微小肝癌早期診斷關(guān)鍵分子的研究進(jìn)展

楊 靜，曹憲炳，連鎮(zhèn)炎，周旭洋，張?jiān)娪?，?寧，方馳華

1南方醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510282；2廣東省數(shù)字醫(yī)學(xué)臨床工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州510282

肝癌在全球常見癌癥的發(fā)生率中位列第7，且發(fā)病率有逐年上升趨勢[1]，具有起病隱匿、發(fā)展迅速、死亡率高的特點(diǎn)，其標(biāo)準(zhǔn)化5年相對生存率僅有10.1%[2]。大多數(shù)患者在臨床就診時(shí)已是晚期，因此早期診斷和治療就成為提高患者生存期最有效的手段。目前肝癌常規(guī)的早期篩查與診斷手段是檢測血清中甲胎蛋白和利用超聲，但其在敏感性和特異性方面都存在著不足，故尋找新的診斷方法是我們急需解決的難題。而微小肝癌早期診斷相關(guān)的關(guān)鍵分子在特異性和敏感性有著獨(dú)特的優(yōu)勢，且對治療也有一定的可行性。本文對部分微小肝癌早期診斷相關(guān)關(guān)鍵分子進(jìn)行綜述。

1 Prox1

1996年，有學(xué)者首次分離了人類Drosophilia看家基因（homeobox）prospero，目前稱為Prox1[3]。Prox1為果蠅的同源異型盒基因prospero在哺乳動物中的同源框基因轉(zhuǎn)錄因子，人類Prox1基因位于人染色體1q32.2～q32.3。該基因長度約為40 000，至少含有5個(gè)外顯子，編碼83000蛋白。

目前有不少研究表明，Prox1可在多種實(shí)體瘤中表達(dá)。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)Prox1在原發(fā)性肝癌及正常肝組織中均有表達(dá)，但高表達(dá)于正常肝組織中，同時(shí)Prox1表達(dá)與腫瘤分化程度有關(guān)，分化程度越高，表達(dá)越高[4]。由此可以推測Prox1的缺失可能導(dǎo)致肝臟腫瘤由良性向惡性進(jìn)展。

一方面，有研究證實(shí)Prox1是肝癌血管生成的驅(qū)動因素，Prox1通過NF-?B信號的激活以及對IL-8的選擇性激活來促進(jìn)肝癌血管生成，從而提示抗IL-8抗體可能是治療高Prox1表達(dá)的肝細(xì)胞性肝癌（HCC）的有效藥物[5]。另一方面，Prox1在腫瘤的淋巴道轉(zhuǎn)移的研究中有參考價(jià)值。Prox1是淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞特異性分子和表型標(biāo)記，功能突出體現(xiàn)在促進(jìn)或抑制淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞增殖運(yùn)動，是與腫瘤良惡性質(zhì)和淋巴道轉(zhuǎn)移潛能相關(guān)的重要檢測指標(biāo)[6]。有研究表明Prox1可通過上調(diào)缺氧誘導(dǎo)因子-1α表達(dá)，來促進(jìn)肝癌淋巴道轉(zhuǎn)移[7]。此外，Prox1上調(diào)HIF-1a的表達(dá)及誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化[8]。

