穩(wěn)定同位素在葡萄酒產(chǎn)地溯源中的研究進(jìn)展

申雪，袁玉偉，聶晶，王偉雄，黃翠，武運(yùn)*

（1. 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052；2. 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所，浙江杭州 310021）

葡萄酒是由破碎或未破碎的新鮮葡萄果實(shí)或葡萄汁通過發(fā)酵后獲得的低酒精類飲品。葡萄酒中含有多種活性成分，長(zhǎng)期少量飲用可降低血液中的低密度膽固醇，有益于人體健康[1-2]，因此深受各國(guó)人民的喜愛。目前我國(guó)葡萄酒生產(chǎn)基地已漸漸形成規(guī)模。隨著國(guó)民生活質(zhì)量的提高，消費(fèi)者對(duì)葡萄酒的品質(zhì)和產(chǎn)地也越發(fā)重視。葡萄酒的商業(yè)價(jià)值主要來源于產(chǎn)地和葡萄酒釀造生產(chǎn)的年份。然而，近年來葡萄酒的摻假、地理產(chǎn)地誤標(biāo)等時(shí)常發(fā)生，嚴(yán)重?cái)_亂了市場(chǎng)秩序，不僅造成企業(yè)的嚴(yán)重?fù)p失，也為政府監(jiān)管帶來困擾。因此，葡萄酒的真實(shí)性信息受到了社會(huì)的廣泛關(guān)注，葡萄酒的產(chǎn)地溯源已經(jīng)變得不可或缺[3-4]。

目前，應(yīng)用于食品產(chǎn)地溯源的技術(shù)有穩(wěn)定性同位素分析、電子信息編碼技術(shù)、礦物元素分析、有機(jī)成分分析和 DNA 指紋分析等方法，其中穩(wěn)定性同位素組成作為食品的天然指紋，與農(nóng)產(chǎn)品生長(zhǎng)的地理環(huán)境密切相關(guān)，既不會(huì)遭受人為改變，也不會(huì)受外源化學(xué)物質(zhì)的影響，能反應(yīng)農(nóng)產(chǎn)品所處的環(huán)境條件，提供可靠、準(zhǔn)確的食品產(chǎn)地來源信息，已廣泛用于鑒別不同產(chǎn)地的各種農(nóng)產(chǎn)品[5]，其中有些同位素分析方法已得到美國(guó)官方分析化學(xué)師協(xié)會(huì)（AOAC）及標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（CEN）的承認(rèn)[6]。本文主要介紹穩(wěn)定同位素的基本原理以及常用的幾種穩(wěn)定同位素在葡萄產(chǎn)地溯源中的變化機(jī)理和研究現(xiàn)狀，旨在推動(dòng)穩(wěn)定同位素在葡萄酒產(chǎn)地溯源中的研究與應(yīng)用，促進(jìn)葡萄酒產(chǎn)地追溯制度的建立與完善。

1 穩(wěn)定同位素技術(shù)概況

同位素技術(shù)是基于原子性質(zhì)所衍生的一種方法。同位素是具有相同原子序數(shù)的不同原子，其差異來源于中子數(shù)目的不同，質(zhì)量差異較小。穩(wěn)定同位素是指半衰期大于1015年的元素同位素。因具有相同原子序數(shù)，同位素的化學(xué)性質(zhì)幾乎相同。研究元素的同位素組成是穩(wěn)定同位素分析技術(shù)的核心[7]，利用其同位素進(jìn)行溯源的基本原理是依據(jù)穩(wěn)定同位素的自然分餾效應(yīng)。因質(zhì)量和核自旋的差異會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)產(chǎn)物的同位素組成與原始的同位素組成不同，這種差異稱為同位素效應(yīng)或分餾。由于不同地區(qū)的大氣、土壤、水等環(huán)境中的同位素組成具有差異，加上生物體內(nèi)的同位素受到代謝等因素的影響，導(dǎo)致同位素組成產(chǎn)生差異，利用這種差異可以區(qū)分可能的地理來源[8-9]。穩(wěn)定同位素組成可以通過穩(wěn)定同位素質(zhì)譜儀進(jìn)行測(cè)定，并根據(jù)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)以同位素比值（δ值）形式進(jìn)行表示，該值乘以1000以千分?jǐn)?shù)（‰）為單位。穩(wěn)定同位素分析技術(shù)是較早對(duì)農(nóng)產(chǎn)品進(jìn)行地理溯源的方法之一，國(guó)內(nèi)起步較晚，基礎(chǔ)也較薄弱。但是隨著我國(guó)科技發(fā)展和儀器的不斷更新，穩(wěn)定同位素質(zhì)譜為溯源領(lǐng)域的研究提供了極大的便利。

