肥大細(xì)胞特異性受體介導(dǎo)神經(jīng)源性炎癥和疼痛

1.研究背景

肥大細(xì)胞是炎癥反應(yīng)過程中的關(guān)鍵效應(yīng)細(xì)胞之一，是連接神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)的重要紐帶，參與了術(shù)后疼痛、關(guān)節(jié)炎等多種病理過程。肥大細(xì)胞相對(duì)于其他天然免疫細(xì)胞具有顯著的空間優(yōu)勢(shì)，可以更加靠近周圍神經(jīng)末梢的地方，是最先對(duì)感覺神經(jīng)纖維激活做出反應(yīng)的細(xì)胞之一。通過神經(jīng)肽激活后的肥大細(xì)胞可以釋放多種“促炎細(xì)胞因子”和“趨化因子”，參與招募多種天然免疫細(xì)胞，進(jìn)一步促進(jìn)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)和外周感覺傳入的致敏。Mrgprs是一類G-蛋白偶聯(lián)受體，主要在外周感覺神經(jīng)元上，在疼痛和瘙癢形成中扮演重要作用；Mrgprb2 (Mas-related G-protein coupled receptor member B2)

作為該家族中的一員，選擇性地表達(dá)在結(jié)締組織中的肥大細(xì)胞上，能夠被多種基礎(chǔ)促分泌物激活；Mrgprb2 基因敲除并不影響經(jīng)典的IgE 激活的肥大細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)，許多肽能藥物激活Mrgprb2 后引起肥大細(xì)胞促炎因子釋放，產(chǎn)生炎性反應(yīng)和疼痛。作者在該研究中就Mrgprb2 參與炎性誘導(dǎo)反應(yīng)、促進(jìn)免疫細(xì)胞招募以及多肽類物質(zhì)（包括P 物質(zhì)）激活Mrgprb2 誘導(dǎo)肥大細(xì)胞釋放細(xì)胞因子和趨化因子的機(jī)制等問題進(jìn)行了研究。

2.研究結(jié)果

（1）在炎性疼痛模型中，Mrgprb2-/-小鼠表現(xiàn)出對(duì)炎癥誘導(dǎo)的超敏反應(yīng)降低

在手術(shù)切口損傷小鼠模型中，Mrgprb2 基因敲除 (Mrgprb2-/-) 小鼠與野生型小鼠 (WT) 相比，術(shù)后24 h后其熱痛覺和機(jī)械痛敏感性以及損傷部位腫脹程度均明顯減少；用白喉毒素 (DTX) 處理Mrgprb2Cre/DTX小鼠選擇性剔除Mrgprb2+陽(yáng)性肥大細(xì)胞后，小鼠在機(jī)械痛和熱痛覺過敏反應(yīng)上均明顯低于野生小鼠；以轉(zhuǎn)錄激活因子 (ATF3) 在背根神經(jīng)節(jié)(DRG) L4和L5的激活情況作為DRG 神經(jīng)損傷的標(biāo)志觀察手術(shù)對(duì)神經(jīng)損傷的影響，在手術(shù)后24 h，Mrgprb2-/-小鼠比WT 小鼠神經(jīng)損傷程度明顯降低；說明Mrgprb2 參與了術(shù)后導(dǎo)致的痛覺過敏。

（2）在術(shù)后炎癥和疼痛模型中，肥大細(xì)胞上的Mrgprb2 受體參與了免疫細(xì)胞的招募

為了便于觀察肥大細(xì)胞的分布特性，使用Mrgprb2cre小鼠與tdTomato 報(bào)告基因小鼠交配獲得的BAC 子代小鼠，子代小鼠中的肥大細(xì)胞被熒光標(biāo)記，比較了WT 小鼠和BAC 小鼠術(shù)后24 h 肥大細(xì)胞在后腳掌切口部位的積聚情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種小鼠在肥大細(xì)胞的數(shù)量上無(wú)明顯區(qū)別；另外，為了研究Mrgprb2 是否影響肥大細(xì)胞在炎癥中參與天然免疫細(xì)胞的募集，研究者分析了術(shù)后WT 小鼠和Mrgprb2-/-小鼠中CD45+細(xì)胞的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Mrgprb2-/-小鼠中CD45+細(xì)胞增加的數(shù)量明顯少于WT 小鼠，在中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)了相同的免疫細(xì)胞募集現(xiàn)象，說明肥大細(xì)胞在招募免疫細(xì)胞中起到重要作用，且Mrgprb2 是招募的主要驅(qū)動(dòng)力，并參與了小鼠術(shù)后炎性疼痛的調(diào)節(jié)。

