哺乳動物早期胚胎發(fā)育調(diào)控的研究進展

趙向遠(yuǎn)，許保增

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所特種經(jīng)濟動物分子生物學(xué)重點實驗室，吉林 長春 130112）

在哺乳動物的早期胚胎發(fā)育中，受精后的胚胎基因組激活（Embryo genome activation,EGA）是一個十分復(fù)雜的過程，需要細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中一系列的分子調(diào)控機制，來確保兩個親本基因組可以在轉(zhuǎn)錄發(fā)生前進行重新編程和重組[1]。大量數(shù)據(jù)顯示，某些基因在核重編程過程中如轉(zhuǎn)錄不當(dāng)會對胚胎發(fā)育產(chǎn)生長期的不利影響。因此，準(zhǔn)確控制EGA 的發(fā)生時間對胚胎發(fā)育有著至關(guān)重要的作用。在大多數(shù)哺乳動物中，基因組的激活是逐步進行的，這一發(fā)現(xiàn)對考慮調(diào)控這一過程的相關(guān)機制具有重要意義[2]。如小鼠的EGA可分為三個轉(zhuǎn)變時期：①在1 細(xì)胞晚期，合子的基因組僅具有很微弱的轉(zhuǎn)錄活性；②在2 細(xì)胞早期（G1/S期）合成少量的蛋白質(zhì)包括70 kDa 熱應(yīng)激蛋白（Heatshock protein）、TRCs（Transcription-requiring complexes）、U2afbp-rs 剪切因子（Splicing factor）及翻譯起始因子—eIF-4C；③第二輪DNA 復(fù)制后的2 細(xì)胞晚期，開始合子基因激活的主要期，轉(zhuǎn)錄和翻譯活性增加，導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成的形式發(fā)生巨大變化[1]。在其他哺乳動物中，早期胚胎基因激活的時間稍晚一些，發(fā)育過程中需要轉(zhuǎn)錄的時間也稍遲一些。通常，基因激活的主要期在第2～3 次卵裂后開始，如兔子、牛、恒河獼猴和人類的基因組激活事件主要發(fā)生在4～8 細(xì)胞階段[2]。具體來說，有些基因在主要的基因組激活發(fā)生之前就已經(jīng)被轉(zhuǎn)錄了，其中大多數(shù)管家基因被激活。而染色質(zhì)蛋白含量的變化，特別是組蛋白和染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化，能夠調(diào)節(jié)基因組進行轉(zhuǎn)錄，并提供轉(zhuǎn)錄的特異性，基因增強子的轉(zhuǎn)錄也隨著染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變而激活[1]。在胚胎基因組轉(zhuǎn)錄激活的早期和后期階段，轉(zhuǎn)錄因子的活性和蛋白質(zhì)的合成也都是必不可少的，染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變和轉(zhuǎn)錄因子活性能夠為DNA 復(fù)制和裂解等過程提供一定的協(xié)調(diào)作用，這都是細(xì)胞周期依賴機制調(diào)控的結(jié)果[3]。在臨床上，許多體外成熟的卵母細(xì)胞在受精后的不同階段會出現(xiàn)發(fā)育停滯的現(xiàn)象，原因可能是基因變異，也可能是培養(yǎng)條件不合適[4]。因此，了解胚胎植入前胚胎發(fā)育能力的環(huán)境因素和分子調(diào)控機制，對于提高輔助生殖技術(shù)的成功率具有重要意義。