2 常用穩(wěn)定同位素在產(chǎn)地溯源中的特征

地理來源的確定通常需要多個(gè)穩(wěn)定同位素參數(shù)。這應(yīng)包括氫、碳、氮、氧和硫（構(gòu)成生物材料的輕元素，即所謂的“生物元素”）的穩(wěn)定同位素?cái)?shù)據(jù)，有時(shí)還包括重元素，如鍶、鉛等同位素比值[10-11]。較重的元素或“地球元素”是生物體中不必要的或至少在數(shù)量上不重要的組成部分，它們也沒有被積極地整合到生物分子中，因此不受生物系統(tǒng)中可測(cè)量的同位素分餾的影響。然而，它們可能是當(dāng)?shù)氐刭|(zhì)（巖石、土壤）的非常重要的指標(biāo)，生物物質(zhì)來源于此，也可能表明人為污染。穩(wěn)定同位素分析技術(shù)的應(yīng)用是基于這些元素的穩(wěn)定同位素比值隨產(chǎn)地的地理來源、氣候條件、土壤學(xué)和地質(zhì)條件的變化而變化[12]。

2.1 碳同位素

碳是重要的生命元素，自然界中有兩種穩(wěn)定碳同位素分別是12C和13C，在大自然中的占比分別為98.89%、1.11%。植物中δ13C值范圍因不同光途徑合成的碳水化合物而不同，目前存在3種光代謝途徑，分別是C3途徑（Calvin循環(huán)），C4途徑（Hatch-Slack循環(huán)）和CAM途徑。C3植物的δ13C范圍為-3%～-2.3%，C4植物的范圍為-1.4%～-1.2%，CAM植物存在C3和C4途徑，其δ13C范圍為-2.8%～-1.5%，因此在不同植物中δ13C值能夠反應(yīng)植物的生長(zhǎng)方式和生理生態(tài)過程。δ13C是農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)地判別的良好指標(biāo)[13-14]，張遴等[15]通過測(cè)定蘋果和蘋果汁中的穩(wěn)定同位素發(fā)現(xiàn)，δ13C不會(huì)由于蘋果加工而改變，同時(shí)也不會(huì)隨著時(shí)間的變化而改變，因此δ13C具有較好的穩(wěn)定性。黃島平等[16]通過對(duì)廣西、湖南、四川、福建4地柑橘中的δ13C進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，各地柑橘果汁中的δ13C數(shù)據(jù)顯著不同。吳浩等[17]通過建立葡萄酒中5種揮發(fā)性組分碳穩(wěn)定同位素比值新方法，研究了法國(guó)、澳大利亞、美國(guó)和中國(guó)共54個(gè)樣品，發(fā)現(xiàn)此方法對(duì)4個(gè)產(chǎn)區(qū)的葡萄酒能進(jìn)行有效區(qū)分，并能應(yīng)用于鑒別葡萄酒是否造假。

2.2 氫和氧同位素

氫和氧是自然界中兩種主要元素，他們以單質(zhì)和化合物的形式遍布全球。水中氫氧同位素組成對(duì)生態(tài)學(xué)研究具有重要意義，是預(yù)測(cè)氣候變化、構(gòu)建古氣候的重要目標(biāo)參數(shù)。大氣降水中的氫氧同位素（稱為降水同位素）及分布規(guī)律受蒸發(fā)和凝結(jié)作用制約，目前國(guó)際上已有多年多地的降水同位素景觀圖譜，存在溫度效應(yīng)、緯度效應(yīng)、海拔效應(yīng)、大陸效應(yīng)、降水量效應(yīng)和季節(jié)性效應(yīng)[18-19]。植物干物質(zhì)中的氫同位素不僅受降水同位素的影響，也會(huì)受植物的蒸騰作用所影響；然而，氧同位素受植物的光合作用以及呼吸作用中的同位素分餾而影響。因此，不同產(chǎn)區(qū)中農(nóng)產(chǎn)品的氫氧同位素會(huì)有不同的表現(xiàn)[20-21]。Dutra等[22]采集巴西南部的3個(gè)不同區(qū)域的釀酒葡萄與葡萄酒，研究發(fā)現(xiàn)將葡萄中的18O/16O與礦物質(zhì)元素結(jié)合能夠更好的加以區(qū)分。West等[23]通過CO2平衡方法研究歐洲等地的葡萄酒中δ18O與空間氣候和降水δ18O模式之間的關(guān)系，并開發(fā)在GIS空間上的回歸模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)葡萄酒水中的δ18O記錄了釀酒葡萄成熟后期以及氣候中的δ18O，表明葡萄酒水中δ18O地理信息系統(tǒng)模型是獨(dú)立驗(yàn)證葡萄酒產(chǎn)地和年份的有效工具。

