膽汁酸在膽汁淤積性肝損傷發(fā)病中的作用研究進展

何勝夫 綜述，汪余勤 審校

膽汁淤積是指肝內(nèi)外各種原因?qū)е碌哪懼纬伞⒎置诤团判拐系K進而導(dǎo)致膽汁不能正常進入十二指腸而反流入血的病理狀態(tài)[1，2]。病程早期可無明顯癥狀而僅僅表現(xiàn)為血清堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)和γ谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(gamma-glutamyl transferase，GGT)水平升高。在4660例慢性肝病患者中，膽汁淤積發(fā)生率高達10.3%[3]。膽汁酸在該病理過程中發(fā)揮著重要作用，膽汁酸是由膽固醇在肝臟內(nèi)經(jīng)過一系列生化反應(yīng)而合成的兩性分子，初級膽汁酸在肝臟合成后經(jīng)膽管分泌入腸道，在腸道細(xì)菌的作用下合成次級膽汁酸[4]，膽汁酸作為一種信號分子廣泛參與人體內(nèi)多種代謝及激素信號通路[5,6]。研究發(fā)現(xiàn)，將體外培養(yǎng)的肝細(xì)胞置于高濃度具有潛在毒性的膽汁酸中培養(yǎng)會誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡[7]。在膽汁淤積性肝病患者，血清炎癥因子水平升高[8]。在膽管結(jié)扎(bile duct ligation, BDL)小鼠，也能夠檢測到中性粒細(xì)胞的活化及其在肝臟的聚集[9]，表明炎癥反應(yīng)是膽汁酸淤積時導(dǎo)致肝損害的重要因素。

1 膽汁酸循環(huán)及膽汁酸轉(zhuǎn)運體

膽汁酸合成包括經(jīng)典通路和非經(jīng)典通路兩種途徑。經(jīng)典通路是以肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的膽固醇7-羥化酶(cholesterol 7-hydroxylase, CYP7A1)為主要限速酶催化發(fā)生；非經(jīng)典通路則發(fā)生在巨噬細(xì)胞及其他組織中，以定位于線粒體的甾醇27A羥化酶(sterol 27A-hydroxylase, CYP27A1)和定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的氧甾醇和類固醇7-羥化酶(oxysterol and steroid 7-hydroxylase, CYP7B1)為主要限速酶發(fā)生的。在經(jīng)典通路中，膽汁酸的合成受法尼醇受體X(farnesoid X receptor, FXR)負(fù)反饋調(diào)控[10]。膽汁酸在肝臟合成之后大部分通過肝細(xì)胞表面的膽汁酸轉(zhuǎn)運蛋白-膽鹽輸出泵(bile salt export pump, BSEP)運輸至膽小管，小部分膽汁酸可以通過分布在肝細(xì)胞的多藥耐藥相關(guān)蛋白2(multidrug resistance-associated protein，MRP2)排泌至膽小管然后儲存于膽囊之中。當(dāng)進食過后，膽囊收縮將膽汁酸排泄至腸道，其中95%膽汁酸在回腸中通過小腸刷狀緣細(xì)胞表面的Na+依賴的膽汁酸轉(zhuǎn)運體(apical sodium dependent bile acid transporter, ASBT)以及位于小腸上皮細(xì)胞基底膜的有機溶質(zhì)轉(zhuǎn)運體和異源二聚體(organic solute transporter and Hhterdimer, OSTα/β)主動吸收至門靜脈[6，11]。膽汁酸經(jīng)血液循環(huán)到達肝臟后被肝細(xì)胞基底膜的膽汁酸轉(zhuǎn)運體主動攝取，包括鈉離子/牛磺膽酸共轉(zhuǎn)運蛋白(Na+taurocholate cotransporting polypeptide，NTCP)、有機陰離子轉(zhuǎn)運蛋白(organic anion transporting polypeptide, OATP)家族[12]。其中，NTCP幾乎負(fù)責(zé)攝取所有的結(jié)合性膽汁酸，并受核受體法尼醇受體X以及SHP(FXR/SHP)調(diào)控[13]。OATP主要負(fù)責(zé)攝取非結(jié)合性膽汁酸，其主要受核受體FXR、孕固烷X受體(pregnane X receptor, PXR)等調(diào)節(jié)。膽汁酸循環(huán)中任一環(huán)節(jié)受損均可能導(dǎo)致膽汁淤積性肝損傷的發(fā)生。

