自身免疫性肝炎自身抗體的研究進(jìn)展

張海萍， 閆惠平

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院 臨床檢驗中心， 自身免疫性肝病臨床研究中心， 北京 100069

自身免疫的血清學(xué)檢測是診斷和治療自身免疫疾病的關(guān)鍵指標(biāo)。在國內(nèi)外自身免疫性肝炎(AIH)指南或共識中，自身抗體都是不可或缺的診斷指標(biāo)之一[1-2]。利用自身抗體的靶抗原進(jìn)行動物實驗或體外實驗研究是認(rèn)識AIH發(fā)病機(jī)制的重要途徑。自身抗體不同于其他種類的檢驗項目，其特殊性在于：某些自身抗體的方法學(xué)對于結(jié)果的判斷和臨床意義的認(rèn)識可以產(chǎn)生較大影響；出現(xiàn)于AIH的自身抗體種類較多，而且大部分患者檢測到的自身抗體對疾病都缺乏特異性；自身抗體也存在于病毒性肝炎和其他常見肝病中。因此在診斷AIH之前正確地理解和判斷自身抗體結(jié)果的臨床意義是很重要的。

參考自身抗體結(jié)果，AIH一般分為1型和2型兩種臨床型[3]。與AIH-1型相關(guān)的自身抗體主要包括：抗核抗體(ANA)、抗平滑肌抗體(anti-smooth muscle antibody，ASMA)、抗可溶性肝抗原/肝胰抗原抗體(anti-soluble liver antigen and liver pancreas antigen, anti-SLA/LP, 以下簡稱抗-SLA)和抗中性粒細(xì)胞抗體(anti-neutrophil cytoplastic antibody, ANCA)；與AIH-2型相關(guān)的自身抗體主要包括：抗肝腎微粒體抗體(anti-liver kidney microsomal antibody，抗-LKM)和抗肝細(xì)胞溶質(zhì)抗原抗體-1(anti-liver cytosol type 1，抗-LC1)。本文將對自身抗體的基本檢測方法簡單評價，并簡介AIH的主要自身抗體。

1 相關(guān)指南對自身免疫性肝病主要自身抗體檢測方法的推薦意見

臨床醫(yī)生應(yīng)了解自身抗體的檢測方法。自身抗體和免疫球蛋白是診斷自身免疫性肝病的關(guān)鍵指標(biāo)，正確認(rèn)識自身抗體的意義需要對用于自身抗體檢測的實驗室基本技術(shù)知識有所了解。

1.1 基本檢測方法 ANA總抗體的檢測方法依然推薦以HEp-2細(xì)胞(人喉癌上皮細(xì)胞系)作為基質(zhì)、間接免疫熒光法(indirect immune fluorescent assay, IIF)檢測[4-5]；肝臟相關(guān)的其他自身抗體，如ASMA，以嚙齒類動物組織為基質(zhì)、IIF法仍然是篩查的“金標(biāo)準(zhǔn)”。雖然IIF方法存在明顯不足，例如，該法采用的血清稀釋體系國內(nèi)各醫(yī)療機(jī)構(gòu)不統(tǒng)一，導(dǎo)致檢驗結(jié)果不能互認(rèn)；其結(jié)果的判讀與技術(shù)人員水平、儀器等多因素有關(guān)。在許多檢驗項目中早已被其他方法學(xué)取代，但是在自身抗體檢測中，當(dāng)前仍不可或缺[6]。目前，基于純化蛋白或重組抗原的檢測方法越來越多地被使用，主要優(yōu)點是不受觀察者的人為因素影響，但局限性是只能檢測到已被確定自身抗原靶點的自身抗體。已經(jīng)廣泛用于臨床的方法如，免疫印跡法(IB或WB)、ELISA及化學(xué)發(fā)光法、流式熒光法等，其中一些具有自動化程度較高、操作易于標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)勢，可能成為這一領(lǐng)域的技術(shù)發(fā)展趨勢。

1.2 指南推薦的方法 歐洲肝病學(xué)會(EASL)AIH指南中強(qiáng)調(diào)：IIF法是除抗-SLA外所有AIH相關(guān)自身抗體常規(guī)檢測的首選和主要技術(shù)[2]。ANA、ASMA、抗-LKM-1和抗-LC1可以聯(lián)合檢測(如果抗-LKM-1陰性，還可以檢測LKM-3)。IIF法檢測肝臟自身抗體應(yīng)在新鮮冰凍的嚙齒動物基質(zhì)上進(jìn)行，通常包括腎臟、肝臟和胃。在原發(fā)性膽汁性膽管炎(PBC)的指南[7]中推薦，對不能解釋原因的所有膽汁淤積病例，建議采用IIF法進(jìn)行血清抗線粒體抗體(AMA)和PBC特異性ANA的篩查。而對AIH唯一具有診斷特異性的抗-SLA，由于缺乏典型熒光圖形而不推薦IIF法檢測。其確切的靶抗原已在分子水平上鑒定，并用于固相分析，因此推薦ELISA或免疫印跡方法(IB或WB)檢測抗-SLA。