2.3 氮同位素

氮元素最豐富的形式是大氣中的氮?dú)猓∟2），它的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，化學(xué)性質(zhì)不活潑，常溫下很難與其他物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，因此大多數(shù)的生物都無法利用，也使得氮成為一種限制性的營(yíng)養(yǎng)元素。自然界中有兩種方式能將惰性的氮變?yōu)榛钚缘牡?，一是自然放電過程使得氮?dú)廪D(zhuǎn)化為氮氧化物，二是通過生物固氮菌將空氣中的氮變?yōu)檫€原性氮化合物——氨[24-25]。自然界氮素的循環(huán)中，能被生物利用的氮離不開土壤的環(huán)境，大量的研究集中在植物與土壤中氮的轉(zhuǎn)化及影響因素。農(nóng)產(chǎn)品中氮同位素的影響主要與農(nóng)業(yè)施肥相關(guān)，人工合成化肥中δ15N比較貧化，如果土壤得不到足夠的氮素以彌補(bǔ)損失，含氮量就會(huì)下降，從而影響農(nóng)作物生長(zhǎng)。施肥（包括化學(xué)肥料和農(nóng)家肥）和生物固氮是補(bǔ)充土壤中氮素的方法[26]。Francesco等[27]通過對(duì)不同產(chǎn)區(qū)中有機(jī)與非有機(jī)鮮食葡萄的研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)δ13C、δ18O 和δ2H穩(wěn)定同位素與適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)計(jì)量法相結(jié)合，可以很好的對(duì)葡萄產(chǎn)地進(jìn)行判別（預(yù)測(cè)能力為92.2%），然而，利用穩(wěn)定氮同位素在鮮食葡萄的產(chǎn)地判別中的效果并不明顯。

2.4 鉛同位素

鉛同位素一般以207Pb/206Pb和208Pb/207Pb作為檢測(cè)指標(biāo)。植源性農(nóng)產(chǎn)品中的鉛金屬主要來源于土壤及地表水，由于不同產(chǎn)區(qū)的地質(zhì)結(jié)構(gòu)和地質(zhì)年齡存在差異，并且各個(gè)地區(qū)的降水分布不同，導(dǎo)致鉛同位素含量也有所不同，故鉛同位素的組成因此具有顯著的地區(qū)差異，可以用作為植源性農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)地判別的標(biāo)識(shí)。但由于很多企業(yè)的生產(chǎn)工藝及設(shè)備材質(zhì)的不同也會(huì)對(duì)鉛同位素的含量產(chǎn)生影響，而鉛穩(wěn)定同位素的優(yōu)點(diǎn)在于能夠追溯出可能的鉛來源及傳播途徑，并且樣品用量較少。因此，目前鉛同位素在溯源技術(shù)的研究多集中于環(huán)境中鉛污染的來源上[28-29]。

2.5 鍶同位素

鍶同位素是一個(gè)強(qiáng)大的地理標(biāo)志，常用87Sr/86Sr表示。不同產(chǎn)地的植源性農(nóng)產(chǎn)品由于不同的地質(zhì)環(huán)境、氣候差異以及季節(jié)的影響，87Sr/86Sr的含量都也會(huì)有所不同。但由于87Sr/86Sr屬于重同位素，在植物和化學(xué)過程中不會(huì)發(fā)生明顯的分餾現(xiàn)象。87Sr/86Sr比值的主要影響因素是植源性農(nóng)產(chǎn)品種植的地理環(huán)境和巖石結(jié)構(gòu)，幾乎不受季節(jié)交替和氣候溫度的影響。因此當(dāng)植物產(chǎn)品中δ18O和δ2H不易判別時(shí)，同時(shí)在氣候差異較小的地區(qū)，采用鍶穩(wěn)定同位素來進(jìn)行產(chǎn)地溯源可以獲得比較理想的效果[30]。