1 組蛋白修飾對哺乳動物早期胚胎發(fā)育的調(diào)控

組蛋白修飾在調(diào)控哺乳動物胚胎發(fā)育過程中對發(fā)育基因的表達具有十分重要的作用。在早期胚胎的基因組激活過程中，決定哪些基因可以轉(zhuǎn)錄以及何時轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵因素之一就是控制染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變時間[5]。決定染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的一個主要因素是與DNA 相關(guān)的組蛋白類型，核心組蛋白包括組蛋白H2A、H2B、H3 和H4，它們將DNA 組裝成核小體[6]。其他的連接組蛋白，包括組蛋白H1 的多變體和其它特定的發(fā)育形式，與核小體之間的DNA 相連，并負(fù)責(zé)染色質(zhì)的凝聚。而在發(fā)育過程中，不同的連接組蛋白與卵母細(xì)胞、早期胚胎和后期體細(xì)胞的染色質(zhì)有關(guān)。在4 細(xì)胞階段，第1個被鑒定的細(xì)胞間分子差異是組蛋白H3 精氨酸甲基化水平的差異，特別是R26 和17[7]，同時，高H3 甲基化水平與Nanog 和Sox2 表達的增加有關(guān)。在8 細(xì)胞階段，一些細(xì)胞會表達更高水平的與TE 有關(guān)的特異性轉(zhuǎn)錄因子Cdx2[8]。連接組蛋白的這些差異影響了染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，因為不同的連接組蛋白在它們與DNA的整體堿度和緊密度上有所不同，核心組蛋白與DNA的結(jié)合可以通過磷酸化和乙?；瘉碚{(diào)控。其中，組蛋白尾部賴氨酸殘基的乙?；瘻p少了DNA 與核心組蛋白的接觸，并通過其他DNA 結(jié)合蛋白進入DNA[9]。在小鼠體內(nèi)，一種由早期卵母細(xì)胞編碼的特異性組蛋白H1，從4 細(xì)胞發(fā)育到8 細(xì)胞階段的表達下降。有研究報道，組蛋白H1 首次出現(xiàn)在4 細(xì)胞階段[3]；也有研究稱組蛋白H1 在胚胎的2 細(xì)胞期有表達，甚至在1 細(xì)胞期就開始表達。在后者的研究中，沒有觀察到與MII中期紡錘體相關(guān)的組蛋白H1 的表達，而是與兩個原核有關(guān)[10]。在小鼠胚胎的1 細(xì)胞階段，組蛋白H1 的合成是不依賴于轉(zhuǎn)錄的，且明顯受卵母細(xì)胞編碼mRNA 的驅(qū)動。組蛋白H1 在2 細(xì)胞階段合成下降，然后在4 細(xì)胞階段恢復(fù)，這與從卵母細(xì)胞編碼的組蛋白H1轉(zhuǎn)錄本表達到胚胎轉(zhuǎn)錄本表達的轉(zhuǎn)變相一致[11]。同樣地，牛體細(xì)胞中組蛋白H1 直到8 細(xì)胞階段才在早期胚胎中檢測到。因此，早期胚胎中組蛋白H1 亞型表達的轉(zhuǎn)變可能反映的是卵母細(xì)胞的需求，而不是表達早期胚胎的特定功能。

組蛋白表達的其他變化發(fā)生在胚胎發(fā)育的早期階段。組蛋白 H2A 和 H3 的合成在1 細(xì)胞和2 細(xì)胞階段上調(diào)，但部分受到-鵝膏菌素的抑制[12]。在這些階段中，組蛋白H4 的合成對于基因轉(zhuǎn)錄而言是獨立的。因此，盡管在1 細(xì)胞和2 細(xì)胞階段，母體的轉(zhuǎn)錄本似乎完全負(fù)責(zé)H1 和H4 的表達，但胚胎基因組中也可能出現(xiàn)一些H2A 和H3 的表達，這可能有助于這些階段中與基因組激活相關(guān)的染色質(zhì)變化[13]。在體細(xì)胞中，組蛋白的合成是通過瞬時轉(zhuǎn)錄、翻譯和隨后的mRNA降解來調(diào)控和偶聯(lián)到S 期[9]。相比之下，在1 細(xì)胞階段，胚胎中組蛋白的合成除了胚胎組蛋白H2A 和 H3 基因的部分表達外，在很大程度上與S期不偶聯(lián)，受母體mRNA募集水平的調(diào)控[10]，這種對母體編碼mRNA的依賴為支持組蛋白在轉(zhuǎn)錄沉默早期轉(zhuǎn)變提供了必要的機制。

