新視角探析微生物對葡萄酒品質(zhì)的影響

王偉雄，古麗米熱·祖努納，杜展成，劉秀海，盧丕超，武運*

（1. 新疆農(nóng)業(yè)大學食品科學與藥學學院，新疆烏魯木齊 830052；2. 新疆芳香莊園酒業(yè)股份有限公司，新疆和碩 841200；3. 吐魯番樓蘭酒莊股份有限公司，新疆鄯善 838200；4. 中信國安葡萄酒業(yè)股份有限公司，新疆烏魯木齊 830052）

關(guān)鍵字：釀酒酵母；非釀酒酵母；乳酸菌；混菌發(fā)酵；陳釀；發(fā)展趨勢

葡萄酒發(fā)酵并不是單一微生物的作用產(chǎn)物，而是多種微生物在葡萄酒釀造中互作的結(jié)果。葡萄酒作為產(chǎn)量最大的果酒，其釀造工藝的創(chuàng)新、本土酵母純化篩選、葡萄酒成分分析等都是熱門研究方向[1-2]。此外，有研究表明，葡萄酒發(fā)酵過程中微生物的相互作用可能會影響葡萄酒的感官特性[3]。釀酒酵母具有很強的嗜殺性，具有抵御外界微生物攻擊的能力；釀酒酵母還具有較高的耐受性，能夠在高滲透壓、高酸、高酒度等環(huán)境中正常生長繁殖，因此能保障葡萄酒發(fā)酵的順利完成[4]。自然發(fā)酵工藝被越來越多的釀酒師應(yīng)用，并發(fā)現(xiàn)葡萄品種的典型性需通過篩選的非釀酒酵母體現(xiàn)出來，通過本土酵母釀造的葡萄酒，更能突出葡萄酒的典型性[5]。乳酸菌在葡萄酒發(fā)酵過程中的應(yīng)用可以增加葡萄酒生物學穩(wěn)定性[6]，改變葡萄酒中的內(nèi)酯類、萜烯類、脂肪酸、酯類和高級醇等物質(zhì)成分的含量及平衡關(guān)系，對葡萄酒的風味起到修飾作用[7-8]。葡萄酒釀造過程中選擇合適的酵母菌及乳酸菌進行釀造，將會成為葡萄酒釀造領(lǐng)域的熱點問題。本文對釀酒酵母、非釀酒酵母，以及乳酸菌對葡萄酒品質(zhì)的影響進行綜述，并對混菌發(fā)酵進行展望，以期為葡萄酒釀造生產(chǎn)提供多種發(fā)酵策略。

1 釀酒酵母

1.1 釀酒酵母的種類

酵母菌的種類繁多，不同的科、屬具有不同的形態(tài)特征和生理生化特點，直接參與葡萄酒發(fā)酵的酵母菌屬有：羅氏酵母（Sac c haromyce s rosei）、裂殖酵母（Schizosaccharomyces）、類酵母（Saccharomycodes）、尚德酒星形球擬酵母（Torulopsis stellata）、德克酵母（Dekkera）、漢生酵母（Hansenula）、卵型酵母（Saccharomyce oviformis）、克勒克酵母（Kloeckera）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、酒香酵母（Brettanomyces）、葡萄酒酵母（Saccharomyce sellipsoideus）、檸檬形克勒克酵母（Kloeckeraanicnlata）、產(chǎn)酸酵母（Saccharomyces acidifaciens）、子囊菌綱酵母（Saccharomyces）等25個屬150多種[9-10]。

1.2 釀酒酵母的基本特性

1.2.1 釀酒酵母的嗜殺性

嗜殺性是指能有效抵御外界微生物攻擊的能力，釀酒酵母嗜殺性較強，對外界微生物抗干擾能力及抵御能力較強，對葡萄酒發(fā)酵起到保護作用[11]。嗜殺酵母是指在某些酵母繁殖和生長過程中，能抑制或殺死某些毒素蛋白[12]。毒素蛋白被稱為嗜殺毒素，嗜殺酵母對其自身分泌的嗜殺毒素具有免疫力[13]。