綜上所述，Prox1對肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移具有促進(jìn)作用，但目前機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。目前對于Prox1在肝癌其他方面的研究比較缺乏，有學(xué)者分析TCGA數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，TERT和Prox1的表達(dá)水平在食管癌、肺癌和黑色素癌中存在相關(guān)性[9]，但這種相關(guān)性在以前的肝癌中沒有觀察到；此外，TERT表達(dá)是一個(gè)可靠的預(yù)后標(biāo)志，雖然TCGA數(shù)據(jù)分析表明在包括肝癌在內(nèi)的大多數(shù)癌癥中，Prox1沒有預(yù)后價(jià)值，但由于在某些癌癥中，TERT和Prox1的表達(dá)呈正相關(guān)，提示Prox1可能調(diào)節(jié)了TERT的表達(dá)。近來有研究表明，有TERT啟動子突變的B型肝癌患者的TERT mRNA表達(dá)低于無TERT啟動子突變的B型肝癌患者，也就是說，TERT啟動子突變明顯增強(qiáng)了肝癌細(xì)胞系的轉(zhuǎn)錄活性。有研究通過鑒別發(fā)現(xiàn)Prox1對突變的TERT有特別強(qiáng)的結(jié)合親和力，并通過數(shù)據(jù)表明B型病毒性肝癌患者TERT上調(diào)的主要機(jī)制，其基礎(chǔ)是HBx抑制PROX1依賴的轉(zhuǎn)錄激活[10]。因此，對Prox1在肝癌中的研究對于肝癌的診斷以及靶向治療都有一定前景，同時(shí)通過與其他癌癥中的Prox1作比較可為研究Prox1在肝癌中的應(yīng)用價(jià)值提供方向。

2 Glypican-3（GPC-3）

GPC-3是癌胚蛋白的一種，為Glypican的6個(gè)亞型之一，屬于硫酸乙酰肝素聚糖跨膜蛋白家族，并通過糖基化磷脂酰肌醇錨定在細(xì)胞膜的胞外側(cè)。GPC-3在Arg358和Ser359之間被類呋喃轉(zhuǎn)化酶內(nèi)切，產(chǎn)生一個(gè)40 kDa的N-末端亞基和一個(gè)橋接有兩條HS側(cè)鏈的30 kDa的C-末端亞基，兩亞基之間靠二硫鍵相連[11]。

近年來，GPC-3因其敏感性達(dá)到82.5%、特異性達(dá)到57.8%而成為免疫組化診斷標(biāo)志物，在HCC免疫病理學(xué)的診斷價(jià)值得到公認(rèn)，并納入《原發(fā)性肝癌規(guī)范化病理診斷指南（2015 年版）》[12]、《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范（2017年版）》[13]、《2018年歐洲肝病學(xué)會臨床實(shí)踐指南：肝細(xì)胞癌的管理》[14]等規(guī)范或指南中。應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測肝癌患者血清GPC-3水平，發(fā)現(xiàn)肝癌患者報(bào)告的陽性病例占比為36.1%～95%[15]。

GPC-3與HCC相關(guān)的證據(jù)有很多，大部分來自體內(nèi)和體外的癌癥模型。目前，我們已從HCC患者檢測到多種形式的分泌型GPC-3，但GPC-3從細(xì)胞膜上脫落的機(jī)制仍待進(jìn)一步研究。研究顯示，在正常成人肝臟中未檢測到GPC-3的表達(dá)，而HCC患者血清和腫瘤組織中，GPC-3蛋白和基因的表達(dá)水平高于健康或非惡性肝組織[16]；GPC-3的表達(dá)區(qū)分了甲胎蛋白（AFP）陰性的肝癌和良性結(jié)節(jié)[17]；此外，GPC-3基因敲除可抑制肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲，提示GPC-3參與了肝癌的轉(zhuǎn)移和侵襲等[18]。具體來說，GPC-3通過增加Wnt在細(xì)胞膜上的含量，與Wnt及其受體Frizzled結(jié)合，促進(jìn)和穩(wěn)定Wnt與其受體Frizzled的相互作用，這種結(jié)合作用誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子β-catenin的積累，該轉(zhuǎn)錄因子隨后遷移到細(xì)胞核并驅(qū)動幾個(gè)基因的表達(dá)，其中一些基因參與促進(jìn)細(xì)胞的增殖和存活[19]。雖然目前有大量文獻(xiàn)顯示GPC-3可以作為HCC高度特異性診斷標(biāo)記物，但是由于HCC的高度異質(zhì)性，最佳檢測方案將基于同時(shí)測量至少兩個(gè)高度特異的組織標(biāo)志物（基于針刺活檢），并且建議檢測含3種標(biāo)志物的診斷小組。GPC-3與熱休克蛋白70和谷氨酰胺合成酶聯(lián)合應(yīng)用最多，診斷肝癌的敏感性為58.7%～72%，特異性為100%[20]。

