shù)后恢復(fù)階段，由于手術(shù)原因和免疫抑制劑的使用，病人感染的風(fēng)險(xiǎn)較高。選擇性腸道去污染(selective decontamination of digestive tract，SDD)是指應(yīng)用抗生素殺滅腸道內(nèi)的機(jī)會(huì)致病菌，保留腸道原有專性厭氧菌，減少細(xì)菌移位和腸源性感染的發(fā)生幾率。早期研究發(fā)現(xiàn)，SDD能夠減少腸道中革蘭陰性需氧菌及假絲酵母菌(念珠菌)的數(shù)量，降低相應(yīng)感染并發(fā)癥。然而，有研究發(fā)現(xiàn)在革蘭陰性菌被殺滅后，革蘭陽(yáng)性菌則成為優(yōu)勢(shì)菌群，并導(dǎo)致感染發(fā)生。另一后續(xù)研究顯示，SDD不能降低原位肝移植術(shù)后感染的發(fā)生率，僅僅改變了感染的分布類型，革蘭陽(yáng)性球菌感染替代了原來(lái)占主導(dǎo)地位的桿菌及假絲酵母菌感染。另外，SDD增加了原有細(xì)菌的耐藥性，導(dǎo)致治療感染時(shí)需要更大的抗生素使用量，并且延長(zhǎng)了住院時(shí)間[21]。盡管抗生素治療是肝移植術(shù)后不可或缺的一環(huán)，但目前大部分觀點(diǎn)認(rèn)為，肝移植術(shù)后為了減少腸道感染而人為進(jìn)行SDD并不可取。然而，一項(xiàng)薈萃分析顯示，SDD降低了肝移植后肺炎的發(fā)生率[22]。

2.益生菌與益生元：使用益生菌和益生元來(lái)調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)也是目前較熱門的輔助治療。一般情況下，肝移植術(shù)后腸道乳酸菌和雙歧桿菌數(shù)量會(huì)減少。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，大鼠肝移植后補(bǔ)充乳酸菌和雙歧桿菌，能夠改善腸道屏障功能并減少細(xì)菌移位，促進(jìn)腸道菌群的恢復(fù)，并且乳酸菌和雙歧桿菌可以減輕大鼠在急性排斥反應(yīng)中的排斥損傷，這可能是由于腸道益生菌對(duì)T細(xì)胞、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β及CD4/CD8細(xì)胞比例具有調(diào)節(jié)作用所致[23]。臨床薈萃分析顯示，肝移植術(shù)前或手術(shù)當(dāng)天給予益生菌能夠減少肝移植術(shù)后感染發(fā)生率、抗生素使用療程及住院時(shí)間[24]。有報(bào)道就腸道益生菌的使用做出總結(jié)，肝移植術(shù)后24小時(shí)內(nèi)開始早期腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)，起始鼻飼速度每小時(shí)20 ml，聯(lián)合使用乳酸桿菌屬20 mg、雙歧桿菌屬15 mg，每天3次；鼻飼盡早轉(zhuǎn)換為經(jīng)口進(jìn)食，持續(xù)至少14天[25]。但目前國(guó)內(nèi)報(bào)道仍較少，該標(biāo)準(zhǔn)僅供參考。

3.缺血預(yù)處理(ischemic preconditioning，IPC)：IPC是指在手術(shù)前對(duì)靶器官進(jìn)行短暫反復(fù)的缺血再灌注處理，在不傷害身體的同時(shí)誘導(dǎo)產(chǎn)生保護(hù)機(jī)制，從而減輕正式手術(shù)時(shí)器官對(duì)缺血再灌注損傷的敏感程度。有研究發(fā)現(xiàn)，在肝移植術(shù)前進(jìn)行IPC可以改善肝移植術(shù)后移植物功能，降低ALT、AST水平[26]。經(jīng)過(guò)IPC處理后，術(shù)后的腸黏膜超微結(jié)構(gòu)較對(duì)照組改善，血清內(nèi)毒素降低，細(xì)菌移位減少，糞便sIgA含量增加，血清TNF-α降低。此外，IPC可以通過(guò)增加雙歧桿菌屬，梭狀芽孢桿菌簇來(lái)促進(jìn)腸道微生物結(jié)構(gòu)和數(shù)量的恢復(fù)。經(jīng)PCR-DGGE法證實(shí)，IPC增加或保留了腸道微生物的多樣性和豐富度。IPC不僅可以促進(jìn)移植肝功能恢復(fù)和保留腸屏障功能，還可以促進(jìn)肝移植術(shù)后腸道菌群恢復(fù)，充分發(fā)揮“腸-肝軸”的正反饋?zhàn)饔?。目前該方法在臨床肝移植中報(bào)道較少。

4.糞便菌群移植(fecal microbiota transplantation，F(xiàn)MT)：FMT是將正常人的糞便直接移植到病人腸道內(nèi)，幫助病人快速恢復(fù)腸道正常菌群的方法。既往FMT常用于各種腸炎和腸道感染的治療，也取得了一定的效果。如在艱難梭菌感染(clostridium difficile infection，CDI)的治療中，F(xiàn)MT較傳統(tǒng)抗生素治療效果更佳[27]。1次FMT后療效可維持24周，較益生菌更為持久。然而，關(guān)于FMT的倫理問(wèn)題和安全問(wèn)題一直存在爭(zhēng)議，目前也沒(méi)有規(guī)范化的FMT標(biāo)準(zhǔn)。目前FMT在臨床肝移植中尚未見報(bào)道。糞便獲取簡(jiǎn)便快捷，且具有代替部分抗生素治療的作用，其在腸道菌群治療中的前景不容忽視。

四、小結(jié)

隨著PCR-DGGE等技術(shù)的發(fā)展，腸道菌群的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)成為可能，人們開始致力于研究腸道微生態(tài)與各種疾病之間的聯(lián)系。在肝移植領(lǐng)域中，越來(lái)越多的研究開始關(guān)注病人圍手術(shù)期腸道微生態(tài)的變化，并發(fā)現(xiàn)肝病本身和移植手術(shù)造成的缺血再灌注損傷都會(huì)改變腸道菌群的分布。在圍手術(shù)期，腸道菌群狀態(tài)對(duì)肝移植術(shù)后并發(fā)癥的發(fā)生具有重要影響，它與膽道并發(fā)癥、缺血再灌注損傷、感染、排斥反應(yīng)等關(guān)系密切。腸道菌群及其分泌物在膽汁酸生成的“腸-肝循環(huán)”和免疫調(diào)節(jié)中起重要作用。肝移植圍手術(shù)期合理使用抗生素、益生菌調(diào)節(jié)腸道菌群，維持腸道細(xì)菌穩(wěn)態(tài)，可促進(jìn)腸道微生態(tài)恢復(fù)正常，進(jìn)而預(yù)防肝移植術(shù)后并發(fā)癥，改善病人預(yù)后。在肝移植病人中使用SDD、FMT和IPC治療仍存在爭(zhēng)議。腸道微生態(tài)的研究和應(yīng)用前景廣闊，期待隨著研究的深入使得腸道微生態(tài)治療成為一種常規(guī)治療手段，改善肝移植病人預(yù)后。