1.2.2 釀酒酵母能產(chǎn)生硫化氫

研究發(fā)現(xiàn)，釀酒酵母代謝產(chǎn)生的硫化氫主要發(fā)生在發(fā)酵過程中。含硫化合物是在葡萄酒生產(chǎn)中的一類污染物質(zhì)，揮發(fā)性較強且散發(fā)出不愉快的氣味，這些氣味通常被描述為洋蔥味、臭雞蛋味或大蒜味，對葡萄酒的香氣和風味產(chǎn)生了嚴重影響[14-15]。它與醇類物質(zhì)結(jié)合會形成具有毒性的硫醇，并且很難去除[16]。

1.2.3 釀酒酵母的絮凝性

酵母絮凝是無性聚集，它是由于細胞表面凝集素與細胞壁中甘露聚糖相互作用而產(chǎn)生[17]。而絮凝性是酵母在葡萄酒發(fā)酵過程中、細胞生長結(jié)束時或糖分耗盡后形成的絮狀物，并具有粘附成團狀化合物最終沉降的特性。在葡萄酒生產(chǎn)后期較強的絮凝性有利于葡萄酒澄清過濾[18]。

1.2.4 釀酒酵母的耐受性

釀酒酵母在高滲透壓環(huán)境下可以正常代謝，其具有快速轉(zhuǎn)化糖醇和快速繁殖能力，因此能夠在惡劣的發(fā)酵環(huán)境中生存[19]。隨著釀酒工業(yè)科技的發(fā)展，濃醪發(fā)酵新技術(shù)逐漸代替?zhèn)鹘y(tǒng)發(fā)酵技術(shù)，該新工藝下醪液中的酒精濃度和糖度較高，耐糖、耐酒精酵母的使用，對產(chǎn)品質(zhì)量提升具有重要意義[20]。

釀酒酵母在低pH環(huán)境下具有耐受性，在酸度較高的葡萄醪中可以完成正常發(fā)酵。相關(guān)研究表明，耐酸酵母的使用具有較高的市場應(yīng)用前景，除對低pH有耐受能力外，還可以在極低pH環(huán)境下正常繁殖代謝[21]。

低溫發(fā)酵對于提高葡萄酒品質(zhì)，增加葡萄酒香氣種類具有重要意義，是高品質(zhì)葡萄酒釀造以及冰酒釀造探尋的熱點問題。釀酒酵母對低溫的耐受力決定其在低溫環(huán)境中能否正常生長繁殖代謝，最終影響葡萄酒品質(zhì)。馮莉[22]對本土野生酵母進行篩選，對釀酒酵母低溫耐受性主效QTL定位得到主效基因，為釀酒酵母低溫耐受機理提供重要的理論依據(jù)。

在葡萄酒酒精發(fā)酵過程中，隨著酒精含量升高，酵母細胞膜的通透性也隨之發(fā)生改變，從而抑制酵母菌的正常生長繁殖，降低發(fā)酵速率，甚至會終止發(fā)酵[23]。釀酒酵母有較高的乙醇耐受性，可以保障酒精發(fā)酵的順利進行。

2 非釀酒酵母

2.1 非釀酒酵母的分類

非釀酒酵母包括很多不同的菌種。目前，從葡萄汁中分離出來的非釀酒酵母已超過40種，大致分為三類：（1）需氧型酵母，如畢赤酵母屬（Pichiaspp.）、假絲酵母屬（Candidaspp.）、紅酵母屬（Rhodotorulaspp.）等；（2）發(fā)酵能力較弱的酵母，如罕見有孢漢生酵母（Hanseniaspora occidentalis）；（3）在發(fā)酵過程中能有一定程度參與的酵母，如拜氏接合酵母（Zygosaccharomyces bailii）、戴爾有孢圓酵母（Torulaspora delbrueckii）[24]。

2.2 非釀酒酵母的來源及生存環(huán)境

非釀酒酵母廣泛存在，在葡萄園和果皮表面數(shù)量較多，在釀造環(huán)境中也有少量存在，它們會隨著漿果的破碎進入發(fā)酵設(shè)施然后參與發(fā)酵過程[26]。研究表明，在發(fā)酵過程中非釀酒酵母菌株種屬的差異也會導(dǎo)致各菌株生存狀況有差異。雖然葡萄汁營養(yǎng)豐富，能為非釀酒酵母提供一個良好的生長環(huán)境，但是發(fā)酵過程中的高滲透壓、低pH值和較高的SO2含量等條件，往往會成為影響非釀酒酵母菌細胞總數(shù)的主要因素[27]。在低溫條件下非釀酒酵母能保持較高的發(fā)酵能力，而高于25 ℃時則會抑制非釀酒酵母的生長[22]。

