非常規(guī)樣本在免疫抑制劑治療藥物監(jiān)測中的應用進展

張瑞霞，張弋（天津市第一中心醫(yī)院藥學部，天津 300192）

人體實體器官移植經(jīng)過60 多年的發(fā)展，在全世界挽救了許多的生命。維持移植后器官的功能是至關重要也是最為艱難的一步，免疫抑制劑通過對免疫系統(tǒng)的抑制作用可以避免移植物的不適當自我排斥反應，極大地提高了患者移植物的存活率。臨床常用的免疫抑制劑如他克莫司、環(huán)孢素、霉酚酸等由于其具有個體間及個體內(nèi)差異大、治療窗窄等特點，標準劑量的治療并不適用，對其進行治療藥物監(jiān)測 （therapeutic drug monitoring，TDM）尤為重要。

目前在臨床，免疫抑制劑TDM 通常是根據(jù)移植物的類型和使用的免疫抑制劑進行血藥谷濃度分析。其治療范圍是根據(jù)療效和毒性確定的，既確保有效預防排斥反應同時避免藥物毒性。也有研究建議監(jiān)測藥時曲線下面積［1-3］，通過這種強化的TDM可以減少急性移植物排斥反應。但是盡管如此， 在移植后的前兩年，急性排斥率仍然很高 （約8% ～ 15%，最高可達30%）［4-5］。而且器官移植患者進行免疫抑制治療是一個長期的過程，研究其他與療效與毒性相關性更好的、更方便的監(jiān)測方法可以減少患者的疼痛，增加患者依從性。本文對非常規(guī)樣本在免疫抑制劑治療藥物監(jiān)測中的應用進展做一綜述，以期為尋找更適用于臨床的免疫抑制劑TDM 方案提供思路與幫助。

1 細胞內(nèi)免疫抑制劑濃度測定

1.1 外周血單核細胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC）血藥濃度：淋巴細胞是免疫抑制藥物的作用靶細胞。鈣調(diào)磷酸酶抑制劑（calcineurin inhibitor，CNI）通過與細胞內(nèi)特異的結合蛋白形成復合物競爭性與鈣調(diào)磷酸酶結合抑制其作用。依維莫司和西羅莫司抑制哺乳動物雷帕霉素靶蛋白。霉酚酸抑制鳥嘌呤核苷酸的經(jīng)典合成途徑，從而干擾DNA 的合成。所有這些抑制機制都發(fā)生在淋巴細胞中。因此，研究PBMC 中藥物濃度理論上可以更好地預測藥物的療效和毒性。

目前已有多篇研究測定了他克莫司在PBMC中的濃度，但是大部分僅限于方法學的建立，僅有少數(shù)闡述了其濃度與排斥反應之間的關系。 Capron 等［6］最早在2009 年建立了LC-MS/MS 測定他克莫司PBMC 濃度的方法，他克莫司在腎移植患者（n ＝65）中PBMC 谷濃度范圍為6 ～ 179 pg/106cell，同時研究還證實他克莫司全血濃度與PBMC 濃度之間的相關性較差。相似的結論在在肝移植患者［7］和心臟移植患者［8］中也得到了證實。但是也有研究［9］認為在移植功能處于穩(wěn)定狀態(tài)的患者，全血濃度與PBMC 濃度具有顯著的相關性 （r ＝0.67，P ＜0.001）。對于影響PBMC 中他克莫司濃度的因素，Capron 等［10］證實存在于淋巴細胞中的ABCB1 以及CYP3A5 多態(tài)性會影響他克莫司在PBMC 中的藥代動力學，這也可能是導致全血中藥物濃度與PBMC 濃度相關性較差的原因。該團隊還通過對比在肝移植人群中發(fā)生排斥與非排斥組中他克莫司PBMC 中的濃度差異證實了測定PBMC濃度的潛在臨床意義。在這項研究中，作者共納入90 例只接受他克莫司治療的成人肝移植受者，在第1、3、5 和7 天監(jiān)測全血和PBMC 中他克莫司濃度，并在第7 天進行肝組織活檢以評估是否發(fā)生排斥反應并計算BANFF 評分［7］。研究中分別有 37 例（41.1%）出現(xiàn)組織學排斥反應，12 例（10.8%）患者出現(xiàn)臨床排斥反應（需要治療的患者）。組織學排斥患者組的PBMC 他克莫司濃度顯著低于未發(fā)生排斥組患者，但兩者全血濃度沒有差異。兩組PBMC中他克莫司濃度在第3天分別為（21.6±16.3） 和（78.6±36.5） pg/106cell，第5 天為（27.6±12.2）和（83.8±32.6） pg/106cell，第7 天為（33.8±16.7）和（90.9±41.2） pg/106cell。而臨床排斥患者中的他克莫司濃度也顯著低于第7 天沒有臨床排斥的患 者， 分 別 為（22.2±6.1）pg/106cell 和（48.7± 11.9） pg/106cell。此外，研究還證實PBMC 中的他克莫司濃度越低，第7 天的BANFF 評分越高（r ＝0.90，P ＝0.0013）。相反，在第7 天他克莫司全血濃度與BANFF 評分之間沒有相關性。

