高丹草組織培養(yǎng)再生體系的建立

石 悅，房永雨，于 卓，楊東升，柴文娟，劉拴成

（1.集寧師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 集寧 012000；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010019；3.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院草原研究所，內(nèi)蒙古呼和浩特 010031）

飼用作物蒙農(nóng)3號(hào)高丹草品種（Sorghum biocolor×Sorghum sudanense cv.Mengnong No.3），是由黑殼蘇丹草和高粱雄性不育系A(chǔ)3種間雜交育成的一年生飼用作物，兼具蘇丹草營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、分蘗能力強(qiáng)、氰化物含量低、抗病性強(qiáng)、適口性好及高粱莖稈粗、葉寬、抗寒耐旱、抗倒伏和產(chǎn)量高等特性[1]。其在我國(guó)南方地區(qū)每年可收割5～6次[2]，北方的內(nèi)蒙古農(nóng)牧區(qū)每年可刈割2～3次，應(yīng)用前景廣闊[3-4]。

植物組織培養(yǎng)技術(shù)具有繁殖快、無(wú)菌培養(yǎng)、不受季節(jié)限制等優(yōu)點(diǎn)，為遠(yuǎn)緣雜交育種、品種改良和轉(zhuǎn)基因育種提供技術(shù)支持。牧草中大部分屬禾本科牧草，而建立禾本科牧草組織快繁培養(yǎng)體系相對(duì)困難，原因是幼胚、幼穗、花藥、懸浮細(xì)胞、原生質(zhì)體及成熟種子等適用的外植體較為單一，這些外植體有的取材困難，有的受季節(jié)限制且不能全年供應(yīng)[5]。CHEN 等[6]最早對(duì)禾本科牧草進(jìn)行組織培養(yǎng)工作，僅誘導(dǎo)出愈傷組織。劉明等[7]介紹高粱組織培養(yǎng)研究進(jìn)展，利用花藥或花粉、胚培養(yǎng)（幼胚、胚乳和幼胚小盾片）和外植體（種子、幼穗和幼葉）建立高粱組織培養(yǎng)再生體系。CAI 等[8]以高粱成熟胚的芽端為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)，研究表明在MS 培養(yǎng)基中添加150 mg/L L-Asn、5 mg/L 2，4-D、0.05 mg/L KT和5種無(wú)機(jī)鹽，可增加愈傷組織誘導(dǎo)率。李杰勤等[9]以兩種蘇丹草品種的成熟種子為外植體，分別建立組織快繁體系，結(jié)果顯示MS 培養(yǎng)基中添加不同濃度的2，4-D和NAA 生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，可提高誘導(dǎo)愈傷組織和繼代培養(yǎng)以及分化的能力。

本試驗(yàn)以高丹草蒙農(nóng)3號(hào)成熟種子為外植體，MS 培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，在不同濃度的2，4-D和NAA 兩種生長(zhǎng)素組合配比下，對(duì)高丹草成熟種子進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)、繼代培養(yǎng)及芽風(fēng)化、生根等器官形成，旨在建立高丹草快速高效的再生體系，以期探明不同植物生長(zhǎng)激素組合對(duì)成熟種子愈傷組織的誘導(dǎo)、分化及植株再生能力的影響，對(duì)高丹草新品種選育研究和科學(xué)生產(chǎn)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 供試材料

材料選用于卓教授團(tuán)隊(duì)育成的蒙農(nóng)3號(hào)高丹草（高粱雄性不育系A(chǔ)3×黑殼蘇丹草雜種F2代）成熟種子[10]，該品種具有分蘗數(shù)多、抗旱性強(qiáng)、適口性好、富含多種氨基酸、產(chǎn)草量高、CN-含量低等優(yōu)點(diǎn)[11-13]。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 種子的預(yù)處理 挑選300 粒大小一致、籽粒飽滿的高丹草種子，先用自來(lái)水沖洗5～10 min。在超凈工作臺(tái)上，首先用75%的乙醇表面消毒30 s（邊浸泡邊搖動(dòng)），然后把乙醇液倒掉；再用0.1%的升汞處理12 min，最后用無(wú)菌水沖洗3～5次（圖1a）。

1.2.2 培養(yǎng)基配制 配制1 L 的MS 培養(yǎng)基，分別稱量蔗糖30 g，瓊脂7 g，MS 干粉4.74 g，先加無(wú)菌水，待水沸騰煮瓊脂10 min，隨后加入MS 干粉，最后加入蔗糖，將其徹底溶解并定容至1 L，按照試驗(yàn)既定方案，加入不同濃度的植物激素，每組3次重復(fù)。利用NaOH 溶液（1 mol/L）調(diào)節(jié)pH值至5.8～6.4，滅菌后備用（圖1b）。

1.2.3 愈傷組織誘導(dǎo) MS 培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加2，4-D（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/L）用于誘導(dǎo)形成高丹草愈傷組織。在超凈工作臺(tái)上，將處理好的高丹草種子橫切為兩塊，接種于已配制好的培養(yǎng)基上，每瓶接種8 粒，每個(gè)組合接12 瓶，重復(fù)3次。接種完的第15 天觀察污染情況并統(tǒng)計(jì)出愈率和褐化率，培養(yǎng)溫度為（25±1）℃。