2.3 非釀酒酵母的作用

盡管釀酒酵母的使用為葡萄酒釀造提供諸多便利，但是隨著商業(yè)釀酒酵母大范圍的使用，單一使用商業(yè)釀酒酵母可降低葡萄酒發(fā)酵環(huán)境中生化反應(yīng)的復(fù)雜程度，會影響葡萄酒發(fā)酵環(huán)境中微生物多樣性，無法充分體現(xiàn)本土酵母對葡萄酒品質(zhì)的影響[28]。非釀酒酵母作為葡萄酒發(fā)酵前期的主要動力來源，其細胞總數(shù)在發(fā)酵前期甚至能夠超過釀酒酵母[29]。同時，非釀酒酵母在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的一些代謝產(chǎn)物會對葡萄酒最終的風味產(chǎn)生極大的影響[30]。一些非釀酒酵母可以生成更多的酯類、甘油、高級醇等具有提高香氣復(fù)雜性、降低酒精度以及豐富口感作用的代謝產(chǎn)物[31]。

綜上所述，非釀酒酵母在葡萄生長過程和葡萄酒釀造環(huán)境中廣泛存在，非釀酒酵母的使用逐漸成為葡萄酒釀造的熱點問題，但是非釀酒酵母在葡萄醪環(huán)境中生長緩慢，酒精轉(zhuǎn)化力較弱，利用非釀酒酵母純種發(fā)酵可能會導(dǎo)致葡萄酒發(fā)酵延滯[32]。由于商用釀酒酵母菌的種類比較單一，形成的代謝產(chǎn)物相似，尤其是風味化合物同質(zhì)化現(xiàn)象嚴重，降低果酒的口感以及風味復(fù)雜度，影響果酒的潛在多樣性，不能滿足消費者的多樣化需求[33]。

3 乳酸菌

蘋果酸-乳酸發(fā)酵（MLF）發(fā)生于葡萄酒酒精發(fā)酵（AF）的后期，其原理是雙羧基L-蘋果酸被蘋果酸-乳酸菌（MLB）產(chǎn)生的蘋果酸-乳酸酶（MLE）降解成CO2和單羧基的L-乳酸的過程[34]。乳酸菌是MLF過程中最相關(guān)的微生物類群之一。它們負責蘋果酸在MLF中的脫羧作用，MLF在大多數(shù)紅葡萄酒和少量白葡萄酒發(fā)酵中均有應(yīng)用[35]。

在MLF過程中，乳酸菌可分解蘋果酸，消耗細菌繁殖營養(yǎng)物質(zhì)，產(chǎn)生細菌素，從而抑制不良細菌生長，提高葡萄酒的生物學穩(wěn)定性，降低了其他微生物對葡萄酒的危害，避免葡萄酒在貯存陳釀期間發(fā)生再發(fā)酵，有利于葡萄酒長期貯存[36]。而且，MLF在乳酸菌的參與下，除帶來主要的感官感受（耗盡葡萄酒中的蘋果酸）外，MLF還可以通過釋放顯著濃度的二乙酰（2,3-丁二酮）和其他從檸檬酸中獲得的羰基化合物來改變葡萄酒的芳香特性，這些化合物賦予了葡萄酒黃油香氣。同時在MLF中發(fā)生的其他生化反應(yīng)也能提高葡萄酒的香氣質(zhì)量。蛋氨酸代謝、酯酶活性和一些涉及糖苷酶的轉(zhuǎn)化也在試驗中得到證實[37-38]。