2 AIH的主要自身抗體

2.1 抗核抗體(ANA)

是各種自身免疫疾病首選檢驗項目，最常見陽性但臨床意義最復(fù)雜多樣。

2.1.1 ANA在肝臟疾病中的檢出率 ANA是AIH最常見的自身抗體，是AIH-1型的診斷標(biāo)志之一。在北美白人中，AIH的成年患者發(fā)病時80%可以檢測到ANA[3]，在歐洲50%～70%的AIH患者ANA陽性[2]，在我國70%～80%的AIH患者呈ANA陽性，ANA和(或)ASMA陽性者可達(dá)80%～90%[1]。但遺憾的是，這種最高檢出率的自身抗體對AIH的診斷并不是特異性的。依據(jù)AIH的診斷評分系統(tǒng)，ANA陽性的肝病患者需要先排除病毒性肝病等疾病，再結(jié)合血清IgG和肝組織學(xué)改變等特征才可以確診AIH[8-9]。 此外，疑似藥物性肝損傷的患者也可能出現(xiàn)ANA，或?qū)崬樗幬镎T導(dǎo)的AIH，需要謹(jǐn)慎做出鑒別診斷[6]。ANA在PBC患者中常以特征性的形式出現(xiàn)(抗gp210或抗sp100陽性，或熒光核型)，稱為PBC特異性ANA。ANA也可在原發(fā)性硬化性膽管炎(PSC)(29%)、慢性丙型肝炎(26%)、慢性乙型肝炎(32%)、非酒精性脂肪性肝病(34%)和慢性酒精性肝病(21%)中出現(xiàn)。在AIH以外的肝臟疾病中，ANA和ASMA同時出現(xiàn)的比例小于10%，如果同時出現(xiàn)兩種自身抗體，則AIH的診斷準(zhǔn)確率從58%提高到74%[3]。

2.1.2 ANA的熒光核型 判讀IIF法ANA檢驗報告的臨床意義，主要依據(jù)其熒光核型和抗體滴度[10]。熒光核型是指采用HEp-2細(xì)胞為基質(zhì)，IIF檢測ANA時，由于ANA的靶抗原性質(zhì)或位置的不同，在熒光顯微鏡下觀察到的形態(tài)各異的熒光圖形。核型的分類可以依據(jù)“ANA核型的國際共識”[5]中的描述來報告：例如，位于細(xì)胞核的核型有核均質(zhì)型、核顆粒型、著絲點型、核仁型等；位于細(xì)胞漿的核型有胞漿顆粒型、高爾基體型、溶酶體型等。AIH患者的ANA可表現(xiàn)為核均質(zhì)型、核顆粒型、核仁型或混合核型，提示其靶抗原可能為染色質(zhì)、雙鏈DNA、核糖體蛋白等。但這些熒光核型均不是AIH診斷特異性的核型。例如，核均質(zhì)型在系統(tǒng)性紅斑狼瘡比較常見，是臨床需要鑒別的問題。相比之下，PBC的ANA具有特征性的核型，輔助診斷的作用要強(qiáng)很多：例如，核周型(或稱核膜型)及核點型ANA對PBC具有診斷特異性，被稱為PBC特異性ANA。由于人類肉眼分辨和判斷核型的能力有限，而目前基于計算機(jī)軟件的圖像分析系統(tǒng)判斷核型的能力也有諸多局限性，這是造成臨床ANA結(jié)果不一致的重要原因之一。

2.1.3 ANA滴度 ANA滴度對疾病診斷有重要價值，在自身免疫疾病時多表現(xiàn)高滴度陽性，而在病毒性肝炎、藥物性肝損傷等情況下可能低滴度陽性。如何判斷抗體滴度的高低？1∶160與1∶320孰高孰低？答案不能一概而論。目前國內(nèi)許多醫(yī)院與國外采用試劑不同，而國內(nèi)IIF檢測自身抗體主要有兩種稀釋體系，各個醫(yī)院采用試劑的檢測稀釋體系不同，可能會導(dǎo)致同一份樣本在A醫(yī)院報告1∶160陽性，而在B醫(yī)院報告1∶1000陽性。因此，不同醫(yī)院的ANA結(jié)果主要依據(jù)自己的參考范圍，不同稀釋體系之間的結(jié)果目前還難以互認(rèn)。