對環(huán)孢素在PBMC 中的濃度研究也較多， 最早在2007 年已有液質(zhì)聯(lián)用測定PBMC 中環(huán)孢素濃度的報道［11］。對于環(huán)孢素血藥濃度與PBMC濃度之間相關性以及ABCB1 基因多態(tài)性對其濃度的影響在各個研究結果中有所差異。Ansermot 等［12］測定了19 例健康志愿者PBMC 中環(huán)孢素的藥代動力學曲線，研究結果顯示環(huán)孢素血藥濃度與PBMC 濃度無相關性（P ＝0.71），且ABCB1 基因多態(tài)性對環(huán)孢素在PBMC 中的濃度的影響也較小。Crettol 等［13］測定了64 例腎、肝或肺移植受者ABCB1 基因型、環(huán)孢素PBMC 和血藥濃度。研究結果顯示環(huán)孢素PBMC 濃度與血藥濃度呈中度相關 （r ＝0.30，P ＜0.00005）。ABCB1 1199A 攜帶者的環(huán)孢素PBMC 內(nèi)濃度與非攜帶者相比降低了1.8 倍 （P ＝0.04），而3435T 攜帶者的血藥濃度增加了 1.7 倍（P ＝0.02）。對于評估測定環(huán)孢素PBMC 濃度的臨床價值，F(xiàn)alck 等［14］評估了20 例腎移植患者T 淋巴細胞中環(huán)孢素濃度和全血濃度，其中有7 例患者出現(xiàn)急性排斥反應，在發(fā)生排斥反應前3 d 檢測到患者中細胞內(nèi)環(huán)孢素濃度顯著下降，而全血濃度無明顯變化。由此可證明測定PBMC 中環(huán)孢素濃度具有潛在的臨床價值。

對于西羅莫司和依維莫司在PBMC中濃度的研究相對較少，目前僅有少量方法學報道。Masri 等［15］研究了42 例成人腎病患者給藥前、給藥后1 h 和2 h 的3 個不同時間全血和淋巴細胞西羅莫司濃度。結果描述了T0、T1和T2的細胞內(nèi)濃度與淋巴細胞計數(shù)之間呈負相關，未描述血液和細胞內(nèi)西羅莫司水平之間的相關性。Rheil 等［16］建立了LC-MS/MS 方測定PBMC 依維莫司濃度的方法。該測定法被應用于36 例成人心臟移植患者。依維莫司在PBMC 濃度約40 ～ 470 pg / 106cell，與血液濃度具有顯著相關性（r ＝ 0.558，P ＝0.0002）。除此之外Robertsen 團隊［17］在11 例腎移植受者的研究也發(fā)現(xiàn)依維莫司全血和PBMC 中的AUC0-12h表現(xiàn)出強烈的相關性（r ＝0.90，P ＜0.01）。ABCB1 基因多態(tài)性對全血和PBMC 中依維莫司濃度無影響。

霉酚酸是次黃嘌呤單核苷酸脫氫酶（inosine monophosphate dehydrogenase，IMPDH）的選擇性可逆抑制劑，對其PBMC 中濃度的研究［18］發(fā)現(xiàn)，血漿和PBMC 霉酚酸濃度之間存在顯著相關性（P ＜0.05），IMPDH 活性與霉酚酸血漿濃度之間的相關性比PBMC濃度更好（P＜0.01比P＞0.05）。 該結果不支持霉酚酸PBMC 濃度比血漿濃度具有更好預測療效的價值。