（3）P 物質(zhì)通過激活Mrgprb2 促進(jìn)天然免疫細(xì)胞的募集

臨床上，手術(shù)后P 物質(zhì)水平會(huì)伴隨急性疼痛強(qiáng)度增加而升高，有研究表明P 物質(zhì)是Mrgprb2 的內(nèi)源性激動(dòng)劑。為了研究P 物質(zhì)對(duì)天然免疫細(xì)胞招募的影響，研究者選擇了Mrgprb2-/-小鼠、NK-1R 基因敲除(NK-1R-/-) 小鼠和WT 小鼠，比較了在后腳掌注射P 物質(zhì)后天然免疫細(xì)胞招募的情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：P 物質(zhì)注射24 h 后，Mrgprb2-/-小鼠中CD45+細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞明顯少于WT 小鼠，而NK-1R-/-小鼠和WT 小鼠中的這幾類免疫細(xì)胞數(shù)量幾乎沒有變化。說明P 物質(zhì)誘導(dǎo)天然免疫細(xì)胞（包括CD45+細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞）招募與Mrgprb2 密切相關(guān)，而與P 物質(zhì)的經(jīng)典受體（神經(jīng)激肽受體-1，NK-1R）無(wú)關(guān)。為了澄清P 物質(zhì)誘導(dǎo)天然免疫細(xì)胞招募在兩款基因敲除小鼠 (Mrgprb2-/-andNK-1R-/-) 存在差異的原因，又使用NK-1R GFP小鼠檢查了NK-1R 的分布特點(diǎn)，結(jié)合RT-PCR 分析，發(fā)現(xiàn)與特異性表達(dá)在肥大細(xì)胞上的Mrgprb2 不同，NK-1R 特異性表達(dá)在脊髓而不表達(dá)于肥大細(xì)胞或初級(jí)感覺神經(jīng)元；術(shù)前注射P 物質(zhì)抗體可以逆轉(zhuǎn)術(shù)后損傷引起的天然免疫細(xì)胞募集以及損傷部位的腫脹，即阻止P 物質(zhì)的釋放可以緩解術(shù)后的炎癥和疼痛的程度；因此，研究者提出P 物質(zhì)通過激活Mrgprb2 而非NK-1R 來(lái)促進(jìn)天然免疫細(xì)胞的募集，參與和調(diào)節(jié)術(shù)后的炎癥和疼痛。

（4）P 物質(zhì)通過激活人類肥大細(xì)胞上MRGPRX2 受體釋放炎性細(xì)胞因子和趨化因子

人類肥大細(xì)胞上MRGPRX2 基因與小鼠的Mrgprb2 基因是同源基因，為了驗(yàn)證人類肥大細(xì)胞上MRGPRX2 基因的功能，研究者選用了人肥大細(xì)胞系—LAD2 細(xì)胞，研究了P 物質(zhì)對(duì)LAD2 細(xì)胞的影響，P 物質(zhì)處理后檢測(cè)收集到的上清液，通過檢測(cè)人類常見的細(xì)胞因子和趨化因子后（細(xì)胞因子：IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-17A、IFN-γ、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GMCSF) 等；趨化因子：CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CXCL10、CXCL11、CXCL9、嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子、CCL17、CCL22 和CXCL1 等），發(fā)現(xiàn)P 物質(zhì)刺激后僅誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子TNF-α、GM-CSF 和IL-8 的表達(dá)以及趨化因子CCL2、CCL3 和CCL4 的升高；在MRGPRX2 基因敲除的LAD2 細(xì)胞中，上述6 種細(xì)胞因子和趨化因子的增量均顯著降低；以觀察到P 物質(zhì)誘導(dǎo)的增量最大的趨化因子CCL2 和CCL3為標(biāo)準(zhǔn)，在術(shù)后模型和P 物質(zhì)誘導(dǎo)的模型中，發(fā)現(xiàn)Mrgprb2-/-小鼠的CCL2、CCL3 釋放量明顯低于WT小鼠；進(jìn)一步用強(qiáng)效NK-1R 拮抗劑SR140333 預(yù)處理LAD2 肥大細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)P 物質(zhì)誘導(dǎo)的肥大細(xì)胞釋放的炎性細(xì)胞因子和趨化因子含量沒有顯著改變，說明P物質(zhì)激活人類肥大細(xì)胞釋放炎性細(xì)胞因子和趨化因子是通過MRGPRX2 而非NK-1R。

