干細(xì)胞ECM修復(fù)軟骨缺損與鹿茸干細(xì)胞ECM的研究進(jìn)展

王玉俗，褚文輝，李久波，趙全民※，李春義

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118；2.臺(tái)州學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，浙江 臺(tái)州 317000；3.長(zhǎng)春市農(nóng)業(yè)機(jī)械研究院，吉林 長(zhǎng)春 130000；4.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物分子生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長(zhǎng)春 130112）

透明軟骨是軟骨的主要類型之一，由軟骨細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)（Extracellular matrix，ECM）所構(gòu)成[1]。關(guān)節(jié)表面軟骨層軟骨細(xì)胞的主要營養(yǎng)來源是關(guān)節(jié)液，由于內(nèi)無血管，只能靠細(xì)胞基質(zhì)滲透完成，再加上軟骨細(xì)胞缺乏遷移能力，不能聚集到創(chuàng)傷部位，因此，關(guān)節(jié)表面軟骨損傷后自身修復(fù)能力受到極大的限制。在關(guān)節(jié)滑膜有病變時(shí)，如機(jī)械損傷導(dǎo)致的骨關(guān)節(jié)炎，關(guān)節(jié)軟骨出現(xiàn)破損；類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，滑液分泌異常失去正常的潤滑作用，摩擦力增大導(dǎo)致軟骨缺損[2]。長(zhǎng)期的軟骨缺損使破損面逐步加大，最終的治療方式為人工關(guān)節(jié)置換。研究表明，美國每年因關(guān)節(jié)炎接受關(guān)節(jié)置換手術(shù)的患者已經(jīng)超過140 萬。我國估計(jì)每年接受關(guān)節(jié)置換的患者約為45 萬[3-4]。因此，旨在減少骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)生，大量的軟骨修復(fù)研究意義重大。

隨著人工合成材料和納米材料的興起，種子細(xì)胞結(jié)合支架材料為軟骨缺損修復(fù)開辟了新時(shí)代[5-6]。研究表明，豬軟骨細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)和聚羥基乙酸（Polyglycolic acids,PGA）支架植入裸鼠皮下可構(gòu)建軟骨組織。試驗(yàn)表明，軟骨細(xì)胞在ECM 中的增殖，黏多糖（Glycosaminoglycan，GAG）和膠原的沉積明顯高于PGA，且均勻地分布在ECM支架中，PGA支架主要在支架外周區(qū)域有沉積[7]。表明ECM 為軟骨形成提供了有利環(huán)境。天然支架ECM 具有高組織相容性并且具有保留細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子和其他功能性蛋白質(zhì)的潛力。

鹿茸組織是一種骨/軟骨復(fù)合物，其軟骨組織中富含血管、多種骨/軟骨生成相關(guān)因子[8]，是一種良好的軟骨修復(fù)材料。但鹿茸價(jià)格昂貴，使用鹿茸組織ECM修復(fù)軟骨缺損不是最佳的選擇。李春義等[9]研究表明，鹿茸的發(fā)生是由鹿茸干細(xì)胞分裂、分化而實(shí)現(xiàn)，即生茸區(qū)骨膜（Anterogenic periosteum，AP）分化為角柄，再由角柄骨膜（Pedicle periosteum，PP）再生出鹿茸。鹿茸干細(xì)胞具有分化出完整的骨、軟骨組織器官的能力，將鹿茸干細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，收集其分泌的ECM，從理論上，ECM可能是軟骨修復(fù)的一個(gè)新的天然生物支架材料。本文就軟骨缺陷修復(fù)進(jìn)行綜述，并對(duì)使用鹿茸干細(xì)胞ECM 修復(fù)軟骨缺陷的初步結(jié)果進(jìn)行總結(jié)。