乳酸菌發(fā)酵可以提高葡萄酒中氨基甲酸乙酯和生物胺的含量，使葡萄酒的安全性風險增加，部分釀酒酵母也會在發(fā)酵過程中生成有害代謝物，如氨基甲酸乙酯[33]。氨基甲酸乙酯（Ethyl Carbamate，EC）的致癌性已經(jīng)被證實，其多出現(xiàn)在發(fā)酵食品和飲料中，參與EC形成的主要化合物是酵母分解代謝精氨酸產(chǎn)生的尿素，但也有其他化合物，如瓜氨酸（由細菌代謝產(chǎn)生）。瓜氨酸由葡萄酒乳酸菌通過精氨酸脫亞胺酶途徑降解精氨酸而產(chǎn)生，因此經(jīng)MLF的葡萄酒中可以發(fā)現(xiàn)EC含量的升高[39]。乳酸菌產(chǎn)生生物胺被廣泛報道，Moreno-Arribas[40]分離的植物乳桿菌、希氏乳桿菌和短乳桿菌菌株，能夠在釀造條件下產(chǎn)生某些生物胺。由于存在這些產(chǎn)生生物胺的乳酸菌，因此經(jīng)過MLF的葡萄酒中可以發(fā)現(xiàn)生物胺水平的提高[41]。

乳酸菌在葡萄酒MLF中發(fā)揮著重大的作用，MLF在大部分紅葡萄酒和少部分白葡萄酒中均有應(yīng)用[35]。乳酸菌的參與可以增加葡萄酒的生物學穩(wěn)定性、修飾葡萄酒的風味[36]。但是，它的參與同樣會給葡萄酒帶來風險，例如，EC含量的升高和生物胺含量的提高[39]，如何保證MLF過程中葡萄酒質(zhì)量的安全性，將是未來研究的熱點方向。

4 發(fā)展趨勢

4.1 釀酒酵母與非釀酒酵母混合發(fā)酵

“非釀酒酵母”一詞過去曾被用來指在葡萄發(fā)酵成葡萄酒過程中具有次要相關(guān)性的一組物種，甚至被認為是腐敗有機體。最近，有研究發(fā)現(xiàn)，非釀酒酵母能在發(fā)酵中產(chǎn)生獨特的代謝物來提高葡萄酒的質(zhì)量，因此人們開始對其產(chǎn)生強烈期望并進行篩選來用作發(fā)酵劑[42]。然而，非釀酒酵母菌通常表現(xiàn)出較低的發(fā)酵性能，并且在整個發(fā)酵過程中無法在數(shù)量上占主導(dǎo)地位，且其對乙醇的耐受性較弱，故不可能在釀酒過程中完成酒精發(fā)酵。商用釀酒酵母菌的種類比較單一，形成的代謝產(chǎn)物相似，尤其是風味化合物，導(dǎo)致風味同質(zhì)化現(xiàn)象嚴重，降低果酒的口感以及風味復(fù)雜度，影響果酒的潛在多樣性，不能滿足消費者的多樣化需求[33]。因此，釀酒酵母與非釀酒酵母可作為共發(fā)酵劑接種，以發(fā)揮它們的積極作用，降低發(fā)酵停滯或發(fā)酵變質(zhì)的風險[43]。在葡萄酒生產(chǎn)中，將非釀酒酵母菌與釀酒酵母菌接種作為共發(fā)酵劑是一種很有前景的釀酒實踐，這種方式在酒窖中的應(yīng)用正在穩(wěn)步增加[42]。

不同種類的非釀酒酵母與釀酒酵母混合發(fā)酵對葡萄酒品質(zhì)的影響有明顯差異。例如，戴爾有孢圓酵母與釀酒酵母混合發(fā)酵提高了葡萄酒中某些酯類的含量，葡萄酒果香更加強烈[44]；美極梅奇酵母與釀酒酵母混合發(fā)酵使葡萄酒中乙酸異戊酯、苯乙醇等含量增加，賦予葡萄酒強烈的花香和水果香氣。研究表明，非釀酒酵母與釀酒酵母不同的接種方式會對葡萄酒品質(zhì)產(chǎn)生影響，通過改變接種比例，葡萄酒中的香氣成分會發(fā)生顯著變化[45]?；旌习l(fā)酵方式雖可以提高果酒的品質(zhì)，但特定非釀酒酵母在混合發(fā)酵中可能會引起其與釀酒酵母的拮抗作用，積累一些不理想代謝物[46]。

