腸道微生態(tài)與自身免疫性肝病*

王 睿，王綺夏，馬 雄

自身免疫性肝病(autoimmune liver disease, AILD)是一類病因尚不明、具有自身免疫基礎(chǔ)的慢性肝病。AILD的特點(diǎn)為機(jī)體對自身肝臟組織失去耐受，肝臟出現(xiàn)病理性炎癥損傷，血清可發(fā)現(xiàn)與疾病相關(guān)的自身抗體。根據(jù)肝臟內(nèi)受累細(xì)胞的不同，可將AILD分為：累及肝細(xì)胞為主的自身免疫性肝炎(autoimmune hepatitis, AIH)、累及膽管細(xì)胞為主的原發(fā)性膽汁性膽管炎(primary biliary cholangitis, PBC)、原發(fā)性硬化性膽管炎(primary sclerosing cholangitis, PSC)和IgG4相關(guān)硬化性膽管炎(IgG4 related cholangitis, IgG4-SC)等。AILD的發(fā)病機(jī)制尚未闡明，目前認(rèn)為遺傳易感性、環(huán)境促發(fā)因素、免疫功能異常等多因素參與其中。腸道與肝臟通過門靜脈、膽道和全身血液循環(huán)，在解剖和功能上緊密聯(lián)系、相互影響，稱為“腸肝軸”(gut-liver axis)。目前，腸道微生態(tài)(intestinal microbiota)參與肝臟發(fā)病機(jī)制的研究多聚焦于非酒精性肝臟疾病和酒精性肝臟疾病。近期，馬雄團(tuán)隊(duì)首次揭示了我國AIH和PBC患者腸道菌群的組成、功能變化及其相關(guān)代謝物的改變，提示應(yīng)用腸道微生態(tài)作為非侵入性生物標(biāo)志物，具有用于疾病分層的轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)潛力。

1 自身免疫性肝病患者腸道微生態(tài)特征

AIH的特點(diǎn)為血清出現(xiàn)自身抗體、血清轉(zhuǎn)氨酶和免疫球蛋白G升高、肝組織檢查顯示中度至重度界面性肝炎，治療上對糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑有應(yīng)答[1]。近期，美國肝病學(xué)會(AASLD)發(fā)布了2019年成人和兒童AIH診斷和治療的臨床實(shí)踐指引[2]，總結(jié)了腸屏障破壞、循環(huán)中出現(xiàn)腸道細(xì)菌來源的脂多糖等腸道微生態(tài)因素可參與AIH的發(fā)生發(fā)展，有望成為治療新靶點(diǎn)。本課題組通過比較未經(jīng)糖皮質(zhì)激素治療的AIH患者與健康人，揭示了AIH患者腸道菌群失調(diào)的特征[3]。該研究應(yīng)用16S rRNA基因測序?qū)?1例AIH患者和98例健康人進(jìn)行橫斷面研究，另外設(shè)置了98例AIH患者和34例健康人作為獨(dú)立隊(duì)列進(jìn)行驗(yàn)證。與健康人比，AIH患者腸道菌群多樣性下降、整體菌群組成發(fā)生改變，其特征為專性厭氧菌減少、潛在致病菌，如韋永氏球菌(Veillonella)富集。其中，殊異韋永氏球菌(Veillonelladispar)與AIH疾病嚴(yán)重程度的相關(guān)性最強(qiáng)，與血清AST水平、肝臟炎癥程度呈正相關(guān)。應(yīng)用AIH相關(guān)的四個菌屬，包括韋榮氏球菌、乳酸桿菌(Lactobacillus)、顫螺旋菌(Oscillospira)、梭菌目(Clostridiales)構(gòu)建多變量邏輯回歸模型，其AUROC可達(dá)0.8，可較準(zhǔn)確地區(qū)分AIH患者和健康人。隨后，Liwinski et al[4]對AIH患者進(jìn)行糞菌測序，證實(shí)了殊異韋榮氏球菌與疾病嚴(yán)重程度的相關(guān)性，同時發(fā)現(xiàn)雙歧桿菌(Bifidobacterium)含量下降與AIH患者預(yù)后不良呈正相關(guān)。