從上述的數(shù)據(jù)可看出對于鈣調(diào)磷酸酶抑制劑PBMC 濃度比全血濃度預測排斥反應更有潛力， 而mTOR 抑制劑（西羅莫司、依維莫司）和抗代謝物（霉酚酸）則未找到相關證據(jù)支持測定PBMC濃度的價值。但是目前的所有的研究結果均來自單中心、小群體，還需要大型和多中心臨床試驗來確認這些觀察結果。

1.2 組織中藥物濃度測定：除研究PBMC 中濃度外，還有不少團隊研究了測定移植物細胞中的免疫抑制劑濃度。早在1992 年Sandborn 團隊［19］就研究了在肝移植患者（n ＝21）中環(huán)孢素在肝細胞組織中的濃度，結果發(fā)現(xiàn)細胞中環(huán)孢素濃度越低， 排斥反應的可能性越大，而血藥谷濃度與排斥反應相關性較差。Hanas 等［20］在腎移植患者中也得到了相似的結論。

對于他克莫司，Sandborn 等［21］測定了肝移植患者中經(jīng)肝活檢確認排斥的患者（n ＝7）與非排斥組（n ＝10）全血與肝細胞中他克莫司濃度， 發(fā)現(xiàn)非排斥組肝細胞藥物濃度顯著高于排斥組， 144 ng/g 比48 ng/g（P ＝0.02）。同時作者提出他克莫司肝組織濃度為100 ng/g 可作為預測排斥的閾值濃度（敏感度：78%，特異性：72%）。但本研究采用了免疫測定法，與他克莫司代謝物有潛在的交叉反應，特別是在肝組織中，因此測定結果可能偏高。Capron 等［22］開發(fā)了一種特異性和靈敏度均較高的LC-MS/MS 方法測定肝細胞中他克莫司濃度，其最低定量限為5 pg/mg。共測定146 例 肝移植患者，肝細胞藥物濃度范圍分布在5 ～ 387 pg/mg，全血藥物濃度范圍分布為2.7 ～ 19.3 ng/ml。根據(jù)BANFF 評分評估排斥反應與全血藥物濃度和肝細胞藥物濃度的相關性，肝組織藥物濃度與其具有顯著的相關性。他克莫司細胞濃度＜30 ng/g 預測排斥反應敏感性為89%，特異性為98%。雖然目前的研究結果更支持測定移植物中細胞濃度來預測排斥反應。但是測定移植物濃度需要有創(chuàng)性操 作，在臨床推廣尚存在困難。

2 游離藥物濃度

藥物進入體內(nèi)，部分與血漿蛋白、組織蛋白或體內(nèi)大分子物質(zhì)形成復合物，也有部分呈游離狀態(tài)。只有游離的藥物才有藥理活性，才能在體內(nèi)分布和消除，因此監(jiān)測游離藥物濃度比全血總藥物濃度能更好地反映療效。免疫抑制劑蛋白結合率均較高，評估其游離藥物濃度與療效和毒性之間的相關性可能更有臨床價值。在血液循環(huán)中，他克莫司主要位于紅細胞內(nèi)或與血漿蛋白結合，僅有少于1%的游離藥物。Zahir 等［23］在40 例肝移植受者中研究了他克莫司在血液中的分布情況。發(fā)現(xiàn)游離他克莫司濃度在發(fā)生排斥反應與未發(fā)生排斥反應的患者相比具有顯著性差異，（0.24±0.08） ng/L 比（0.42± 0.21）ng/L，P ＜0.001，但是兩組之間全血總濃度無差異。該研究證實游離他克莫司濃度可以更好地預測臨床療效，但由于復雜的分析技術，作者未進行大樣本研究。近幾年，有研究建立了操作較簡單的LC-MS/MS 方法，將有望進一步推動對游離他克莫司濃度與臨床療效之間關系的研究［24-25］。

