外泌體在心肌缺血及房顫診治中的應用前景研究進展

倪瀚文，吳立群

（上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院心臟內(nèi)科，上海 200025）

外泌體是細胞外囊泡的一種亞群，其包含了大量的生物活性物質(zhì)，在細胞信號轉(zhuǎn)導過程中發(fā)揮著重要作用，如信號在不同細胞之間進行轉(zhuǎn)導能維持組織內(nèi)環(huán)境恒定以及作出應激反應。心血管系統(tǒng)作為一個復雜的、由多種細胞組成的系統(tǒng)，外泌體在心肌細胞間充當信號轉(zhuǎn)導分子。前期外泌體相關研究較多集中于腫瘤的發(fā)病機制、診斷及治療，而近年外泌體在心血管系統(tǒng)中的作用越來越受到重視。目前，關于外泌體在心血管疾病中的研究已獲得了較多進展，尤其在診斷和治療方面進展突出，提示外泌體可能是今后治療心血管疾病的潛在方向。心肌缺血及心房顫動（atrial fibrillation，AF）是臨床常見的心血管疾病，近年關于外泌體在其診治中的應用研究進展較快，本文將就當前的相關研究熱點作一綜述。

外泌體的組成及生理作用

一、外泌體的成分及來源

外泌體作為細胞外囊泡的一種，其直徑為30～150 nm，可由不同類型的細胞釋放[1]。外泌體可以在血漿、血清、唾液、羊水、母乳和尿液等多種體液中存在，而其在體外細胞培養(yǎng)液中也同樣存在。外泌體富含各種生物活性物質(zhì)，包括DNA、mRNA、微小RNA（microRNA,miRNA）、長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA,lncRNA）和蛋白質(zhì)，當這些生物活性物質(zhì)隨外泌體一起被轉(zhuǎn)運的時候，外泌體及其包裹的活性物質(zhì)成為了細胞間的信號轉(zhuǎn)導物質(zhì)。

外泌體來自于內(nèi)涵體內(nèi)吞形成的多囊泡體，隨后多囊泡體與細胞膜融合后被分泌至細胞外[2]。外泌體內(nèi)的組成成分依賴于所來源的細胞類型，同時這些成分也很在大程度上反映了來源細胞的生理和病理狀態(tài)，提示外泌體的分泌、包含物及功能與其來源的細胞微環(huán)境改變密切相關。目前，尚不清楚外泌體是如何選擇其包含物組成成分的，但這些組成成分相對固定，即使被分泌到細胞外，也不會降解。

二、外泌體的生理作用

外泌體除了進入鄰近的靶細胞外，還可以隨著體液進入較遠區(qū)域的靶細胞；外泌體依據(jù)自身的細胞來源、靶細胞特點、環(huán)境特點，可通過內(nèi)吞、膜的融合、配體受體結(jié)合等方式，識別靶細胞并進入靶細胞[3-4]。因此，外泌體可作為一個在不同生理、病理機制下的信號轉(zhuǎn)導物、診斷標志物以及潛在的治療靶點，已成為一個新的研究方向。

心血管系統(tǒng)作為一個多種細胞組成的組織，外泌體可以在不同的細胞間進行信號轉(zhuǎn)導，以維持正常心血管生理狀態(tài)的穩(wěn)定，但外泌體同時也在一系列的心血管生理、病理過程中起著重要作用[4]。研究提示，外泌體不僅參與多種心血管生理、病理過程，且比細胞具有更顯著的穩(wěn)定性、生物相容性和非免疫原性。外泌體具有在低溫保存過程中不容易降解等特點，使其成為一個比全細胞治療更有效的、全新的診斷和治療方向[5]。