PBC的特點(diǎn)為肝內(nèi)進(jìn)行性非化膿性小膽管破壞，可伴門靜脈炎癥、肝臟纖維化，絕大多數(shù)PBC患者血清抗線粒體抗體(antimitochondrial antibody, AMA)陽性，特別是AMA-M2亞型陽性對本病診斷的敏感性和特異性高，部分PBC患者可出現(xiàn)抗核抗體(antinuclear antibody, ANA)陽性，如抗核孔膜蛋白(gp210)、抗核小體蛋白(sp100)陽性，臨床主要給予熊去氧膽酸(ursodexoycholic acid, UDCA)治療。本課題組[5]對PBC患者腸道菌群進(jìn)行了橫縱向研究。橫斷面研究納入了60例未經(jīng)UDCA治療的PBC患者和80例健康人，縱向研究則納入了37例UDCA治療6個月前后的PBC患者。與健康人比，PBC患者糞菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變(8個菌屬上調(diào)、4個菌屬下調(diào))。其中，克雷伯菌(Klebsiella)在PBC患者中上調(diào)，與血清總膽紅素水平呈正相關(guān)。通路分析顯示，PBC患者細(xì)菌入侵上皮通路上調(diào)，與腸桿菌科細(xì)菌豐度增加有相關(guān)性。值得注意的是，經(jīng)UDCA治療后，有變化的菌屬中有6個菌屬趨于正?；崾綰DCA作為促內(nèi)源性膽汁酸(bile acid, BA)分泌藥物，可調(diào)節(jié)PBC患者腸道微生態(tài)，進(jìn)而緩解病情。循此思路，本課題組[6]進(jìn)一步分析了PBC患者血清和糞便BA譜以及BA與腸道菌群的關(guān)聯(lián)，結(jié)果顯示PBC患者BA代謝異常，表現(xiàn)為結(jié)合型轉(zhuǎn)化為未結(jié)合型BA、初級轉(zhuǎn)化為次級BA的過程受阻。UDCA治療可降低?；撬峤Y(jié)合BA水平，從而改善結(jié)合型/未結(jié)合型比例。此外，結(jié)合型BA和次級BA水平與PBC患者上調(diào)的菌屬(如韋永氏球菌、克雷伯菌)呈正相關(guān)，與健康人上調(diào)的菌屬(如糞桿菌(Faecalibacterium)、顫螺旋菌)呈負(fù)相關(guān)。

PSC的特點(diǎn)為炎癥累及肝內(nèi)、外膽管，引起膽管硬化、阻塞和結(jié)構(gòu)破壞，導(dǎo)致慢性膽汁淤積、膽管纖維化，最終可進(jìn)展為肝硬化和肝功能衰竭。部分PSC患者合并炎癥性腸病(inflammatory bowel disease, IBD)，其比例因地區(qū)、人種不同呈現(xiàn)較大的差異。有研究指出，大多數(shù)PSC-IBD患者存在結(jié)腸炎癥，其腸道微生態(tài)特征類似于典型的PSC和IBD患者[7,8]，提示腸道微生態(tài)失衡可能參與了PSC的發(fā)生發(fā)展。目前，國外已開展了多項(xiàng)關(guān)于PSC患者糞便和腸道黏膜菌群的研究，與健康人比，PSC患者菌群多樣性較低，腸球菌(Enterococcus)、梭菌屬(Fusobacterium)和乳酸桿菌水平上調(diào)[9-11]。

IgG4-SC的特點(diǎn)是血清IgG4水平升高、膽管內(nèi)和肝組織IgG4陽性漿細(xì)胞浸潤，常伴發(fā)自身免疫性胰腺炎及纖維化性疾病。該類患者的腸道微生態(tài)特征有待進(jìn)一步闡明。

2 腸道微生態(tài)在自身免疫性肝病發(fā)病過程中的作用

2.1 腸道細(xì)菌異位激活肝臟免疫可加重肝病進(jìn)程 在生理狀態(tài)下，腸道上皮細(xì)胞及相關(guān)成分(黏液層、抗菌肽、免疫球蛋白、共生菌等)共同構(gòu)成屏障，同時腸系膜淋巴結(jié)、肝臟依次作為免疫“防火墻”，限制腸道菌群異位至其他器官。在病理狀態(tài)下，發(fā)生“腸漏”(leaky gut)，細(xì)菌及其代謝物可通過門脈進(jìn)入肝臟，造成肝臟的炎癥及損傷。研究表明[8]，SC患者腸道肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumonia)可破壞腸上皮，促使其他細(xì)菌，如奇異變形桿菌(Proteusmirabilis)、鶉雞腸球菌(Enterococcusgallinarum)一同穿過腸屏障，進(jìn)而引起Th17細(xì)胞介導(dǎo)的肝臟炎癥反應(yīng)。另有一項(xiàng)研究[12]指出，鶉雞腸球菌可穿過腸上皮，到達(dá)腸系膜、腸系膜淋巴結(jié)、肝臟和脾臟等多個器官，從而引發(fā)自身免疫性疾病，如AIH、系統(tǒng)性紅斑狼瘡。應(yīng)用鶉雞腸球菌特異的FISH探針，在肝臟中可檢測出鶉雞腸球菌。在動物實(shí)驗(yàn)應(yīng)用抗生素或特定疫苗能抑制鶉雞腸球菌生長，進(jìn)而緩解疾病。