由于GPC-3在癌前肝細(xì)胞中的表達(dá)以及獨(dú)特的定位和翻譯后修飾，同時(shí)它又實(shí)現(xiàn)結(jié)合其膜形式從而抑制其活性，是抗體治療的理想靶點(diǎn)。針對GPC-3的各種免疫治療正在研究之中，包括GPC-3靶向抗體治療、肽/DNA疫苗治療、免疫毒素和基因治療，實(shí)現(xiàn)早期干預(yù)和治療[21]。

3 上皮細(xì)胞黏附因子（EpCAM）

HCC首選的治療方式是手術(shù)切除，然而術(shù)后的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移發(fā)生率高，使其遠(yuǎn)期生存率不理想，而腫瘤干細(xì)胞是腫瘤組織中極少的具有自我更新能力和多向分化潛能的細(xì)胞亞群,腫瘤干細(xì)胞的存在是腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和產(chǎn)生放化療抵抗的重要原因[22]。EpCAM是腫瘤干細(xì)胞的重要表面標(biāo)記物[23]，它是一種跨膜糖蛋白，與細(xì)胞粘附、遷移和增殖等密切相關(guān)，作用機(jī)制主要是通過與整聯(lián)蛋白β1結(jié)合，進(jìn)而通過細(xì)胞外基質(zhì)粘附來調(diào)節(jié)FAK/ERK信號通路，實(shí)現(xiàn)其生理功能[24]。研究表明術(shù)前外周血EpCAM陽性HCC細(xì)胞數(shù)目2個(gè)的患者較術(shù)前EpCAM陽性HCC細(xì)胞數(shù)目＜2個(gè)的患者具有更高的早期復(fù)發(fā)率，術(shù)前EpCAM陽性HCC細(xì)胞數(shù)目2個(gè)是患者術(shù)后HCC復(fù)發(fā)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[25]。

在激光消融過程中，納米系統(tǒng)能夠有效識別EpCAM并將肝癌干細(xì)胞殺死[26]，不僅如此由于Wnt/β-連環(huán)蛋白信號傳導(dǎo)使得肝癌干細(xì)胞具有較強(qiáng)的侵襲性與致瘤性，所以基于RNA干擾的阻滯Wnt/β-連環(huán)蛋白信號傳導(dǎo)成分-EpCAM可有效減弱肝癌干細(xì)胞的活性[27]，進(jìn)而降低肝細(xì)胞癌進(jìn)行切除術(shù)后的復(fù)發(fā)率。EpCAM作為腫瘤干細(xì)胞的重要表面標(biāo)記物，其作用得到學(xué)界認(rèn)可，被納入《循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測在肝細(xì)胞肝癌中的研究應(yīng)用現(xiàn)狀專家共識（2019）》、《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范（2019年版）》。

由于肝癌干細(xì)胞具有更強(qiáng)的逃避抗癌藥物和易產(chǎn)生耐藥性的能力，從而導(dǎo)致傳統(tǒng)抗癌治療方法的失敗。而由于EpCAM具有在肝癌干細(xì)胞表面高表達(dá)，在成熟肝細(xì)胞中不表達(dá)的特性，因此EpCAM可有望作為肝癌的早期診斷與新型抗癌治療方法的新靶點(diǎn)[28]。

4 趨化因子受體4（CXCR4）

CXCR4是由352個(gè)氨基酸構(gòu)成的高度保守的7次跨膜G蛋白偶聯(lián)受體，其編碼基因位于染色質(zhì)2q21。CXCR4包括1個(gè)可與配體結(jié)合的胞外N端，1個(gè)包含絲氨酸/蘇氨酸位點(diǎn)的胞內(nèi)C端及3個(gè)跨膜區(qū)[29]。CXCR4是人和小鼠腫瘤細(xì)胞表達(dá)最普遍的趨化因子受體，在23種不同腫瘤細(xì)胞中均有表達(dá)[30]，且與腫瘤的惡性程度及預(yù)后不佳相關(guān)[31]。但并不是所有HCC細(xì)胞株表達(dá)的CXCR4都是功能性的，只有高侵襲性腫瘤細(xì)胞株上的CXCR4才能發(fā)揮促腫瘤效應(yīng)。