2 膽汁酸并非通過其毒性直接誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡

既往的觀點認(rèn)為，各種因素導(dǎo)致膽汁淤積時，高濃度膽汁酸是通過其固有的溶解細(xì)胞膜毒性作用而直接導(dǎo)致肝細(xì)胞調(diào)亡。在這些研究中，研究者是將肝細(xì)胞置于高濃度次級膽汁酸中培養(yǎng)，然而在膽汁淤積患者體內(nèi)，這些次級膽汁酸濃度很難達到上述實驗水平[14]。隨后，有學(xué)者提出在膽汁淤積性肝損傷患者中，是由于膽汁酸誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡[15]，但是在BDL小鼠模型以及膽汁酸培養(yǎng)的體外人肝細(xì)胞，尚未發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞凋亡[16,17]，表明膽汁酸在膽汁淤積性肝損傷過程中可能是通過其他機制發(fā)揮作用的。

3 膽汁酸通過炎癥反應(yīng)導(dǎo)致肝細(xì)胞損害

3.1 膽汁酸介導(dǎo)相關(guān)炎癥因子表達進而誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞浸潤 在小鼠模型中可以觀察到在BDL 6小時后肝實質(zhì)壞死區(qū)域有中性粒細(xì)胞大量聚集，與肝細(xì)胞損傷的起始時間一致，并且該研究還發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞的浸潤持續(xù)整個膽汁淤積病理過程[14,18]。相關(guān)實驗發(fā)現(xiàn)將小鼠肝細(xì)胞置于200μM的牛黃膽酸(TCA,小鼠主要內(nèi)源性膽汁酸)中體外培養(yǎng)，可顯著刺激一系列細(xì)胞因子和黏附分子mRNA水平升高，包括CD18、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1,MCP-1)、巨噬細(xì)胞炎性蛋白2(macrophage inflammatory protein-2，MIP-2)等[18-21]，并且有發(fā)現(xiàn)，膽汁酸誘導(dǎo)的炎癥因子表達增加與NTCP有關(guān)，因此認(rèn)為膽汁酸通過NTCP介導(dǎo)進一步誘導(dǎo)炎癥因子表達上調(diào)[21]，而在膽汁酸轉(zhuǎn)運體NTCP缺乏的膽汁淤積患者中發(fā)現(xiàn)，盡管患者血清膽汁酸濃度很高，但其肝損傷卻很輕[13]。將人肝細(xì)胞置于病理濃度(>50μM)的甘氨鵝脫氧膽酸(GCDCA)中體外培養(yǎng)，炎癥因子，諸如MCP-1、CCL15、CCL20、CXCL1、IL-8等表達上調(diào)[7]。此外，在敲除炎癥因子CD18或MCP-1基因后，研究者觀察到雖然BDL小鼠血清膽汁酸濃度極高，但其堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)水平較對照組小鼠降低，并且肝細(xì)胞損傷也明顯減輕[9,21,22]。同樣的，研究者在TCA中培養(yǎng)的小鼠肝細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)早期生長反映因子-1(early growth response protein 1 EGR-1)表達上調(diào)，EGR-1是一種轉(zhuǎn)錄因子，其可調(diào)節(jié)包括炎癥因子在內(nèi)許多基因的表達，并且當(dāng)EGR-1缺陷時，膽汁酸介導(dǎo)的炎癥因子及細(xì)胞黏附分子釋放減少，中性粒細(xì)胞浸潤程度下降，肝細(xì)胞損傷明顯減輕[7,23]。此外，研究者發(fā)現(xiàn)在BDL小鼠模型中，小鼠肝內(nèi)皮細(xì)胞以及肝實質(zhì)細(xì)胞中細(xì)胞黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)的表達明顯上調(diào)，ICAM-1作為一種細(xì)胞黏附分子可以促進中性粒細(xì)胞向病變區(qū)域遷移，因此可誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞在肝臟受損區(qū)域大量浸潤，并且其表達上調(diào)強度與肝損傷程度相關(guān)[24]。細(xì)胞黏附分子ICAM-1和ERM蛋白(ezrin/radixin/moesin，埃茲蛋白/根蛋白/膜突蛋白)以及Na+/H+轉(zhuǎn)換調(diào)節(jié)因子-1(NHERF-1，可以影響ERM以及ICAM-1的表達[25,26])形成的大分子復(fù)合物(ICAM-1/ERM/NHERF-1)在BDL小鼠肝臟中表達增加，他們認(rèn)為該大分子復(fù)合物與BDL小鼠肝臟中性粒細(xì)胞浸潤有關(guān)，而且在NHERF-1缺陷的BDL小鼠模型中，小鼠肝臟內(nèi)中性粒細(xì)胞浸潤顯著減輕。并且他們證實NHERF-1缺陷的BDL小鼠較對照組小鼠的血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase,ALT)水平低70%，并且其肝細(xì)胞損傷也明顯減輕[26]。通過上述一系列實驗證明，膽汁酸可通過誘導(dǎo)BDL動物模型中一系列炎癥因子的釋放從而促進中性粒細(xì)胞在肝臟聚集，進而導(dǎo)致肝損傷。