4.2 酵母菌與乳酸菌混合發(fā)酵

酵母菌與乳酸菌共發(fā)酵生產(chǎn)酒類飲料時，由于菌種間的協(xié)同作用，會產(chǎn)生有機酸、醇類、酯類等化合物，產(chǎn)物要比純種發(fā)酵更加豐富，賦予葡萄酒更加復(fù)雜的香氣和口感。王嘉偉[47]在蘋果酒發(fā)酵過程中同時接種乳酸菌與酵母菌進行共發(fā)酵，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乳酸菌與酵母菌共發(fā)酵能降低果酒總酸含量，增加果酒的柔和指數(shù)，口感和香氣質(zhì)量有明顯提升。將乳酸菌與商業(yè)葡萄酒酵母同時接種發(fā)酵葡萄酒，通過測定活菌數(shù)、蘋果酸和揮發(fā)性風味物質(zhì)等來研究共發(fā)酵對葡萄酒質(zhì)量的影響，結(jié)果顯示葡萄酒的發(fā)酵周期縮短，發(fā)酵后由于丁二酸二乙酯和乳酸乙酯的生成使得葡萄酒具有黃油和奶油香味[48]。

4.3 微生物與葡萄酒陳釀

陳釀是某些葡萄酒最終風味的關(guān)鍵步驟。在使用橡木桶作為陳釀容器時，與木材有關(guān)的芳香物質(zhì)會轉(zhuǎn)移到葡萄酒中影響酒的風味。揮發(fā)性化合物主要是從橡木中提取的，如麝香木酚[49]。除了陳釀容器對葡萄酒品質(zhì)的影響外，一些微生物衍生化合物，如多糖、游離氨基酸和肽，也可能對葡萄酒的成分產(chǎn)生影響[50-51]。這些化合物是從死亡酵母菌和細菌細胞中提取的，在分解過程中也能釋放一些活性酶，在陳釀過程中不斷改變葡萄酒的風味。因此，在葡萄酒陳釀過程中使用酒糟是一種改變葡萄酒成分的有效方式。酒糟陳釀在許多葡萄酒生產(chǎn)領(lǐng)域越來越受到重視[52]。然而，長時間的陳釀并不是沒有變質(zhì)的風險，因為耐乙醇物種的作用，如布魯氏菌（Brettanomyces bruxellensis）可以產(chǎn)生大量的乙基酚，這是產(chǎn)生令人不快的酒香和藥味的原因[53]。

5 展望

在葡萄酒傳統(tǒng)釀造工藝中，普遍采用商業(yè)釀酒酵母參與葡萄酒發(fā)酵，不可避免地出現(xiàn)葡萄酒風味同質(zhì)化現(xiàn)象。我國本土酵母資源豐富，在釀酒中使用本土酵母，可以體現(xiàn)葡萄酒的產(chǎn)區(qū)特色。但是對本土葡萄釀酒微生物的選育研究仍然沒有全面展開，應(yīng)用于工業(yè)發(fā)酵的本土酵母菌株少之甚少，因此加強本土釀酒酵母選育是未來研究的方向。釀酒師期望在陳釀過程中運用酒糟來改變葡萄酒的風味，這一新的嘗試會提高葡萄酒品質(zhì)，但是酒糟給葡萄酒帶來的負面影響還應(yīng)該深入研究。對于葡萄酒混菌發(fā)酵的研究多數(shù)還停留在混菌發(fā)酵對葡萄酒品質(zhì)方面的影響，酵母菌與乳酸菌的混合發(fā)酵具有縮短發(fā)酵周期，降低總酸含量，改善葡萄酒香氣等特點。發(fā)酵過程中有害物質(zhì)產(chǎn)生的機理尚不明確，關(guān)于各個菌種之間的相互作用目前尚不清晰。未來，隨著菌與菌之間的細胞生物學、生物化學、分子生物學等各方面研究的不斷深入，結(jié)合蛋白組學、宏轉(zhuǎn)錄組學和代謝組學技術(shù)，有望揭示葡萄酒中各個微生物的交互作用及作用機理，為創(chuàng)制新型多樣化葡萄酒奠定基礎(chǔ)。