CXCR4在肝癌演進(jìn)多個(gè)步驟中表現(xiàn)出重要功能[32]：CXCR4與CXCL12結(jié)合能誘導(dǎo)CXCR4空間構(gòu)象，改變、脫敏、內(nèi)化，并通過G蛋白依賴性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和非G蛋白依賴性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，阻斷細(xì)胞凋亡促進(jìn)腫瘤生長、增殖[33]。HCC細(xì)胞能利用CXCL12-CXCR4生物軸在遠(yuǎn)離原發(fā)病灶的不良環(huán)境中存活。通過連續(xù)黏附與去黏附、細(xì)胞外基質(zhì)的降解以及上皮細(xì)胞-間充質(zhì)的轉(zhuǎn)化，CXCR4參與HCC細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。在HCC組織中，CXCR4可以選擇性表達(dá)于部分腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞上，通過激活PI3KAKT、MAPK等信號通路，以血管內(nèi)皮生長因子依賴性和非依賴性方式參與腫瘤血管生成[34]。HCC患者外周血和腫瘤微環(huán)境中的CD4+CD25+Treg細(xì)胞顯著增加，這可能是由于HCC組織釋放的CXCL12激活了CXCL12-CXCR4軸誘導(dǎo)CD4+CD25+Treg細(xì)胞向HCC腫瘤微環(huán)境遷移聚集[35]，CD4+CD25+Treg細(xì)胞可通過牽制抗原呈遞細(xì)胞對腫瘤抗原的識別和呈遞、表達(dá)TGF-β、IL-10等免疫抑制細(xì)胞因子、招募M2型巨噬細(xì)胞等方式促進(jìn)HCC細(xì)胞免疫耐受潛能的形成。研究表明，CXCL12抑制劑和CXCR4中和抗體能抑制此過程[36]。因此CXCR4是有望成為肝癌早診的潛在靶標(biāo)。靶向抑制CXCL12-CXCR4軸的藥物，既可有效抑制腫瘤的生長、增值、轉(zhuǎn)移等作為新的治療策略單獨(dú)使用，又可作為增敏劑與傳統(tǒng)抗癌策略聯(lián)合應(yīng)用。

綜上所述，腫瘤的生長需要新生血管來供應(yīng)營養(yǎng)，血管的狀態(tài)能反應(yīng)腫瘤的生長情況，針對血管的靶向策略其影像信號可以反映血管的生長狀態(tài)和腫瘤的惡性狀態(tài)。而目前廣泛采用的甲胎蛋白因其敏感性、特異性方面的不足，外源性造影劑發(fā)揮作用需通過血管達(dá)到腫瘤部位，且針對血管相關(guān)因子的主動靶向策略理論上到達(dá)靶向部位的外源性造影劑含量更高等多方面的原因，都表明了血管新生相關(guān)分子—Prox1、CXCR4等在微小肝癌早期診斷應(yīng)用方面的巨大前景。而腫瘤干細(xì)胞表面標(biāo)志物EpCAM的高度特異性高和癌胚抗原GPC-3的高度敏感性在多種關(guān)鍵分子聯(lián)合診斷早期微小肝癌方面也有著獨(dú)特的應(yīng)用價(jià)值。不僅在診斷方面起作用，早期微小肝癌診斷相關(guān)關(guān)鍵分子的特性使其還可成為靶向治療的潛在靶標(biāo)，實(shí)現(xiàn)對微小肝癌的早診早治。隨著精準(zhǔn)靶向治療的日益普及，微小肝癌早期診斷相關(guān)關(guān)鍵分子在肝癌的早期診斷及治療方面彰顯出的優(yōu)勢，在不久的將來一定會大放異彩。