3.2 其他免疫細(xì)胞的作用 除了中性粒細(xì)胞之外，其他免疫細(xì)胞也同樣參與膽汁淤積過程中膽汁酸介導(dǎo)的肝損傷。庫普弗細(xì)胞(Kupffer cell)—是肝臟中的巨噬細(xì)胞，在膽汁淤積性肝損傷過程中同樣發(fā)揮作用。既往將巨噬細(xì)胞分為兩型—M1和M2[27]，其中M1型Kupffer細(xì)胞為促炎表型，能被某些病理因素如細(xì)菌脂多糖、毒素等誘導(dǎo)釋放炎癥因子如IL-6、TNF-α等，從而導(dǎo)致肝臟損傷。而M2型Kupffer細(xì)胞為抗炎表型，其可選擇性被IL-4以及IL-13激活，并且釋放IL-4、IL-10、IL-13以及轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)而促進損傷修復(fù)并且抑制肝纖維化，從而減輕肝臟損傷[28]。Kupffer細(xì)胞具有極強的可塑性，在病理過程中能夠整合多種信號進而根據(jù)肝臟微環(huán)境的變化迅速改變其表型[29]。TGR5是一種G蛋白偶連膽汁酸受體，其廣泛表達于Kupffer細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞以及肝竇內(nèi)皮細(xì)胞，可被膽汁酸如石膽酸(LCA)、脫氧膽酸(DCA)、鵝脫氧膽酸(CDCA)等激活[30]。巨噬細(xì)胞中TGR5被膽汁酸激活后，可以抑制炎癥細(xì)胞因子的表達而加強抗炎細(xì)胞因子的表達進而影響Kupffer細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)變[31]。在肝臟受損病理過程中，Kupffer細(xì)胞還能夠通過吞噬凋亡細(xì)胞和細(xì)胞碎片，抗原呈遞以及招募其他免疫細(xì)胞發(fā)揮其作用[28,32]。除巨噬細(xì)胞外，T細(xì)胞同樣在膽汁淤積性肝病過程中發(fā)揮作用，IL-17是一種促炎以及成纖維細(xì)胞因子，由Th17細(xì)胞分泌，在BDL動物模型中已經(jīng)證實可見Th17細(xì)胞以及IL-17的增加[33]。既往有研究表明，在原發(fā)性膽汁性肝硬化(PBC)小鼠模型中，自然殺傷T細(xì)胞(NKT Cell)能夠加重肝損傷[34]，而隨后相關(guān)研究表明，NKT細(xì)胞可通過刺激抗炎因子IL-6或抑制Kupffer細(xì)胞釋放的促炎因子而減輕膽汁淤積性肝損害[35]。近期，研究者發(fā)現(xiàn)，在恒定自然殺傷細(xì)胞(iNKT Cell)缺陷的小鼠模型中，炎癥因子CXCL-10、ICAM-1釋放減少，EGR-1表達下調(diào)而膽汁酸轉(zhuǎn)運體MRP2和NTCP的表達上調(diào)進而導(dǎo)致在BDL動物模型中膽汁酸介導(dǎo)的肝損傷明顯減輕，證明NKT細(xì)胞在膽汁酸介導(dǎo)的肝損傷病理過程中同樣發(fā)揮重要作用。