1 軟骨的結(jié)構(gòu)特征

軟骨主要作用包括承受力學(xué)負(fù)荷，關(guān)節(jié)軟骨能將作用力均勻分布，使承重面擴(kuò)大，保護(hù)關(guān)節(jié)不易損傷；潤滑作用，關(guān)節(jié)軟骨表面光滑，因此關(guān)節(jié)運(yùn)動(dòng)時(shí)不易磨損[10]兩個(gè)方面。軟骨是由軟骨細(xì)胞和ECM 組成，其中，ECM約占總體積的98%，其主要由水、蛋白多糖和膠原組成。膠原的主要成分為Ⅱ型膠原，在軟骨內(nèi)形成網(wǎng)架結(jié)構(gòu)維持形態(tài)和硬度[11]。膠原網(wǎng)架結(jié)構(gòu)內(nèi)由蛋白多糖填充，蛋白多糖中大量帶負(fù)電的陰離子如COO-和SO32-相互排斥并吸引陽離子，從而產(chǎn)生滲透壓，使水進(jìn)入軟骨內(nèi)[12]。硫酸軟骨素等吸附流動(dòng)的水產(chǎn)生摩擦阻力，軟骨承受壓力后引起水在多孔固態(tài)基質(zhì)內(nèi)流動(dòng)，使水起到承重的作用。軟骨細(xì)胞是一種高度分化的細(xì)胞，存在于軟骨陷窩，約占總體積的1%[13]。軟骨中軟骨基質(zhì)蛋白的合成和分泌主要來源于軟骨細(xì)胞。成年人的軟骨細(xì)胞在正常狀態(tài)下不會(huì)發(fā)生分裂，但當(dāng)軟骨在受到病理刺激后會(huì)發(fā)生增殖。膠原纖維與基質(zhì)共同作用使軟骨具有彈性和張力及強(qiáng)度。膠原纖維類似混凝土中的鋼筋，其他基質(zhì)類似混凝土中的水泥。由于軟骨具有這種富含基質(zhì)的組織學(xué)特征，軟骨基質(zhì)受到破壞就意味著軟骨的缺損。

2 間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)軟骨缺損

間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）是組織工程方法中常用的細(xì)胞。這些細(xì)胞具有較高的增殖率和軟骨分化能力，容易從脂肪組織、骨髓和滑膜中收集[14-15]。據(jù)報(bào)道，植入的干細(xì)胞會(huì)釋放生長(zhǎng)因子、生物活性脂質(zhì)和細(xì)胞因子，這些因子具有促進(jìn)軟骨再生和抗炎作用[16-18]。常用于治療軟骨缺損的干細(xì)胞有骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）和脂肪干細(xì)胞（ADSCs）等。

2.1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)軟骨缺損

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Bone mesenchymal stem cells，BMSCs)是組織工程中研究最多的干細(xì)胞，不同的研究均報(bào)道了這些細(xì)胞治療軟骨缺損的潛力，并已經(jīng)在臨床I 期和II 期中得到應(yīng)用[19]。Wakitani 等[20]在40 名膝關(guān)節(jié)缺損患者中使用BMSCs 修復(fù)，并對(duì)患者進(jìn)行11年的隨訪和觀察，臨床治療效果表明，關(guān)節(jié)缺損得到修復(fù)并且在觀察期間未出現(xiàn)腫瘤或發(fā)生感染。證明BMSCs 移植是安全有效的治療方法。Gobbi 等[21]對(duì)37 例關(guān)節(jié)軟骨缺損患者進(jìn)行治療，其中19 例使用自體軟骨移植治療，18 例使用自體BMSCs 治療。結(jié)果表明，5年后自體軟骨移植和BMSCs的治療成功率分別為76%和81%，再生軟骨都為透明軟骨。

2.2 脂肪干細(xì)胞修復(fù)軟骨缺損

脂肪干細(xì)胞（Adipose-derived stem cells，ADSCs）由于其易獲取，并具有與BMSCs 相同的特性，被認(rèn)為是修復(fù)軟骨缺損中BMSCs 的良好替代品[22]。研究表明，ADSCs可產(chǎn)生多種有益的旁分泌因子降低關(guān)節(jié)軟骨中腫瘤壞死因子（TNF-）和基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）的產(chǎn)生，增強(qiáng)軟骨保護(hù)作用[23-24]。Yong-Gon 等[25]對(duì)18 名關(guān)節(jié)缺損患者關(guān)節(jié)內(nèi)注射ADSCs，2年后隨訪發(fā)現(xiàn)患者軟骨缺損得到改善、疼痛感減輕和膝關(guān)節(jié)功能得到改善。