3.討論

作者在此研究中提出肥大細(xì)胞特異性受體Mrgprb2 是神經(jīng)肽誘導(dǎo)免疫細(xì)胞募集的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因子。盡管術(shù)后損傷模型在TRP 通道表達(dá)和傳入神經(jīng)激活方面與CFA 模型不同，但其更強(qiáng)的臨床相關(guān)性，適合作為疼痛機(jī)理研究的主要模型。使用術(shù)后損傷模型進(jìn)行研究后，發(fā)現(xiàn)與CFA 模型中一致，Mrgprb2-/-小鼠的機(jī)械痛覺和熱痛覺過敏現(xiàn)象均降低，表明損傷引起炎癥后激活Mrgprb2+陽(yáng)性肥大細(xì)胞都有類似的機(jī)制。

將Mrgprb2cre小鼠與tdTomato 報(bào)告基因小鼠交配獲得的BAC 子代小鼠與WT 小鼠在術(shù)后24 h 相比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種動(dòng)物在損傷部位肥大細(xì)胞的數(shù)量上無(wú)顯著差異，說明這兩款小鼠在術(shù)后損傷炎性痛過程中與肥大細(xì)胞的數(shù)量無(wú)關(guān)。然而，作者觀察到術(shù)后損傷后，Mrgprb2-/-小鼠損傷部位肥大細(xì)胞數(shù)量的增量明顯低于WT 小鼠，且肥大細(xì)胞數(shù)量上升現(xiàn)象在24 h 后又消失，提示Mrgprb2 與肥大細(xì)胞的遷徙密切相關(guān)，并且此種遷移并非由IgE 介導(dǎo)，但導(dǎo)致?lián)p傷部位肥大細(xì)胞局部增生的原因還需要進(jìn)一步研究。除肥大細(xì)胞外，Mrgprb2 對(duì)其他免疫細(xì)胞的募集也有影響，作者研究了WT 小鼠與Mrgprb2-/-小鼠術(shù)前和術(shù)后CD45+細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞數(shù)量的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這兩種小鼠術(shù)前的這些免疫細(xì)胞沒有顯著區(qū)別，然而術(shù)后損傷，Mrgprb2-/-小鼠損傷部位免疫細(xì)胞數(shù)量的增量明顯低于WT 小鼠。由于中性粒細(xì)胞、骨髓細(xì)胞中的單核細(xì)胞參與了免疫細(xì)胞的募集和術(shù)后引起的炎癥疼痛，如果Mrgprb2 促進(jìn)單核細(xì)胞募集是術(shù)后損傷炎性痛的主要驅(qū)動(dòng)力，則需要進(jìn)一步研究損傷后Mrgprb2 參與中性粒細(xì)胞在募集中的作用。然而，作者觀察到Mrgprb2-/-小鼠術(shù)后損傷Mrgprb2 介導(dǎo)兩種細(xì)胞的募集均減少，說明在組織損傷反應(yīng)中，Mrgprb2 是免疫細(xì)胞募集的關(guān)鍵因子。