除了他克莫司外，還有研究［6］建立了環(huán)孢素和霉酚酸游離藥物濃度測定的方法學，但未對其臨床意義進行評估。Atcheson 團隊［27］觀察到腎移植患者中血漿白蛋白減少和游離霉酚酸增加 （＞3%）之間存在顯著關系，建議低蛋白血癥患者應監(jiān)測霉酚酸游離藥物濃度。隨后該團隊發(fā)現(xiàn) 出現(xiàn)血小板較少、白細胞減少或者感染的患者，游離霉酚酸血藥濃度-時間曲線下面積（area under concentration-time curve， AUC）值會偏高［28］。Weber 等［29］也得出相似的結論，發(fā)現(xiàn)當游離霉酚酸AUC ＞0.4 mg/（h ?L）時，會增加白細胞減少和感染的風險。因此游離霉酚酸暴露量對預測藥品不良反應發(fā)生的風險比血漿總濃度更有意義。

3 干紙片法（dried blood spot，DBS）

干紙片法是近年來興起的一種新型采樣方法?；颊呓?jīng)簡單的培訓后可自行在家采集血液滴在采樣卡上，晾干，將樣品郵寄到實驗室進行測定。DBS與傳統(tǒng)靜脈穿刺抽血相比，無需專業(yè)操作，取血量少，比全血更為穩(wěn)定，便于儲存及運輸。因此對于需頻繁監(jiān)測免疫抑制劑血藥濃度的移植患者具有極大的應用前景。但是在研究過程中發(fā)現(xiàn)DBS 在某些患者上并不能達到預期的結果。

Koster 等［30］開發(fā)了一種同時分析DBS 樣本中他克莫司、環(huán)孢素、西羅莫司、依維莫司的 LC-MS/MS 方法。DBS 樣品中四種免疫抑制劑在22℃下至少7 d 穩(wěn)定。血細胞比容對分析結果具有顯著影響，追其原因可能是由于紅細胞的增加，較高的血細胞比容樣品更黏稠，在紙上的滲透性較差。 因此，不同血細胞比容可以形成不同大小的斑點。盡管如此，評估患者靜脈全血和靜脈DBS 樣本之間相關性，r 為0.87，相關性良好，DBS 方法可用作治療藥物監(jiān)測中全血分析的替代方法。

除血細胞比容外，研究還發(fā)現(xiàn)多種參數(shù)也會影響DBS 的準確度。Adrian 等［31］共對21 篇有關測定DBS 中免疫抑制劑影響因素的文章進行了分析總結，發(fā)現(xiàn)有7 篇（33%）研究了DBS 血斑體積的影響，14 篇（66%）研究了免疫抑制劑在 DBS 中的穩(wěn)定性，9 篇（42%）研究了血細胞比容的影響，3 篇（14%）研究了血液沖擊位置對其的影響?？偨Y發(fā)現(xiàn)他克莫司DBS 樣本不受血斑體積、血細胞比容、血斑不均勻性和干燥時間的影響，溫度對其影響也較小。因此測定他克莫司DBS樣本具有可行性。西羅莫司和依維莫司比他克莫司更容易受血細胞容積的影響，Koster 等［32］發(fā)現(xiàn)在20%血細胞比容和高分析物濃度（40 μg/ L）時西羅莫司和依維莫司存在顯著偏差（分別為-20%和-28%）。兩者在高溫中穩(wěn)定性也較差，西羅莫司在60℃下24 h 內(nèi)出現(xiàn)降解［33］，依維莫司在70℃時在DBS 中不穩(wěn)定［34］。因此西羅莫司與依維莫司DBS 樣品在臨床的應用還需要進一步驗證。

目前報道的大多數(shù)研究是在受控環(huán)境中進行的，并且側(cè)重于分析性能。通常由實驗室技術人員將靜脈樣本滴在采樣卡上，而不是真正的毛細管取樣。結果可能低估了毛細管取樣時的因素的影響。Al-Uzri 等［35］評估了家庭采用DBS 監(jiān)測他克莫司和肌酐的可行性，發(fā)現(xiàn)只有80%的血斑符合分析要求，且只有38%的樣本是在正確的時間抽取的。一項針對50 歲以上女性人群進行的家庭自我取樣的可行性試驗報告，發(fā)現(xiàn)只有74.1%的樣本符合取樣標準［36］。因此，DBS 在臨床的應用還面臨著諸多挑戰(zhàn)，仍需進一步對其影響因素進行分析及優(yōu)化。如何對患者進行培訓也是面臨的挑戰(zhàn)之一。