外泌體在心血管疾病狀態(tài)下的變化及其在診斷中的應用

心臟各細胞釋放外泌體至體液中，因此外泌體具備了作為心臟疾病生物學標志物的可能性。心血管疾病患者外周血循環(huán)中的外泌體有2 種來源，其一是來自于心臟各細胞，另外是來自于疾病情況下全身各細胞釋放的外泌體。目前，這2 種外泌體在外周血中尚不能被區(qū)分，但在不同的心血管疾病狀態(tài)下，其表達的數(shù)量和所包含的成分都會不同，可作為疾病變化的標志物進行研究。研究發(fā)現(xiàn)，在心血管疾病狀態(tài)下，尤其是應激情況下，如在衰老和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激時，外周血外泌體的數(shù)量會增加，但目前其機制尚未明確[6]。

來自不同心臟細胞的外泌體，其包含物的作用主要是參與調(diào)節(jié)心臟細胞的功能。心臟大部分由心肌細胞組成，其他的非心肌細胞包括心肌成纖維細胞、連接心肌細胞和成纖維細胞的心肌內(nèi)皮細胞，其中內(nèi)皮細胞在維持心臟內(nèi)環(huán)境恒定中起重要作用。外泌體作為信號轉(zhuǎn)導物質(zhì)在心肌細胞、心肌成纖維細胞以及內(nèi)皮細胞之間進行信息傳遞。

一、來自心肌細胞的外泌體

1.蛋白質(zhì)組學：在動物模型的研究中發(fā)現(xiàn)，心肌細胞能夠釋放外泌體，且在缺氧刺激后，外泌體釋放增加，其標志性包含物熱休克蛋白60（heat shock protein 60,HSP60）在應激的條件下增加。研究對缺氧刺激下由心肌細胞產(chǎn)生的外泌體進行了蛋白質(zhì)組學分析，發(fā)現(xiàn)其蛋白質(zhì)組成成分與生理條件下相同，但其蛋白質(zhì)的量發(fā)生了改變。在這個蛋白質(zhì)組中包括了HSP60、原肌球蛋白α、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、球蛋白、肌球蛋白結(jié)合蛋白C、含纈酪肽蛋白以及HSP27、HSP90[7]。其他研究表明，缺氧刺激會導致細胞凋亡的發(fā)生，因此，凋亡相關的腫瘤壞死因子α 同樣會出現(xiàn)在心肌細胞外泌體中[8]。

2.miRNA：在各種心血管疾病條件下，除外泌體中蛋白質(zhì)組學的改變外，miRNA-30a、miR-21-5p、miR-378-3p、miR-152-3p 等也有非常顯著的改變[9]。有實驗表明，心肌細胞分泌的外泌體可被心肌成纖維細胞或內(nèi)皮細胞內(nèi)吞，從而改變成纖維細胞和內(nèi)皮細胞的生物學行為[10]。例如，心肌細胞分泌的外泌體中的DNA 可出現(xiàn)在成纖維細胞中，促進成纖維細胞的基因表達[11]。心肌纖維化是心肌細胞受到長期損傷導致心臟功能受損的原因之一。動物實驗表明，心肌細胞分泌的外泌體中所包含的miR-217 被成纖維細胞所吞噬，可加速心肌纖維化[10]。

二、來自心肌成纖維細胞的外泌體

心肌成纖維細胞與細胞外基質(zhì)（extracellular matrix,ECM）的轉(zhuǎn)變有關，心肌成纖維細胞的分泌特性可以影響心肌其他細胞的生理活性。心肌成纖維細胞外泌體蛋白質(zhì)組學的動物模型研究表明，在缺氧條件下，蛋白質(zhì)的組成和數(shù)量都有改變，尤其會出現(xiàn)與ECM 有關的蛋白質(zhì)改變，包括多種類型的膠原蛋白、基底膜蛋白多糖及纖維連接蛋白等；同時也伴有線粒體蛋白的改變[12]。

心肌成纖維細胞分泌的外泌體中同樣包含了miRNA。大鼠實驗研究表明，心肌成纖維細胞分泌的外泌體富含rnomiR-21*，而外泌體將rno-miR-21* 轉(zhuǎn)運到心肌細胞，可導致心肌細胞肥大[12]。研究顯示，心肌成纖維細胞分泌的外泌體是連接心肌成纖維細胞與心肌細胞之間的重要橋梁。