2.2 抗平滑肌抗體(ASMA) ASMA與ANA均為AIH-1型的主要診斷標(biāo)志，約半數(shù)ANA陽性的病例與ASMA有關(guān)。在歐洲AIH患者中50%～70%可檢測到ASMA，北美AIH患者中約63%出現(xiàn)ASMA，但國內(nèi)報道陽性率多低于歐美國家，僅有20%～30%的AIH患者呈ASMA陽性[1]。而且，ASMA還常常在病毒性肝炎患者血清中檢測到。后者的特點是抗體滴度一般較低，且有可能在一段時間內(nèi)陰轉(zhuǎn)。在美國，ASMA可作為PSC(6%)、慢性丙型肝炎(6%)和慢性酒精性肝病(4%)的單獨(dú)血清學(xué)指標(biāo)出現(xiàn)[3]。

指南推薦采用IIF方法，以哺乳動物的胃、腎等組織作為基質(zhì)檢測ASMA[2]。ASMA在熒光顯微鏡下顯示不同的染色模式：血管/腎小球和血管/腎小球/腎小管模式被認(rèn)為是對AIH診斷具有特異性的，而僅有血管模式的情況可在多種疾病中發(fā)現(xiàn)[11]。筆者牽頭在2018年依托兩個學(xué)會組織進(jìn)行了“全國自身免疫性肝病相關(guān)自身抗體檢測室間質(zhì)量調(diào)查”活動，參與調(diào)查的138家醫(yī)療機(jī)構(gòu)(來自全國27個省、自治區(qū)和直轄市，以三級以上醫(yī)療機(jī)構(gòu)為主體)回報的結(jié)果提示，ASMA檢測全部采用IIF，與國際指南推薦方法一致。Shibuki等[12]報告，根據(jù)國際自身免疫性肝炎組織(International Autoimmune Hepatitis Group, IAIHG)提出的修訂評分系統(tǒng)，回顧分析了2009年-2014年在Saga肝病研究組的4家醫(yī)院診斷為AIH-1型的53例患者的病歷，所有患者治療后均獲得緩解，9例(17%)隨后復(fù)發(fā)。復(fù)發(fā)患者具有明顯年輕，ASMA陽性率高于未復(fù)發(fā)患者(100% vs 25%，P=0.001 2)的特點。而ANA滴度與復(fù)發(fā)率無關(guān)。提示ASMA是AIH-1型患者停藥期間或停藥后復(fù)發(fā)的一個預(yù)測指標(biāo)；對高滴度ASMA患者應(yīng)注意免疫抑制治療的隨訪。

2.3 抗肌動蛋白抗體(抗-actin) ASMA的靶抗原是細(xì)胞骨架成分，包括微絲、微管和中間絲，而微絲中主要是肌動蛋白，后者又可分為G-肌動蛋白和F-肌動蛋白。高滴度F-肌動蛋白抗體對診斷AIH-1的特異性較高。其與ASMA同時檢測或采用ELISA方法(定量)檢測，可有助于提高AIH的診斷率。曾有研究[13]顯示，ASMA(>1∶80)和抗-actin(>1∶40)與AIH-1型患者的血清生化指標(biāo)和組織學(xué)疾病活動度有關(guān)，并預(yù)示治療失敗概率較高?？?actin陽性成人患者發(fā)病年齡早、糖皮質(zhì)激素治療反應(yīng)較差，肝衰竭病死率和肝移植需求率均高于ANA陽性患者[13]。另外，抗-α-actinin是一種絲狀肌動蛋白交聯(lián)蛋白，存在于42%的AIH患者和66%的抗-actin 陽性AIH患者中[14]?？?actin和抗-α-actinin同時陽性與急性重型AIH、治療不完全及復(fù)發(fā)有關(guān)[14-15]。但近年有關(guān)抗-actin研究進(jìn)展的報道較少。G-肌動蛋白則與酒精性肝硬化有關(guān)。

2.4 抗可溶性肝抗原/肝胰抗原抗體(抗-SLA) 1987年首次報道了抗-SLA[16]。2000年Wies等[17]應(yīng)用高滴度SLA抗體血清對cDNA表達(dá)文庫進(jìn)行免疫篩選，鑒定出抗-SLA與肝胰抗原(LP)系同一種靶抗原，故將其相應(yīng)抗體統(tǒng)稱為抗-SLA/LP。抗-SLA是一種可溶性胞質(zhì)蛋白酶，進(jìn)一步的研究證明該抗原為O-磷酸絲氨酸-tRNA:硒-tRNA-合成酶，位于肝細(xì)胞漿內(nèi)，相對分子質(zhì)量為50 000。近年有文獻(xiàn)[6]已將抗-SLA/LP寫法簡化為抗-SLA。與其他自身抗體的檢測方法不同，指南推薦抗-SLA適宜采用ELISA、免疫印跡法或免疫斑點法等方法檢測[19]?；诿庖邔W(xué)新技術(shù)的檢測方法也已經(jīng)或者正在進(jìn)入臨床。