4 其他生物標本

器官移植患者接受免疫抑制治療是一個長期的過程，患者需頻繁抽取血液測定免疫抑制劑藥物濃度。因此尋找一種無創(chuàng)、方便易得、與療效和毒性相關性較好的基質(zhì)替代全血藥物濃度測定可極大地提高患者依從性和舒適度。目前已有測定唾液、 毛發(fā)和膽汁等標本中免疫抑制劑濃度的報道。

Belostotsky 等［37］研究了使用LC-MS/MS 方法測定唾液和全血他克莫司濃度之間是否存在相關性。研究測定了37 例兒童腎移植患者共77 例樣本， 結果發(fā)現(xiàn)唾液中他克莫司濃度為0 ～ 0.7 μg/L， 血液和唾液中他克莫司濃度之間的皮爾遜積矩相關系數(shù)僅為0.36，相關性較差。但Ghareeb 等［38］則得出相反的結論，其測定了46 例成人腎移植受者漱口后唾液樣本中他克莫司濃度，其與全血中藥物濃度相關系數(shù)可達0.71（P ＝0.001）。他克莫司在唾液中的分布具有延遲現(xiàn)象，多變量方差分析顯示唾液中的他克莫司濃度與全血中他克莫司濃度、 血漿結合蛋白有關。因此該研究認為測量漱口后唾液中的他克莫司濃度可作為預測全血中他克莫司濃度的可行且非侵入性的方法。Wiesen 等［39］開發(fā)了一種LC-MS/MS 方法同時測定唾液和血漿中的霉酚酸及其代謝產(chǎn)物，并在小兒腎移植患者中驗證了該方法的適用性，發(fā)現(xiàn)霉酚酸唾液和血漿濃度具有良好的相關性。

Müller 等［40］開發(fā)了測定環(huán)孢素頭發(fā)樣本的分析方法，以評估檢測頭發(fā)中藥物含量是否可用于肝移植患者的長期隨訪。其采集了肝移植術后環(huán)孢素治療患者的毛發(fā)樣品，通過LC-MS/MS 分析環(huán)孢素濃度。結果發(fā)現(xiàn)環(huán)孢素毛發(fā)濃度和其劑量之間的相關性很差。因此采用測量毛發(fā)中環(huán)孢素濃度替代全血濃度監(jiān)測可行性不高。

對于肝移植患者在術后一周可能會在膽管放置T 管引流，因此測定術后早期膽汁中藥物濃度也是一種無創(chuàng)手段。Boudjema 等［41］建立了LC-MS/MS 測定膽汁中他克莫司濃度的方法，線性范圍為 0.5～20 ng/ml，共評估30 例肝移植受者膽汁中的他克莫司濃度與全血濃度之間的相關性。發(fā)現(xiàn)經(jīng)過12 h 膽汁排泄的他克莫司濃度與全血濃度之間沒有相關性。Rayar 等［42］評估了41 例肝移植患者他克莫司膽汁中濃度、PBMC 中濃度和全血中濃度之間的相關性。經(jīng)多變量分析發(fā)現(xiàn)他克莫司膽汁濃度與PBMC 濃度具有一定相關性（r ＝0.25，P ＝0.007），PBMC 中濃度和全血中濃度相關性更優(yōu)（r ＝0.53，P ＜0.001）。同時研究還發(fā)現(xiàn)在開始他克莫司治療開始后第2 天，其膽汁中濃度低于0.20 ng/ml 可作為發(fā)生神經(jīng)毒性的良好預測標志物（AUC ＝0.81）。綜上，膽汁中他克莫司濃度與排斥反應和毒性的相關性值得進一步研究，但是膽汁引流僅在部分患者術后早期進行，因此其臨床應用存在局限。

5 總 結

非常規(guī)樣本在免疫抑制劑治療藥物監(jiān)測中的應用仍處于摸索階段，雖然目前有不少研究結果顯示部分非常規(guī)樣本與排斥反應有更好的相關性，具有替代全血藥物濃度監(jiān)測的潛力。但是本文提到的數(shù)據(jù)均來自小樣本、單中心的研究，還需要大規(guī)模的臨床試驗進行驗證。但是通過對這些非常規(guī)樣本的研究，可以為我們未來的免疫抑制劑TDM 提供新的思路和方式，我們期待未來可以探索出更好的、適用于臨床的TDM 方案。