2 細(xì)胞周期協(xié)調(diào)細(xì)胞質(zhì)和核事件調(diào)控哺乳動物的早期胚胎發(fā)育

在利用mRNA 改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)錄因子的階段特異性合成來控制整個基因組激活的過程中，可能需要涉及染色質(zhì)重組和組蛋白乙酰化的核事件和與蛋白質(zhì)合成和翻譯后相關(guān)的細(xì)胞質(zhì)事件之間相互協(xié)調(diào)。但有研究認(rèn)為這種協(xié)調(diào)并非基因組激活所必需的，因為基因組激活的時間僅由細(xì)胞質(zhì)或核事件決定，而不是由兩者共同決定[14]。但在這種情況下胚胎可能存在基因組激活不完全或不正確的風(fēng)險。例如，如果基因組活化僅由核事件控制，缺乏細(xì)胞質(zhì)對必需轉(zhuǎn)錄因子的控制可能導(dǎo)致早產(chǎn)[15]，然后通過正常蛋白質(zhì)更新而過早降解，從而導(dǎo)致了這些轉(zhuǎn)錄因子的表達下降。相反，如果在核重編程之前激活轉(zhuǎn)錄因子并且建立精確的與基因調(diào)節(jié)相適應(yīng)的轉(zhuǎn)錄抑制狀態(tài)，那么嚴(yán)格的細(xì)胞質(zhì)調(diào)控機制可能會在基因激活中發(fā)生錯誤[16]。

細(xì)胞周期是一個協(xié)調(diào)細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核事件的有效手段。例如，在S 期可以調(diào)節(jié)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化，同時細(xì)胞周期依賴性激酶可以調(diào)節(jié)關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子和mRNA隱蔽、聚腺苷酸化或翻譯因子的活性，從而影響母體mRNA 的翻譯[3]。同時，細(xì)胞周期的進展確實會影響基因組的激活。例如，用DNA 聚合酶抑制劑阿非迪霉素（Aphidicolin）處理小鼠胚胎可降低1 細(xì)胞期的基因轉(zhuǎn)錄，同時也抑制了eIF-1A 基因的表達[18]。這些結(jié)果表明，第一輪的DNA復(fù)制可能促進基因組的激活，第二輪DNA 復(fù)制也對基因轉(zhuǎn)錄有一定的影響，許多基因在小鼠胚胎的2 細(xì)胞階段表現(xiàn)出短暫的轉(zhuǎn)錄爆發(fā)，如Aphidicolin 能夠在S 期阻止這些基因誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄下調(diào)，并使在2 細(xì)胞階段整體基因轉(zhuǎn)錄水平升高[18-19]。因此，第一輪DNA 復(fù)制是基因轉(zhuǎn)錄所必需的，也是創(chuàng)造轉(zhuǎn)錄抑制狀態(tài)的第一步，第二輪DNA 復(fù)制完成了向轉(zhuǎn)錄抑制狀態(tài)的過渡。

前兩輪DNA 復(fù)制的抑制作用可能包括結(jié)合去乙?；M蛋白、改變DNA 與核基質(zhì)的偶聯(lián)等其他特定變化。雖然這些變化在本質(zhì)上是抑制轉(zhuǎn)錄的，但實質(zhì)上它們是基因組激活的重要組成部分，因為它們可能提供正確調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄基因的能力[20-21]。由于染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化，可能僅僅是那些必需的轉(zhuǎn)錄因子有啟動子的基因表達，雖然具有強啟動子或增強子的基因會優(yōu)先表達，但在這一過程中，許多其他基因也可能表達，尤其是在基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄水平[22]。但轉(zhuǎn)錄的抑制狀態(tài)會減少這些不必要基因的表達，而強啟動子或增強子調(diào)控的基因?qū)掷m(xù)表達，這對接下來的基因激活至關(guān)重要。