3 穩(wěn)定同位素在葡萄酒產(chǎn)地溯源中的應(yīng)用

目前，葡萄酒產(chǎn)地溯源主要有4種方法：一是礦物質(zhì)元素指紋分析；二是芳香物質(zhì)組成分析；三是紅外檢測(cè)；四是穩(wěn)定同位素技術(shù)。穩(wěn)定同位素分析技術(shù)是歐洲和北美官方承認(rèn)所使用的鑒別農(nóng)產(chǎn)品地理來源的方法，葡萄酒中的輕穩(wěn)定同位素以13C/12C、18O/16O、2H/1H為主，測(cè)定指標(biāo)主要是葡萄酒乙醇中的δ13C、D/H和水中的δ18O。輕穩(wěn)定同位素分餾的大小受區(qū)域差異及參數(shù)變化（如濕度、溫度、風(fēng)等氣象條件）等因素的影響，因此這些穩(wěn)定同位素的比例可以提供有關(guān)植物和地理起源的信息，重穩(wěn)定同位素不會(huì)因?yàn)榛瘜W(xué)或生物過程而發(fā)生同位素分餾作用，釀酒過程一般不會(huì)對(duì)葡萄酒中的重同位素比值產(chǎn)生影響[31]。

3.1 輕穩(wěn)定同位素

輕元素氫、碳、氧比值的測(cè)量被證明是溯源應(yīng)用領(lǐng)域中特別有用的指紋工具[32]，不同產(chǎn)地的釀酒葡萄由于生長(zhǎng)環(huán)境的不同引起葡萄酒乙醇中的穩(wěn)定碳同位素差異[32-34]。高濕、高溫地區(qū)的葡萄所釀造的葡萄酒中乙醇13C的數(shù)量遠(yuǎn)高于干燥、寒冷地區(qū)，因此，氣候中溫度與濕度兩個(gè)因子對(duì)于釀酒葡萄具有重要的影響[35-36]。Zyakun等[37]通過利用同位素質(zhì)譜法對(duì)西歐和俄羅斯兩個(gè)不同產(chǎn)區(qū)的釀酒葡萄中的營(yíng)養(yǎng)部位（根、枝條、葉子）和生成部位（漿果）進(jìn)行研究，結(jié)果表明植物組織和漿果中δ13C值的變化與植物生長(zhǎng)中的水分（年降水量之和）和溫度（年有效溫度之和）有關(guān)。因此，以葡萄原料生產(chǎn)的乙醇中的δ13C同位素含量取決于不同品種以及生長(zhǎng)環(huán)境的水分含量。Camin等[38]考察意大利11年間各地生產(chǎn)約4000個(gè)葡萄酒樣品，這是第一個(gè)將葡萄酒中碳、氫和氧同位素和環(huán)境變量關(guān)系結(jié)合起來的全面研究。該研究利用可視化工具、回歸分析和線性模型調(diào)查葡萄成熟日期、經(jīng)緯度、與海洋的距離、降水量、最高和最低日均氣溫、全年平均氣溫、降水同位素與葡萄酒中同位素的關(guān)系，并定義了氣候和地理數(shù)據(jù)推斷同位素值的多元模型。研究特別強(qiáng)調(diào)了葡萄酒水中的δ18O與氣候和地理位置的關(guān)系最強(qiáng)，其次為干濕度，主導(dǎo)變量為緯度，呈負(fù)相關(guān)；降水量和溫度的δ18O和δ2H均呈正相關(guān)。江偉等[39]對(duì)河北昌黎、山東蓬萊、寧夏賀蘭山東麓和河北沙城4大產(chǎn)區(qū)的60個(gè)樣品中的碳、氫、氧同位素進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，雖然樣品范圍分布廣泛，但同一地區(qū)較為集中，故單一使用碳、氫、氧任何一種元素都無法有效區(qū)分產(chǎn)區(qū)。當(dāng)結(jié)合3種元素并采用線性判別分析能100%判別4大產(chǎn)區(qū)的葡萄酒。