在腸道微生態(tài)失衡的背景下，機(jī)體發(fā)起針對細(xì)菌抗原的免疫反應(yīng)，同時可攻擊結(jié)構(gòu)相似的機(jī)體自身抗原，從而誘發(fā)自身免疫反應(yīng)[13]。研究表明，從AILD患者分離出的自身抗體可與特定的微生物蛋白發(fā)生反應(yīng)。例如，自PBC患者來源的抗線粒體抗體(anti-mitochondrial antibody, AMA)可與大腸埃希菌(Escherichiacoli)蛋白結(jié)合[14]，自PBC患者來源的IgG3自身抗體可與德氏乳酸桿菌β半乳糖苷酶(Lactobacillusdelbrueckiiβ-galactosidase, BGAL)結(jié)合，同時BGAL與PBC自身抗原PDC-E2亞單位的相似性可達(dá)67%[15]；自PSC患者來源的核周型抗中性粒細(xì)胞抗體(peripheral antineutrophil cytoplasmic antibody, p-ANCA)則可與細(xì)菌細(xì)胞分裂蛋白FtsZ結(jié)合[16]。

具有遺傳易感性的個體可能存在限制腸菌異位的免疫系統(tǒng)功能受損。多項(xiàng)關(guān)于全基因組關(guān)聯(lián)分析的研究指出[17,18]，PSC-IBD患者存在CARD-9、FUT-2和MST-1等遺傳易感位點(diǎn)，而這些位點(diǎn)編碼的蛋白參與腸道固有免疫及適應(yīng)性免疫。FUT-2突變基因攜帶者發(fā)生膽道感染及梗阻的風(fēng)險增高[19,20]。CARD-9則作為NOD2和TLR信號通路的下游分子，介導(dǎo)IL-22的產(chǎn)生及腸屏障的維持。CARD-9基因缺陷小鼠發(fā)生結(jié)腸炎的風(fēng)險增高，可能與缺少代謝色氨酸的腸道細(xì)菌有關(guān)[21]。

2.2 腸黏膜免疫細(xì)胞遷移至肝臟可加重肝病進(jìn)程 腸道淋巴細(xì)胞歸巢(gut lymphocyte homing)可引起肝臟的炎癥損傷。已知腸黏膜淋巴細(xì)胞表達(dá)整合素α4β7和驅(qū)化因子受體CCR9，可分別與內(nèi)皮黏附分子MAdCAM-1和趨化因子CCL25結(jié)合。一項(xiàng)研究指出，在炎癥性肝臟疾病，包括PSC患者，肝竇內(nèi)皮細(xì)胞過量表達(dá)MAdCAM-1和CCL25，募集腸道來源的淋巴細(xì)胞進(jìn)入肝臟，引起肝臟損傷[22]。在機(jī)制上，肝臟血管黏附蛋白(vascular adhesion protein, VAP)-1與肝臟MAdCAM-1過量表達(dá)相關(guān)，VAP-1的底物半胱胺來源于腸菌代謝及飲食，通過門脈進(jìn)入肝臟后作用于VAP-1[23]。此外，研究者通過測序發(fā)現(xiàn)腸道T細(xì)胞TCRβ鏈克隆可能與肝組織來源相關(guān)，可能識別同一種抗原。除T細(xì)胞外，B細(xì)胞也參與“腸肝對話”[24]。研究表明，肝內(nèi)產(chǎn)生IgA的B細(xì)胞亞群來源于腸道淋巴樣組織，可識別腸道共生菌抗原[25]。鑒于慢性肝病，如PBC和PSC患者血清IgA水平較高，腸道產(chǎn)生IgA的B細(xì)胞可能由細(xì)菌活化后進(jìn)入肝臟，進(jìn)而參與了上述疾病的發(fā)病過程。