三、來自內(nèi)皮細胞的外泌體

心臟微血管系統(tǒng)是維持心臟健康和心臟組織恒定的重要因素，心臟內(nèi)皮細胞是血管與組織周圍之間的內(nèi)皮屏障，尤其在炎癥、缺氧等應激狀態(tài)下，內(nèi)皮細胞在維持心臟組織功能恒定中起著重要作用，其不僅釋放了生長因子、細胞因子，還釋放了外泌體以介導細胞間的信號轉(zhuǎn)導[13]。

四、臨床診斷應用

1.外泌體中的miRNA： 外周血外泌體中包含的miRNA、lncRNA、蛋白質(zhì)等在心血管疾病的研究中都有所報道。外周血外泌體中的miRNA 是心血管疾病主要的研究對象，在不同病理狀態(tài)下，外泌體中包含物miRNA 的量會發(fā)生改變，提示其可作為診斷心血管疾病的標志物。例如，血清外泌體hsa-miR-1、hsa-miR-133a 在急性冠脈綜合征 （acute coronary syndrome,ACS）中會升高。在急癥中，ACS 需要與急性心肌梗死（acute myocardial infarction,AMI）區(qū)別，經(jīng)典的AMI 診斷標志物是肌鈣蛋白和肌酸激酶MB，肌鈣蛋白的峰值在心肌損傷后12 h 達到最高峰，且其水平與梗死面積成正比。相關研究發(fā)現(xiàn)，血漿外泌體中包含的miRNA 會在AMI 患者中出現(xiàn)，而且它們要比肌鈣蛋白更早達到峰值，其中hsa-miR-192、hsa-miR-194 以及hsa-miR-34a 存在外周血的外泌體中，在AMI 伴有1 年內(nèi)心力衰竭患者的血清中升高，提示其可能是潛在的診斷標志物[14]。在風濕性心臟病患者外周血的外泌體中，miRNA 及l(fā)ncRNA 的表達發(fā)生變化，研究進一步鑒定發(fā)現(xiàn)，其中5個相關的lncRNA 發(fā)生改變，且對應的基因與風濕性心臟疾病發(fā)生間有密切的關系[15]。

2.外泌體中的蛋白質(zhì)： 關于心血管疾病外周血外泌體蛋白質(zhì)組學的分析鮮見報道，只有Cheow 等[16]鑒定了一些新的蛋白質(zhì)可以作為心肌損傷的標志物，這些蛋白質(zhì)分別屬于補體系統(tǒng) （C1Q1A、C5）、脂蛋白代謝 [載脂蛋白D（apolipoprotein D，ApoD）和載脂蛋白C3（apolipoprotein C3，ApoC3）]以及血小板激活途徑（血小板膜糖蛋白Ⅰb α 多肽和前血小板堿性蛋白）。

這些心血管疾病外周血外泌體的研究成果，無論是外周血外泌體數(shù)量的改變，還是外泌體包含物的改變，都是發(fā)掘潛在生物學標志物的基礎。這些發(fā)現(xiàn)可應用于心臟疾病的個體化診斷和預后檢測，是目前心血管疾病外泌體研究中一個比較可行的方向。

外泌體在心肌缺血及AF 診治中的應用

外泌體作為一個治療方法已經(jīng)成為心血管疾病治療的一個方向。外泌體具有的特點包括無免疫原性、非致瘤性、比細胞更穩(wěn)定的生理活性、參與全身循環(huán)、可透過血腦屏障，更適合作為承載治療成分的載體，且其比細胞更適合凍融、易于儲存。這些特點使得外泌體成為疾病治療的一個方向[5]，無論在腫瘤治療或者心血管疾病的治療中，相關研究成果日益增多[17]。無論是在體液循環(huán)中的外泌體，還是由心臟細胞釋放的外泌體，都參與了心臟應對應激而產(chǎn)生的重塑過程。