3 ECM修復(fù)軟骨缺損

ECM 是活體組織和器官內(nèi)細(xì)胞分泌的細(xì)胞外產(chǎn)物，其作為細(xì)胞生長(zhǎng)的微環(huán)境，在細(xì)胞黏附、增殖和分化方面都起著重要作用。ECM 主要由膠原蛋白、蛋白聚糖與氨基酸聚糖等多種大分子組成的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[26-27]。ECM 在不同的組織器官中主要成分含量不同。如膠原蛋白種類眾多，其中Ⅱ型膠原蛋白主要由軟骨細(xì)胞產(chǎn)生的，多存在于骨骼、關(guān)節(jié)、肌腱等組織中，Ⅱ型膠原比Ⅰ、Ⅲ型膠原含有更豐富的羥脯氨酸，更適合對(duì)軟骨修復(fù)。Wang 等[28]將從兔和大鼠肌腱和尾部獲得的II 型和I 型膠原混合制成支架，并將兔軟骨細(xì)胞與兔膠原支架和大鼠膠原支架混合植入經(jīng)手術(shù)創(chuàng)建的缺損兔膝關(guān)節(jié)軟骨中，結(jié)果表明，修復(fù)的軟骨細(xì)胞均明顯地成簇排列，修復(fù)軟骨與鄰近的健康組織整合良好。ECM 具有支持組織形態(tài)形成，并且為免疫應(yīng)答提供場(chǎng)所的功能，其在機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育過程中起到重要作用。ECM 支架具有高組織相容性并且具有保留細(xì)胞因子（Cytokine,CK）、生長(zhǎng)因子和其他功能性蛋白質(zhì)的潛力。Schwarz等[29]將軟骨組織脫細(xì)胞得到ECM支架后對(duì)軟骨缺損處進(jìn)行修復(fù)，結(jié)果顯示，ECM 支架在促進(jìn)新生軟骨基質(zhì)合成方面具有明顯優(yōu)勢(shì)。豬小腸黏膜下層（Porcine small intestinal submucosa，SIS）-ECM已被用于重建各種組織，并且取得了良好的臨床效果[30]。但目前的組織ECM 制備過程繁瑣，不適合臨床應(yīng)用。

在抗壞血酸的作用下，干細(xì)胞可分泌大量的膠原，形成細(xì)胞膜片即ECM。體外試驗(yàn)證明，軟骨細(xì)胞通過細(xì)胞培養(yǎng)所得的ECM 支架能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖，并且可以促進(jìn)組織再生[31]。細(xì)胞ECM 支架形成的過程通常分三步：第一步，單層培養(yǎng)細(xì)胞至80%～90%；第二步，添加抗壞血酸促進(jìn)ECM沉積；第三步，收集ECM，去細(xì)胞化，得到ECM 支架。ECM 支架材料，不但能作為生物支架為細(xì)胞的進(jìn)入提供支撐，而且還保留了原組織中生長(zhǎng)因子，移植到活體后組織會(huì)做出自然應(yīng)答。在生物支架材料軟骨修復(fù)過程中，一些重要的生長(zhǎng)因子，如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（Transforming growth factor,TGF）、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（Fibroblast growth factor,FGF）和表皮生長(zhǎng)因子（Epidermal growth factor，EGF）如能保留，可以增強(qiáng)軟骨細(xì)胞的功能并促進(jìn)軟骨細(xì)胞再生[26]。Tang 等[32]使用 BMSCs-ECM 對(duì)兔膝關(guān)節(jié)軟骨缺損進(jìn)行治療，結(jié)果表明，ECM 可以使BMSCs 促進(jìn)缺損部位細(xì)胞增殖，在軟骨分化和基質(zhì)生成中發(fā)揮重要作用。因此，干細(xì)胞ECM 支架制備不僅簡(jiǎn)單，而且可以更好地使細(xì)胞附著，有可能成為臨床上具有廣闊前景的軟骨修復(fù)材料。

4 鹿茸干細(xì)胞ECM的初步研究和應(yīng)用前景

4.1 鹿茸的再生與鹿茸干細(xì)胞

鹿茸作為唯一能夠完全再生的哺乳動(dòng)物附屬器官，可以作為眾多再生研究的理想模型，同時(shí)也為我們揭示自然界哺乳動(dòng)物復(fù)雜器官完全再生的問題提供一個(gè)理想的生物模型[33-34]。鹿茸不是直接從鹿頭上長(zhǎng)出來的，而是由鹿頭部的角柄生長(zhǎng)出來的附屬器官，角柄也不是與生俱來的，是鹿將要進(jìn)入青春期時(shí)才開始萌發(fā)，生長(zhǎng)到一定高度（梅花鹿、赤鹿為5～6 cm）時(shí)，角柄頂端開始出現(xiàn)稀疏的毛發(fā)，并具有光澤，預(yù)示著初角茸已經(jīng)開始發(fā)生[34]。然后鹿茸出現(xiàn)快速生長(zhǎng)并逐漸成熟，再生的鹿茸生長(zhǎng)非?？欤好坊沟乃俣饶苓_(dá)12.5 mm/d，馬鹿的可達(dá)27.5 mm/d；秋天到來時(shí)，鹿茸逐漸骨化，茸皮脫落，變成骨化的鹿角[35-36]。

組織學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，在鹿角脫落前期，角柄遠(yuǎn)端部分變得粗糙，且血管化明顯，可以將死去的鹿角和活組織角柄區(qū)分開來。鹿角一旦脫落，角柄殘樁遠(yuǎn)端的皮膚隨即生長(zhǎng)并向內(nèi)遷移，逐漸覆蓋角柄斷面。隨即PP 組織也開始增厚，PP細(xì)胞分裂繁殖形成2 個(gè)新月形的生長(zhǎng)中心。一個(gè)在前部，形成鹿茸的眉枝，另一個(gè)在后部形成鹿茸的主干。其內(nèi)部是新生的含有血管的軟骨組織，軟骨組織上覆蓋著一層增生的間質(zhì)細(xì)胞[37]。