2.3 部分腸菌代謝物調(diào)節(jié)肝臟免疫有望緩解肝病 BA為“腸肝對話”的重要組成部分。在生理狀態(tài)下，肝細(xì)胞將膽固醇作為原料來合成初級BA，后者與甘氨酸或?；撬峤Y(jié)合后進(jìn)入膽道、儲存于膽囊。在進(jìn)食狀態(tài)下，BA進(jìn)入小腸以促進(jìn)脂肪的吸收。大部分BA在回腸末端被重吸收，通過全身血液循環(huán)回到肝臟，其余BA則在腸菌膽酸鹽水解酶(bile salt hydrolase，BSH)作用下形成游離BA，再通過7-α脫羥基酶的作用形成次級BA，通過門脈回到肝臟，BA的代謝過程受到調(diào)控，其中法尼酯X受體(farnesoid X receptor, FXR)和G蛋白偶聯(lián)膽汁酸受體1(G protein-coupled bile acid receptor 1, TGR5)受到廣泛關(guān)注。FXR位于腸上皮細(xì)胞，與BA結(jié)合后，啟動成纖維細(xì)胞生長因子19(fibroblast growth factor 19，F(xiàn)GF19)的轉(zhuǎn)錄過程。FGF19通過門脈進(jìn)入肝臟，通過抑制肝細(xì)胞CYP7A1酶，可下調(diào)BA水平，維持肝臟穩(wěn)態(tài)。一方面，可改善參與BA代謝的腸道菌群以恢復(fù)正常的肝臟免疫能力。研究表明，應(yīng)用特定抗生素組合殺死部分革蘭氏陰性菌后，初級/次級BA比例達(dá)到平衡，進(jìn)而上調(diào)肝竇內(nèi)皮細(xì)胞趨化因子CXCL16水平、促進(jìn)CXCR6+NKT細(xì)胞聚集于肝臟，可抑制腫瘤生長[26]。另一方面，可改善BA的信號通路來治療膽汁淤積性肝病。奧貝膽酸(obeticholic acid, OCA)作為FXR激動劑，可用于對UDCA部分應(yīng)答的PBC患者。一項(xiàng)關(guān)于OCA雙盲、對照的三期臨床試驗(yàn)納入217例患者，歷時12個月，結(jié)果顯示OCA能顯著改善對UDCA部分應(yīng)答的PBC患者血生化指標(biāo)[27]。

色氨酸作為常見蛋白類食物中的必需氨基酸，經(jīng)由腸道細(xì)菌代謝后，生成一系列吲哚衍生物，包括吲哚-3-乙酸和吲哚-3-丙酸等。這些衍生物是芳香烴受體(aryl hydrocarbon receptor，AHR)的配體。AHR被激活后，促進(jìn)抑炎因子，如IL-10的生成，有利于維護(hù)腸屏障的完整性。此外，色氨酸衍生物能進(jìn)入肝臟，調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、減輕炎癥反應(yīng)。研究表明，部分AIH患者AHR通路受抑制或非經(jīng)典通路被激活，導(dǎo)致Treg細(xì)胞/Th17細(xì)胞比例失衡，影響其上調(diào)免疫調(diào)節(jié)分子CD39的能力。通過活化AHR途徑，有望改善AIH患者的免疫微環(huán)境[28]。此外，短鏈脂肪酸(short chain fatty acid, SCFA)[29]、亞精胺(spermidine)[30]、氧化三甲胺(trimethylamine-Noxide，TMAO)[31]及新發(fā)現(xiàn)的氨基戊酸類代謝物TMAVA[32]，通過調(diào)控免疫和代謝等機(jī)制，影響多種疾病的發(fā)生發(fā)展。它們在自身免疫性肝病發(fā)病過程中是否發(fā)揮作用，有待進(jìn)一步探索。

3 總結(jié)與展望

隨著高通量測序技術(shù)的迅速普及和不斷完善，自身免疫性肝病患者腸道微生態(tài)特征得以被揭示，但主要集中在前期的相關(guān)性研究。這些發(fā)生改變的腸道微生物在疾病發(fā)病機(jī)制中扮演的角色有待后續(xù)的因果性研究來進(jìn)一步闡明。值得一提的是，目前熱點(diǎn)多聚焦于細(xì)菌，鑒于腸道微生態(tài)還包括真菌和病毒等，相關(guān)系列研究的完善才有助于全面揭示腸道微生態(tài)的變化。靶向腸道微生態(tài)包括應(yīng)用抗生素、糞菌移植、益生菌、噬菌體等逐步精準(zhǔn)化的治療手段，有望緩解自身免疫性肝病的進(jìn)程。