從干細胞釋放的外泌體歷來被認為在心臟疾病中具有保護心肌細胞和促進再生的功能，因此利用干細胞體外培養(yǎng)液中收集的外泌體對心臟疾病進行治療，已成為目前研究外泌體治療方法的主流趨勢。在研究干細胞治療心臟疾病的實驗中發(fā)現(xiàn)，外泌體具有與干細胞同樣的治療效果，由于采用干細胞治療心臟疾病具有爭議，如認為干細胞并不附著于心肌，因此，作為心臟細胞間信號轉(zhuǎn)導物的外泌體，在心臟修復和重塑中可能起了更重要的作用。

最新的治療研究成果顯示，在阿霉素造成的心肌損傷中會伴隨產(chǎn)生炎癥性凋亡，而用干細胞、干細胞分泌的外泌體進行動物實驗治療后，干細胞和干細胞分泌的外泌體都可以提高抗炎癥因子的表達，抑制細胞質(zhì)空泡化、肌原纖維丟失、細胞肥大，最終達到提高心肌功能的目的[17]。由此可見，阿霉素誘導產(chǎn)生的心肌炎癥性凋亡和心臟重塑可以被干細胞及干細胞分泌的外泌體所改善。

一、心肌缺血損傷

為了避免干細胞治療相關的爭議，有研究利用在外周循環(huán)中存在的外泌體對心血管疾病進行治療，認為從各組織釋放的循環(huán)外泌體對心臟也有重要的作用。在ST 段抬高性AMI 中的心肌細胞缺血再灌注過程中，循環(huán)細胞、細胞因子、微小囊泡和外泌體都起著重要作用。研究結(jié)果表明，血液循環(huán)中的微小囊泡和外泌體能夠?qū)θ毖俟嘧l(fā)揮有利的影響作用，其機制為外泌體包裹了miRNA 運輸?shù)叫呐K，減少了心肌細胞缺血再灌注的損傷[18]。由此可見，外周血循環(huán)外泌體中的miRNA 不僅可以作為一個診斷標志物，同時也可以作為一個有效的治療方法，以非心肌細胞方式保護了心臟免受損傷及參與了修復過程。

關于外泌體注射入體內(nèi)的方法，常見的是心肌內(nèi)和冠狀動脈內(nèi)注射，而經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)，外泌體心肌注射比冠狀動脈內(nèi)注射更有效[19]。除了利用干細胞和外周循環(huán)產(chǎn)生的外泌體，還有實驗利用人工的方法合成外泌體進行治療，使得其外泌體具有一定的靶向性。有研究者設計了1個肽序列CSTSMLKAC，稱為缺血心肌靶向肽，發(fā)現(xiàn)其對心臟缺血區(qū)域具有靶向性。Wang 等[20]人工設計了外泌體表面，使外泌體的內(nèi)含物可以靶向釋放到心肌組織中。體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn)，經(jīng)缺血心肌靶向肽修飾的人工外泌體可以靶向治療心肌缺血，使心臟功能得到顯著改善。

外泌體在真正成為治療心血管疾病方法之前，從實驗室研究、動物實驗過渡到臨床應用還有很多研究工作要做，其中標準化分離、鑒定外泌體、外泌體中的成分、外泌體的靶向性等都是目前急需解決的問題。

二、AF

AF 是臨床上最常見的慢性心律失常疾病，其發(fā)病與離子通道改變、電生理變化密切相關。鉀離子通道相關基因的突變和異位興奮灶的發(fā)生及其所導致的鉀通道、鈣通道異常[21]，通常被認為是AF 發(fā)生的主要原因，同時心房基質(zhì)的改變、心房纖維化及心房擴大也與AF 的發(fā)生密切相關。盡管目前已有了多種假說，但關于AF 發(fā)生、發(fā)展的機制仍有待進一步研究[22]。