研究表明，PP 是驅(qū)動(dòng)鹿茸再生的組織基礎(chǔ)；青春期公鹿的額外脊AP組織是角柄和初角茸生成的組織基礎(chǔ)。AP 組織的發(fā)現(xiàn)揭示了鹿茸發(fā)生的秘密。于是設(shè)計(jì)試驗(yàn)將AP 移植到鹿身體的其他部位，如前額可以在移植處形成完整的異位鹿茸，并且擁有和正常鹿茸一樣周期性再生的能力。所以AP 組織是角柄和初角茸發(fā)生的關(guān)鍵組織[38]。

基于 AP 和 PP 的獨(dú)特性，Li 等[39]對(duì)這 2 種細(xì)胞做了進(jìn)一步研究，發(fā)現(xiàn)這2 種細(xì)胞都表達(dá)了胚胎干細(xì)胞標(biāo)記物Oct4、Sox2、Nanog、CD9。離體條件下可以誘導(dǎo)分化成軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞。確定AP 與PP 細(xì)胞都是鹿茸干細(xì)胞，AP 細(xì)胞（APC）是鹿茸發(fā)生的干細(xì)胞，PP細(xì)胞（PPC）是鹿茸再生的干細(xì)胞。

4.2 鹿茸干細(xì)胞ECM在修復(fù)軟骨缺損中的初步研究

我們用大鼠進(jìn)行關(guān)節(jié)軟骨缺損修復(fù)試驗(yàn)研究，將大鼠膝關(guān)節(jié)造成直徑2 mm、深2 mm 的軟骨缺損，然后隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)和對(duì)照2 個(gè)組，對(duì)照組大鼠不進(jìn)行任何治療，實(shí)驗(yàn)組將APC-ECM 填充到軟骨缺損處。12周后分別取樣做組織染色觀察，所得結(jié)果如圖1 所示，12周時(shí)對(duì)照組沒有出現(xiàn)軟骨修復(fù)的跡象，缺損處明顯，軟骨下骨由纖維組織填充修復(fù)；實(shí)驗(yàn)組APC-ECM 中有軟骨細(xì)胞產(chǎn)生，缺損部分修復(fù)的軟骨和邊緣的正常軟骨結(jié)合良好，修復(fù)的軟骨厚度與正常軟骨厚度一樣，表面光滑平整，軟骨下骨修復(fù)與正常軟骨相似。

圖1 手術(shù)后12 周大鼠關(guān)節(jié)軟骨缺損修復(fù)Fig.1 Repairation of articular cartilage defect in rats 12 W after operation

4.3 鹿茸干細(xì)胞ECM應(yīng)用前景

鹿茸中富含各種促進(jìn)骨/軟骨生長(zhǎng)的細(xì)胞因子和功能蛋白。胰島素樣生長(zhǎng)因子（Insulin-like growth factor，IGF）是一類鹿茸軟骨生長(zhǎng)調(diào)控因子。鹿茸頂端非骨化區(qū)富含IGF受體，并且從上至下mRNA的表達(dá)量逐漸減少[40]。TGF 在鹿茸骨膜細(xì)胞向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化、細(xì)胞外基質(zhì)合成以及形成新骨等方面具有明顯的促進(jìn)作用[41-42]。在各種細(xì)胞因子和功能蛋白的作用下，鹿茸干細(xì)胞分裂，分化生成完整的鹿茸組織。使用鹿茸干細(xì)胞作為種子細(xì)胞培養(yǎng)分泌的ECM 其中保留大量的促進(jìn)軟骨生長(zhǎng)的細(xì)胞因子，為軟骨修復(fù)提供了一個(gè)新的可能性。

5 展望

使用干細(xì)胞修復(fù)軟骨缺損的想法早有提出并已實(shí)施，但將鹿茸干細(xì)胞用于修復(fù)軟骨缺損的研究鮮有報(bào)道。經(jīng)過我們的研究已經(jīng)初步證明鹿茸干細(xì)胞 ECM修復(fù)軟骨缺損的效果良好。鹿茸干細(xì)胞有衍生出完整鹿茸的能力，其可以分泌大量的促進(jìn)軟骨生長(zhǎng)的細(xì)胞因子和功能蛋白。通過培養(yǎng)誘導(dǎo)鹿茸干細(xì)胞分泌ECM保留其中促軟骨生長(zhǎng)的細(xì)胞因子和功能蛋白，并且有效避免病原體傳播、炎癥等免疫反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)，將為軟骨修復(fù)提供參考。