在AIH患者中，抗-SLA呈現(xiàn)的突出特點是高特異性和低檢出率。它是目前國內(nèi)外公認(rèn)唯一對AIH具有診斷特異性的自身抗體，國外報道[2,6,20]抗-SLA出現(xiàn)于AIH的頻率為10%～20%，我國一項多中心自身免疫性肝病回顧性調(diào)查[1]顯示，僅有6%(16/248)的AIH患者抗-SLA陽性。由于該抗體陽性檢出率很低，因此，大樣本的研究結(jié)果極少。筆者團(tuán)隊[21]曾對此抗體作了一項較大樣本的回顧性分析，77例抗-SLA陽性病例源于歷時9年，自25 200例次肝病患者的血清中收集。這些抗-SLA陽性患者呈現(xiàn)幾個特征：(1)90.9%為女性；女性比例高于我國指南[1]中對AIH患者性別分布的描述(男女比例約為1∶4)。初次診斷AIH時平均年齡50歲以上；青少年中無該抗體陽性者。(2)初次診斷時80%以上患者抗體表現(xiàn)為強(qiáng)陽性。(3)抗-SLA與ANA同時陽性70例(90.9%)，無與抗-LKM或抗-LC1同時陽性者。(4)抗-SLA陽性的AIH及AIH/PBC 重疊綜合征患者40%(28/70)已進(jìn)入肝病晚期或終末期，以失代償肝硬化及慢加急性肝衰竭為主。因此，鑒于抗-SLA對AIH診斷的高度特異性，對于不明原因肝病患者應(yīng)送檢抗-SLA，以明確AIH的診斷。另一項大樣本結(jié)果源自2019年一項歐洲多國家多中心研究[22]，89例抗-SLA陽性和230例抗-SLA陰性的AIH患者在臨床表現(xiàn)及病理特征上是相似的；但是抗-SLA陽性的患者可能需要更長期的免疫抑制劑治療。

Chen等[23]對包括美國、德國、日本在內(nèi)的8個研究中心的1297例 AIH 患者進(jìn)行Meta分析發(fā)現(xiàn)，與抗-SLA陰性患者相比，陽性患者的肝臟死亡風(fēng)險增加3倍以上，治療復(fù)發(fā)風(fēng)險增加近2倍。有報道[24]認(rèn)為抗-Ro52常與抗-SLA同時存在，推測抗-SLA對疾病的不良結(jié)局可能與抗-Ro52同時存在相關(guān)。但迄今為止，SLA在AIH發(fā)病機(jī)制中的作用尚不清楚。

2.5 抗肝腎微粒體(抗-LKM)和抗肝細(xì)胞溶質(zhì)抗原抗體-1(抗-LC1)

2.5.1 抗-LKM 分為3個亞型，通常以IIF法檢測抗-LKM總抗體，用免疫印跡法、ELISA及其他免疫學(xué)方法檢測抗-LKM-1型抗體?？?LKM(包括抗-LKM-1)和抗-LC1是AIH-2型的診斷標(biāo)志，通常在ANA和ASMA陰性的情況下被檢測到。不同于以成年患者為主的AIH-1型，2型患者多見于青少年及兒童。AIH-2型患者很少見，僅占總AIH的3%～ 4%，且在不同地區(qū)不同人群中差異較大。北美成人中抗-LKM-1對AIH的敏感度較低(1%)，而在英國和加拿大，13%～38%的兒童AIH患者中可以檢測到抗-LKM-1[3]。

抗-LKM-1的靶抗原為細(xì)胞色素P4502D6，是較早被認(rèn)識的AIH的靶抗原，并且有研究[25]證實在AIH患者肝臟內(nèi)有針對該自身抗原的CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞的存在。Gordon等[26]報道抗-LKM-1陽性的AIH患者比陰性患者的病情更嚴(yán)重。

2.5.2 抗-LC1 該抗體所識別的靶抗原是亞氨甲基轉(zhuǎn)移酶-環(huán)化脫氨酶，在10%的AIH-2型患者中抗-LC1是唯一可檢測到的自身抗體，其與AIH的疾病活動度和進(jìn)展有關(guān)[3]。但該抗體臨床十分罕見，也鮮見報道。