3.3 膽汁酸介導(dǎo)的炎癥信號通路 如前文所述，在膽汁淤積性肝病過程中膽汁酸通過誘導(dǎo)相關(guān)炎癥反應(yīng)導(dǎo)致肝損傷，而膽汁酸是如何誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)發(fā)生的呢？Woolbright et al就此提出炎癥信號通路假說，他們認(rèn)為膽汁酸可誘導(dǎo)一系列促炎信號級聯(lián)反[18]。既往已有研究證實，TCA可以通過一系列信號通路上調(diào)EGR-1的表達進一步促進炎癥因子MCP-1、MIP-2以及ICAM-1的 釋放，而這一過程并不需要FXR參與，這證實膽汁酸介導(dǎo)炎癥反應(yīng)過程中部分是依賴EGR-1進行的，而這一過程涉及特定炎癥信號通路的激活。鞘氨醇1-磷酸受體2(sphingosine1-phosphate2 S1PR2)是膽管細(xì)胞中主要表達的鞘氨醇1-磷酸受體，Wang et al 研究人員發(fā)現(xiàn)在BDL動物模型中，TCA可以通過S1PR2激活ERK1/2/AKT-NF-κB信號通路進而誘導(dǎo)諸如MIP-2等炎癥因子釋放以及一系列炎癥反應(yīng)進而加重肝損傷。Toll樣受體9(Toll-like receptor9 TLR-9)是細(xì)胞內(nèi)的一種DNA受體，相關(guān)學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)膽汁酸可以損傷線粒體，線粒體損傷后釋放的線粒體DNA(mtDNA)可激活TLR-9，而在敲除TLR-9的小鼠肝臟細(xì)胞中，膽汁酸誘導(dǎo)趨化因子MIP-2的作用明顯減弱。而且在敲除髓樣分化因子88(MyD88)及Trif因子的小鼠模型中，膽汁酸誘導(dǎo)炎癥因子表達的作用同樣也會減弱[14]，而MyD88以及Trif是TLR-9的下游信號分子，因此可以推測在在膽汁淤積性肝損傷中，膽汁酸誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷釋放mtDNA后激活TLR-9信號通路，進而導(dǎo)致下游信號分子激活增加炎癥因子的釋放從而加重肝損傷。綜合上述研究證明，在膽汁淤積性肝損傷過程中，膽汁酸可通過多種促炎信號通路介導(dǎo)肝細(xì)胞損傷。然而目前許多炎癥信號通路尚不清楚，仍需進一步研究發(fā)現(xiàn)。