3 轉(zhuǎn)錄因子對基因組激活的影響

雖然早期胚胎染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化在基因組激活中起到關(guān)鍵的作用，但單憑這些并改變并不能激活胚胎基因組的轉(zhuǎn)錄。在核轉(zhuǎn)移之后，轉(zhuǎn)錄能力強的細(xì)胞核進行轉(zhuǎn)錄的能力取決于受體細(xì)胞質(zhì)的發(fā)育階段[23]。細(xì)胞質(zhì)中的變化，尤其是轉(zhuǎn)錄因子的可用性、含量或是活性的變化在基因組激活中發(fā)揮同樣重要的作用。例如，Hox是動物早期胚胎發(fā)育過程中的重要調(diào)控因子，在許多動物物種中，Hox 基因簇以共線性的方式控制著轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程。在胚胎發(fā)育的第8.5 天，Hox 通過PRC1（Polycomb repressive complex 1）和 PRC2（Polycomb repressive complex 2）中的一組組蛋白修飾酶，結(jié)合甲基化組蛋白尾部的蛋白，在H3K4me3 處催化組蛋白H3 甲基化進行轉(zhuǎn)錄激活，控制脊椎動物身體軸的發(fā)育[24-25]。在果蠅中，轉(zhuǎn)錄因子Zelda 特異性地與合子基因最早的啟動子結(jié)合，并啟動它們進行激活，但目前還不清楚其他動物是否也有類似的現(xiàn)象[26]。研究表明，與哺乳動物多能性轉(zhuǎn)錄因子Oct4 同源的斑馬魚Pou5f1 在合子轉(zhuǎn)錄開始前就占據(jù)了SOX-POU的結(jié)合位點，并激活了最早的合子基因[27]。適當(dāng)?shù)腞NA 聚合酶活性對轉(zhuǎn)錄激活十分重要。對大多數(shù)基因而言，RNA 聚合酶II 的羧基末端結(jié)構(gòu)域（CTD）的過度磷酸化對轉(zhuǎn)錄激活是必需的[28]。在小鼠、家兔和非洲爪蟾中，CTD 在卵母細(xì)胞成熟過程中過度磷酸化，受精后不久磷酸化程度降低，然后在向2 細(xì)胞階段過渡時磷酸化程度又增加[29]，這一磷酸化的改變可能與核定位的突然增加有關(guān)。因此，RNA 聚合酶II 磷酸化狀態(tài)的改變可能是基因組激活的關(guān)鍵。

其他轉(zhuǎn)錄因子如Sp1、CBP、TBP和其他更特殊的轉(zhuǎn)錄因子，包括轉(zhuǎn)錄抑制蛋白在磷酸化狀態(tài)發(fā)生了變化[30]。例如，在許多系統(tǒng)中，Sp1 的DNA 轉(zhuǎn)錄活性在卵母細(xì)胞成熟時因磷酸化而降低。但是在1 細(xì)胞階段的G1 和G2 期觀察到Sp1 的磷酸化水平增加，并在后期被激活[31]。有關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的其他變化可能是啟動子發(fā)生顯著變化的基礎(chǔ)，小鼠的eIF-1A基因在2 細(xì)胞階段被誘導(dǎo)激活，但隨后表達有所下降。在成熟的卵母細(xì)胞中，約70%的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物來自于近端含有TATA的啟動子[32]。在基因組激活后，啟動子發(fā)生了一個轉(zhuǎn)變，即不含TATA 的啟動子使用效率更高。在早期小鼠胚胎或胚胎干細(xì)胞中，啟動子活性或增強子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活不需要TATA 盒，但在卵母細(xì)胞中則需要含有TATA 的啟動子有效表達[31,33]。啟動子的這種變化可能反映了轉(zhuǎn)錄因子含量的差異，這使得卵母細(xì)胞有其特有的轉(zhuǎn)錄序列，并伴隨著轉(zhuǎn)錄組激活相關(guān)基因的表達。

4 結(jié)論與展望

胚胎基因組激活作為哺乳動物胚胎著床前發(fā)育的重要階段，主要事件是來自胚胎基因組表達的轉(zhuǎn)錄本取代了指導(dǎo)早期發(fā)育的母體轉(zhuǎn)錄本。雖然現(xiàn)在對早期胚胎發(fā)育的調(diào)控機制已經(jīng)有了很多了解，但仍有很多問題目前尚未解決。蛋白質(zhì)的合成和母體mRNA 的轉(zhuǎn)錄抑制雖然在基因組激活中發(fā)揮著重要作用，但我們對募集到的母體轉(zhuǎn)錄本序列及其編碼蛋白所發(fā)揮的功能知之甚少，關(guān)于細(xì)胞周期的通路是如何調(diào)控這些mRNA 翻譯的機制也不甚了解。近年來，隨著生殖技術(shù)的發(fā)展和研究的進步，這些問題將很快得到解決。我們可以利用單細(xì)胞 RNA-seq 技術(shù)用于轉(zhuǎn)錄組定量分析，獲得細(xì)胞分裂各階段的重要標(biāo)記，并應(yīng)用相關(guān)的技術(shù)手段對早期胚胎發(fā)育過程中關(guān)鍵階段的候選基因進行進一步的研究，以前所未有的廣度和深度探討這一過程中重要的分子事件，這必將為哺乳動物胚胎發(fā)育及生存和繁衍的調(diào)控提供新的理論依據(jù)和技術(shù)支持。