3.2 重穩(wěn)定同位素

在過去幾十年中，越來越多具有地質(zhì)意義的重穩(wěn)定同位素比值被用于考古、環(huán)境、醫(yī)學(xué)以及鑒別食品原產(chǎn)地等領(lǐng)域[46]，葡萄園的每個(gè)地質(zhì)層都含有其自身的重同位素成分。葡萄酒中的鉛與大分子有關(guān)，主要是單寧、多糖和蛋白質(zhì)片段；紅葡萄酒經(jīng)過消化后，只有不到20%的鉛以可吸收的形式存在[40-41]。葡萄酒中的鉛可能來自兩種污染源，一種是天然的，與土壤有關(guān)；另一種是人類活動(dòng)造成的。后者與農(nóng)藥、生產(chǎn)、運(yùn)輸和用于儲(chǔ)存葡萄酒的材料以及先前工業(yè)和運(yùn)輸排放的鉛在大氣中的沉淀有關(guān)。有學(xué)者通過采集葡萄酒生產(chǎn)時(shí)所用到的葡萄以及種植土壤和空氣，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)鉛同位素比值的變化可以用來追溯鉛污染的來源[42]。Medina等[45]指出，葡萄枝條也可能吸收來自大氣環(huán)境中的鉛，并發(fā)現(xiàn)植物從沉積物中吸收的鉛是低于大氣中的，因此證明鉛同位素可以用于葡萄酒中鉛污染的來源判別。Dean等[44]通過測(cè)量澳大利亞和歐洲葡萄酒中的鉛同位素發(fā)現(xiàn)，不同產(chǎn)區(qū)葡萄酒中鉛同位素組成不同。葡萄酒中的87Sr/86Sr同位素比率反映了葡萄生長(zhǎng)的土壤狀況，也是葡萄酒地理來源的有效指標(biāo)，運(yùn)用87Sr/86Sr在跟蹤葡萄酒原產(chǎn)地方面的應(yīng)用是地質(zhì)性同位素最具有開闊性的應(yīng)用之一[45]。Horn等[46]對(duì)不同國(guó)家葡萄酒的87Sr/86Sr比值測(cè)定后發(fā)現(xiàn)，不同產(chǎn)地中葡萄酒的87Sr/86Sr比值不同，并且一些樣品標(biāo)簽可能存在產(chǎn)地誤標(biāo)等現(xiàn)象。87Sr/86Sr在釀酒期間產(chǎn)生變化可能是由于在發(fā)酵過程中果皮與種子中的87Sr/86Sr被釋放出來，F(xiàn)ernandes等[47]對(duì)葡萄牙不同地區(qū)葡萄酒中的87Sr/86Sr進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地的葡萄酒中的87Sr/86Sr比值存在明顯不同，雖然有研究表明在釀造過程中87Sr/86Sr會(huì)產(chǎn)生變化，但鍶同位素仍是葡萄酒示蹤的重要指標(biāo)，并在2018年，該學(xué)者對(duì)不同葡萄酒發(fā)酵全過程中的δ87Sr/86Sr進(jìn)行測(cè)量，并發(fā)現(xiàn)δ87Sr/86Sr值在種植土壤、葡萄汁和葡萄酒中具有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的一致性，表明δ87Sr/86Sr是研究葡萄酒起源中非常有價(jià)值的指紋[48]。如Marchionni等[49]利用TIMS測(cè)定6個(gè)不同農(nóng)場(chǎng)的巖石、土壤、葡萄、葡萄汁和葡萄酒中的87Sr/86Sr，研究發(fā)現(xiàn)87Sr/86Sr不會(huì)隨著時(shí)間的推移而改變，而是獨(dú)立于釀酒程序和年份。葡萄酒從葡萄園土壤中繼承鍶同位素組成，使87Sr/86Sr成為評(píng)估地理種源問題真實(shí)可靠和技術(shù)先進(jìn)的科學(xué)工具的首要候選。并且有數(shù)據(jù)顯示葡萄酒的同位素特征與土壤的生物可利用率密切相關(guān)，而與土壤的體積無關(guān)。

4 總結(jié)與展望

穩(wěn)定同位素用于葡萄酒產(chǎn)地溯源是基于同位素分餾原理所發(fā)展的一項(xiàng)新技術(shù)，歐盟已利用該技術(shù)在眾多葡萄酒及農(nóng)產(chǎn)品中進(jìn)行有效的產(chǎn)地溯源研究，證明該方法的有效性，并且利用穩(wěn)定同位素是一種直接、有效且影響因素較少的方法。穩(wěn)定同位素會(huì)受環(huán)境和氣候的影響，從而在不同產(chǎn)地之間表現(xiàn)出差異性，對(duì)葡萄酒產(chǎn)地形成有力的保護(hù)，有效維護(hù)葡萄酒市場(chǎng)，同時(shí)間接增加經(jīng)營(yíng)者的經(jīng)濟(jì)收入，提高葡萄酒消費(fèi)經(jīng)濟(jì)效益。為了更好的進(jìn)行有效產(chǎn)地溯源，將其與統(tǒng)計(jì)學(xué)中的分析方法（主成分分析、方差分析、聚類分析等）進(jìn)行結(jié)合，對(duì)維護(hù)葡萄酒市場(chǎng)秩序、確保生產(chǎn)者公平競(jìng)爭(zhēng)、增強(qiáng)消費(fèi)者對(duì)葡萄酒行業(yè)的信心并保護(hù)消費(fèi)者利益具有重要意義。