4 膽管上皮細(xì)胞的參與

膽管上皮細(xì)胞是排列在膽管管壁內(nèi)的上皮細(xì)胞，其同樣在膽汁酸介導(dǎo)的膽汁淤積性肝損傷過程中發(fā)揮重要作用。膽管上皮細(xì)胞上存在許多膽汁酸轉(zhuǎn)運體(如TGR5、ASBT、OSTα、OSTβ等)。如前所述，TGR5可在膽管上皮細(xì)胞細(xì)胞中表達，研究發(fā)現(xiàn)膽汁酸濃度升高時可誘導(dǎo)膽管上皮細(xì)胞中TGR5被激活并促進膽管細(xì)胞增殖并且可以抑制膽汁酸介導(dǎo)的細(xì)胞損傷。膽汁酸轉(zhuǎn)運體ASBT同樣在膽管上皮細(xì)胞中表達，當(dāng)發(fā)生膽汁淤積時，膽管上皮細(xì)胞中ASBT表達上調(diào)，導(dǎo)致膽汁酸攝取增多進而導(dǎo)致肝臟內(nèi)膽汁酸濃度上升，而近年來研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)發(fā)生膽汁淤積時抑制膽管上皮細(xì)胞中ASBT可顯著降低膽汁酸濃度并減輕肝細(xì)胞損傷。此外，膽管上皮細(xì)胞還能表達和分泌骨橋蛋白(osteopontin，OPN)，OPN是一種多功能蛋白，它能夠與炎癥細(xì)胞上的整合素受體結(jié)合成為許多免疫細(xì)胞(如中性粒細(xì)胞、NKT細(xì)胞、Kupffer細(xì)胞)的趨化因子。當(dāng)發(fā)生膽汁淤積時，膽管上皮細(xì)胞中骨橋蛋白表達水平增高，而且對于敲除OPN的BDL小鼠模型中中性粒細(xì)胞浸潤明顯減輕，炎癥反應(yīng)也明顯減輕。

5 膽汁淤積性肝損傷的治療

對于膽汁淤積性肝病尚無特別有效治療措施，熊去氧膽酸(ursodesoxycholic acid,UDCA)和S-腺苷蛋氨酸(S-adenosyl-L-methionine，SAMe)仍是目前治療膽汁淤積性肝病主要藥物[2]。奧貝膽酸(obeticholic，OCA)—主要用于治療臨床UDCA應(yīng)答不敏感的原發(fā)性膽汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis,PBC)患者，已于2016年由美國食品和藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)批準(zhǔn)上市。而中草藥作為我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中的瑰寶近年來已被多項實驗發(fā)現(xiàn)對于膽汁淤積性肝病的治療具有一定效果。膽汁淤積時小檗堿(berberine,BBR)已被證實可通過增加NTCP表達促進膽汁酸的攝取進而恢復(fù)膽汁酸循環(huán)穩(wěn)態(tài)。薯蕷皂苷(dioscin)則能增加膽汁淤積過程中膽汁酸轉(zhuǎn)運體MRP2、BSEP、NTCP的表達維持膽汁酸循環(huán)穩(wěn)定從而減輕肝細(xì)胞損傷，并且它可以減輕肝臟炎癥反應(yīng)，減輕氧化應(yīng)激以及發(fā)揮抗纖維化作用?？吕锢?corilagin)可抑制EGR-1的表達進而抑制炎癥反應(yīng)并降低膽汁淤積動物模型血清中總膽汁酸以及ALP水平，并且它還可以抑制NF-κB的表達進而減輕膽汁淤積性肝病中肝臟炎癥反應(yīng)，這可能與抑制前文所述的炎癥信號通路相關(guān)。此外，橙皮油素、五味子乙素等均被發(fā)現(xiàn)對于膽汁酸介導(dǎo)的肝損傷有一定治療作用[3]，但這些中草藥的臨床應(yīng)用仍需要進一步的實驗驗證。除傳統(tǒng)中草藥以外，還有許多新型藥物正處于研究當(dāng)中，比如Tropifexor，它是一種高效的FXR受體激動劑，其可通過激活肝細(xì)胞中FXR表達進一步激活下游SHP表達進而誘導(dǎo)BESP表達從而降低膽汁酸的蓄積。非諾貝特(fenofibrate)是過氧化物酶體增值劑激活受體α(peroxisome proliferators-activated receptors α，PPARα)激動劑，其可通過激活PPARα進一步抑制CYP7A1活性從而降低膽汁淤積時膽汁酸的合成，并且它可降低PBC患者血清ALP以及體內(nèi)多種炎癥因子水平，這些新型藥物目前仍處于臨床試驗中，有望在將來為膽汁淤積性肝病提供新的治療方法。