1.預測AF 的發(fā)生：最近研究表明，外泌體介導的心肌細胞間信號轉(zhuǎn)導是心肌纖維化改變、心臟疾病發(fā)生的關鍵因素[12]。心肌纖維化在心臟修復中起到了關鍵作用。有研究發(fā)現(xiàn)，心肌細胞在缺血、缺氧情況下產(chǎn)生的外泌體促進了心肌的纖維化，損傷的上皮細胞分泌了富含促纖維化因子外泌體，導致纖維化的發(fā)生[23]。外泌體中包含的多種miRNA 被認為與調(diào)節(jié)成纖維細胞增殖、分化及纖維化形成密切相關[24]，包括miR-21、miR-425、miR-744、miR-208a 等。外泌體中包含的多種miRNA 也是心肌纖維化的標志物。在發(fā)生心肌缺血時，這些外周血外泌體中的miRNA 會比肌鈣蛋白或者其他標志物更早出現(xiàn)[25]。盡管目前未有直接研究表明AF 中心肌纖維化與外泌體之間的關系，但由于AF 與心肌纖維化之間密切相關，這些研究結(jié)果為進一步研究AF 發(fā)生、發(fā)展的機制打下了基礎。

2.評估AF 嚴重程度：在AF 研究中，有研究分析了外周循環(huán)外泌體在AF 患者中的水平以及可能的來源細胞器官。研究提示，AF 患者血循環(huán)中的外泌體量顯著升高，如果伴隨著血小板的激活和內(nèi)皮的損傷，血小板來源的外泌體以及內(nèi)皮細胞來源的外泌體量都會升高[26]。對AF 患者血清外泌體miRNA 進行研究，發(fā)現(xiàn)5 種miRNA（miRNA-103a、miRNA-107、miRNA-320d、miRNA-486、let-7b） 在持續(xù)性AF患者中顯著升高，提示這5 種miRNA 與心房的功能、結(jié)構(gòu)、氧化應激以及纖維化有關，是潛在的監(jiān)測AF 過程的生物學標志物[27]。同樣，有研究比較了AF 患者與竇性心律對照者血漿外泌體中miRNA 的差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)血漿外泌體中miR-483-5p、miR-142-5p、miR-223-3p 與AF 相關，這可能是將來評估AF 嚴重程度、預后以及治療方案選擇的一個指標[28]。

基于AF 動物模型的研究發(fā)現(xiàn)，miRNA 在心肌凋亡、心肌纖維化生成中起重要作用，將誘導產(chǎn)生AF 后的動物模型心肌細胞進行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)AF 發(fā)生后的心肌細胞與細胞凋亡、細胞活力降低密切相關，同時miR-320d 表達水平降低；而導入miR-320d 后，會使心肌細胞中的miR-320d、心肌細胞分泌的外泌體升高，逆轉(zhuǎn)AF 導致的心肌損傷。因此，miR-320d 與AF 造成的心肌細胞凋亡及細胞活力降低密切相關，同時，其與外泌體的生成有關，miR-320d 在AF 動物模型中可誘導外泌體分泌的增加，這為將來嘗試采用外泌體治療AF 提供了一個新方向[29]。

外泌體中的lncRNA 也成為了AF 疾病中的研究對象。心外膜脂肪組織在AF 病理中充當了重要角色，有研究對心外膜脂肪組織的外泌體lncRNA 進行了分析，發(fā)現(xiàn)有57個lncRNA 發(fā)生了顯著變化，這些lncRNA 與代謝過程及應激反應過程相關[29]。

在AF 的研究中，針對外周全血、血漿及外泌體中的線粒體DNA 進行了探討，結(jié)果發(fā)現(xiàn)外周全血、血漿及外泌體中提取到了一定數(shù)量的線粒體DNA，但在AF 疾病組與正常組之間的差異無統(tǒng)計學意義。盡管有報道顯示，外周血中的線粒體DNA 與氧化應激及心血管疾病有關，但目前在AF 中并沒有發(fā)現(xiàn)這種相關性。

小結(jié)

外泌體在心血管疾病中，尤其在心肌缺血與AF 中的研究目前尚處于起步階段，盡管這是一個與心臟電生理變化密切相關的疾病，但是基于外泌體在心血管疾病研究成果的積累，在AF 研究外泌體的作用機制、診斷及治療作用也是一個值得期待的方向。