抗-LKM-1和抗-LC1具有較高的AIH診斷特異性。但是，它們也存在于其他肝病中。筆者在多年臨床樣本中發(fā)現(xiàn)，抗-LKM和抗-LC1在丙型肝炎、乙型肝炎及藥物性肝損傷中也會出現(xiàn)。韓瑩等[27]報道北京佑安醫(yī)院十幾年積累的15例抗-LKM陽性病例，其中7例診斷為AIH，8例因HCV RNA陽性而診斷為丙型肝炎。筆者團(tuán)隊曾診療1例反復(fù)肝功能異常伴有抗-LKM陽性兒童，初診時臨床和病理均診斷為藥物性肝損傷，經(jīng)糖皮質(zhì)激素反復(fù)治療后再次肝活檢，病理符合藥物誘導(dǎo)的AIH。由此提示，對抗-LKM陽性的兒童排除AIH診斷時需要謹(jǐn)慎。

2.6 AIH相關(guān)的其他自身抗體

2.6.1 抗中性粒細(xì)胞胞漿抗體(ANCA) ANCA尤其是非典型ANCA(pANCA)的存在，在缺乏其他自身抗體的情況下可提示AIH的診斷。由于它與PSC和炎癥性腸病也有關(guān)，這些疾病必須加以排除。

2.6.2 抗去唾液酸糖蛋白受體抗體(anti-asiaglycoprotein receptor, 抗-ASGPR) 抗-ASGPR是肝臟特異性的自身抗體，在AIH患者中有較高的陽性率。但遺憾的是，它對AIH并非特異性的，在病毒性肝炎等肝病中有一定陽性率，且一直缺乏可靠的商品化試劑，限制了其臨床應(yīng)用。

3 AIH 新標(biāo)志物的尋找

雖然AIH患者一般可以檢測到一種或幾種自身抗體，但是缺乏特異性血清標(biāo)志物是AIH較之PBC診斷困難的主要原因。多年來，許多學(xué)者在新標(biāo)志物的尋找方面做了大量工作，但臨床應(yīng)用的成果并不顯著。有報道[28]指出，在1例接受肝移植術(shù)后7年出現(xiàn)新發(fā)AIH的9歲兒童血清中發(fā)現(xiàn)了一種新的肝臟微粒體自身抗體。該兒童出現(xiàn)移植功能障礙伴有轉(zhuǎn)氨酶升高，血清γ球蛋白持續(xù)正常。肝組織學(xué)和大劑量潑尼松龍加硫唑嘌呤治療的反應(yīng)支持新發(fā)AIH的診斷。IIF法檢測此自身抗體呈現(xiàn)一種新的染色模式(采用基于人類而不是大鼠肝臟蛋白的免疫印跡法)，顯示其為一種針對人的細(xì)胞色素P4502C19抗原的新的肝臟微粒體自身抗體。

德國學(xué)者Engel等在2019年EASL和IAIHG會議上報告了一種AIH診斷相關(guān)自身抗體：抗亨廷頓相互作用蛋白-1相關(guān)蛋白(anti-Huntington interacting protein-1 related protein，抗-HIR-1 RP)。在單中心研究呈現(xiàn)較好結(jié)果的基礎(chǔ)上，該作者已在歐洲多個國家開展了多中心研究，結(jié)果表明該自身抗體診斷AIH的特異性優(yōu)于ANA和ASMA，敏感性優(yōu)于抗-SLA和抗-LKM。如果抗-HIR-1 RP與ANA、ASMA三種抗體聯(lián)合檢測，可明顯提高AIH的診斷敏感性，特別是對于未治療的AIH患者，該自身抗體有更高的診斷價值。

4 總結(jié)與展望

盡管AIH的發(fā)病機(jī)制和診斷治療研究近年來取得了長足的進(jìn)步，但依然面臨諸多問題和挑戰(zhàn)。AIH的診斷較為復(fù)雜，是排除診斷基礎(chǔ)上的綜合診斷，缺乏特異性診斷標(biāo)志物是AIH確診困難的主要問題。隨著免疫學(xué)、分子生物學(xué)等技術(shù)的迅速發(fā)展，期待有新的標(biāo)志物被發(fā)現(xiàn)，對診斷或發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識更有幫助。在傳統(tǒng)的檢測方法基礎(chǔ)上，自身抗體的檢測技術(shù)也在不斷進(jìn)展，期待其自動化、標(biāo)準(zhǔn)化的發(fā)展方向?qū)榕R床提供更準(zhǔn)確、更便于解讀的方法，提高疾病的診斷和治療水平。