P 物質(zhì)在疼痛和炎癥中起到的作用推動(dòng)了過去三十年內(nèi)多種NK-1R 相關(guān)藥品的研發(fā)，但是NK-1R拮抗劑在多種臨床試驗(yàn)情況下均未顯示鎮(zhèn)痛效果。作者發(fā)現(xiàn)NK-1R-/-小鼠的免疫細(xì)胞募集并沒有減少，說明P 物質(zhì)誘導(dǎo)的免疫細(xì)胞募集過程與其經(jīng)典受體NK-1R 無(wú)關(guān)。此外，阻斷P 物質(zhì)釋放后由術(shù)后損傷引起的機(jī)械痛覺和熱痛覺過敏以及免疫細(xì)胞募集得以減輕，進(jìn)一步證實(shí)了P 物質(zhì)直接參與術(shù)后損傷引起的炎性痛。該研究表明Mrgprb2/MRGPRX2 是P物質(zhì)誘導(dǎo)的天然免疫細(xì)胞募集的基礎(chǔ)，可能為未來(lái)鎮(zhèn)痛藥物研發(fā)提供一個(gè)新靶點(diǎn)。

作者還研究了P 物質(zhì)激活肥大細(xì)胞上的Mrgprb2 受體引起免疫細(xì)胞募集的機(jī)制。在人的LAD2 肥大細(xì)胞中，P 物質(zhì)激活MRGPRX2 受體（小鼠同源基因Mrgprb2）可引起三種炎性細(xì)胞因子（TNF-α、GM-CSF 和IL-8）顯著增加。肥大細(xì)胞TNF-α 的釋放也被證明是產(chǎn)生趨化因子GM-CSF 和IL-8 的一個(gè)自分泌正反饋信號(hào)；GM-CSF 除了是單核細(xì)胞的生長(zhǎng)因子以及參與中性粒細(xì)胞的募集外，還在關(guān)節(jié)炎、炎癥和疼痛中起作用；IL-8 則是中性粒細(xì)胞的趨化因子，當(dāng)其被注射到小鼠后腳掌時(shí)也能引起機(jī)械痛覺過敏。對(duì)經(jīng)過P 物質(zhì)處理的肥大細(xì)胞上清液的分析也發(fā)現(xiàn)了MRGPRX2 介導(dǎo)的三個(gè)趨化因子CCL2、CCL3 和CCL4 的升高。雖然只有少數(shù)研究表明CCL2 和CCL3 可直接致敏周圍神經(jīng)元，但它們?cè)趩魏思?xì)胞招募中的作用可能是術(shù)后損傷引起炎性痛的主要驅(qū)動(dòng)因素。細(xì)胞因子TNF-α、GM-CSF、IL-8 以及趨化因子CCL4 在體內(nèi)的作用將在未來(lái)進(jìn)一步研究。

此外，阻斷NK-1R 后，上述細(xì)胞因子和趨化因子的釋放并沒有減少，證實(shí)了MRGPRX2 是它們釋放的主要受體。注入P 物質(zhì)的后腳掌和術(shù)后損傷模型的損傷組織中觀察到了細(xì)胞因子CCL2 和CCL3的釋放，而Mrgprb2-/-小鼠中這兩種趨化因子釋放很少的現(xiàn)象進(jìn)一步佐證了在LAD2 細(xì)胞中MRGPRX2介導(dǎo)細(xì)胞因子和趨化因子釋放，也證實(shí)了損傷后Mrgprb2 在體內(nèi)免疫細(xì)胞募集過程中的重要性。

綜上所述，作者在該研究中揭示了肥大細(xì)胞上的Mrgprb2 受體是神經(jīng)肽誘導(dǎo)免疫細(xì)胞募集的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因子，參與了術(shù)后小鼠機(jī)械痛和熱痛覺過敏反應(yīng)；P 物質(zhì)通過激活Mrgprb2 受體而不是經(jīng)典的NK-1R 受體促進(jìn)免疫細(xì)胞募集；小鼠的Mrgprb2 和人類MRGPRX2 是同源基因，分別通過不同肥大細(xì)胞參與了手術(shù)后的炎性反應(yīng)和疼痛。因此，該受體功能的發(fā)現(xiàn)也將為炎癥和疼痛治療提供一個(gè)新的靶點(diǎn)。