1.2.4 芽分化培養(yǎng) 接種后的第15 天，對(duì)形成的愈傷組織進(jìn)行一次繼代培養(yǎng)。挑選出誘導(dǎo)形成的結(jié)構(gòu)致密、色澤暗黃、顆粒較小的胚性愈傷組織，將其從外植體上剝離，把大塊的愈傷組織放于無(wú)菌紙上，用刀片切成黃豆粒大小，在無(wú)菌環(huán)境下接種到最適2，4-D 濃度的繼代培養(yǎng)基上，MS 培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，在適宜條件下培養(yǎng)15 d 后用于幼苗分化培養(yǎng)。

將繼代培養(yǎng)的愈傷組織轉(zhuǎn)入幼苗分化培養(yǎng)基，MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，附加NAA（0、0.5、1.0、1.5 mg/L）和6-BA（0.5、1.0、1.5、2.0 mg/L）共16個(gè)處理，每一個(gè)處理組合接種4 瓶，每瓶接種8個(gè)，適宜培養(yǎng)條件為：溫度（25±1）℃，光照時(shí)間14 h/d，黑暗10 h/d，光強(qiáng)1 500～2 000 lx，相對(duì)濕度75%。

1.2.5 生根培養(yǎng) 挑選幼苗分化培養(yǎng)基中長(zhǎng)勢(shì)相近的幼苗轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基，MS 培養(yǎng)基中附加IBA（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/L）用于生根培養(yǎng)的植物生長(zhǎng)物質(zhì)組合處理，每一個(gè)處理接種8 瓶，每瓶接種6株，適宜條件下培養(yǎng)一段時(shí)間，14 d 后觀察幼苗根系生長(zhǎng)情況及統(tǒng)計(jì)生根率。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 20.0 軟件的ANOVA 過(guò)程對(duì)各處理進(jìn)行差異性的檢驗(yàn)和Duncan′s 法對(duì)結(jié)果進(jìn)行多重比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基篩選

將高丹草種子接種到愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，15 d后形成白色半透明、質(zhì)軟疏松、形狀不規(guī)則的愈傷組織（圖1c）。由表1可以看出，6種不同濃度的2，4-D對(duì)高丹草愈傷組織的誘導(dǎo)呈現(xiàn)出先升后降的趨勢(shì)，其褐化率隨著2，4-D 濃度的增加而增加。試驗(yàn)表明，當(dāng)2，4-D 濃度為1.5 mg/L時(shí)，誘導(dǎo)愈傷組織分化數(shù)最多，誘導(dǎo)率最高，為65.63%，且褐化數(shù)最少，褐化率為19.44%。因此，誘導(dǎo)高丹草成熟種子形成愈傷組織最適的2，4-D 濃度為1.5 mg/L，高濃度的2，4-D 對(duì)愈傷組織的形成有一定抑制作用，隨著2，4-D 濃度的升高，其褐化率表現(xiàn)不同程度的升高。

表1 不同濃度的2，4-D 對(duì)愈傷組織的影響

2.2 芽分化培養(yǎng)基篩選

植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑NAA、6-BA 的16個(gè)不同組合對(duì)高丹草愈傷組織幼苗分化的影響不同（圖1d），如表2 所示，NAA 濃度有4個(gè)不同處理水平，分別為0、0.5、1.0、1.5 mg/L，每個(gè)處理水平中高丹草幼苗芽分化率隨著6-BA 濃度的增加總體呈先升后降的趨勢(shì)。NAA 濃度為0.5 mg/L時(shí)，6-BA 濃度達(dá)到1.5 mg/L時(shí)，高丹草幼苗分化率最高；在生長(zhǎng)激素6-BA 的4個(gè)處理水平中，NAA 濃度變化對(duì)高丹草幼苗分化率也呈先升后降的趨勢(shì)，6-BA 濃度為1.5 mg/L、NAA 濃度為0.5 mg/L 時(shí)高丹草芽分化率最高。因此，高丹草芽分化率最優(yōu)組合為0.5 mg/L NAA+1.5 mg/L 6-BA，分化率達(dá)到80.21%；6-BA 濃度為2.0 mg/L，不添加NAA，分化率最低，為17.71%（表2）。

2.3 幼苗生根培養(yǎng)基篩選

高丹草幼苗生根率隨IBA 濃度的增加呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)（表3），IBA 濃度為1.0 mg/L時(shí)，生根率最高，為74.30%，根系較長(zhǎng)，呈輻射狀，須根系多且發(fā)達(dá)（圖1e）；IBA 濃度為2.5 mg/L時(shí)，生根率僅為31.95%，均低于前4個(gè)處理組合，從形態(tài)結(jié)構(gòu)來(lái)看，根系短且少。這表明高濃度的IBA 對(duì)高丹草幼苗的生根有很明顯的抑制作用。

2.4 移栽煉苗

生根的高丹草組培苗在濕度為80%～90%的環(huán)境中煉苗5 d，將其移栽至營(yíng)養(yǎng)土（花土∶珍珠巖∶蛭石=3∶1∶1）中，在溫室中培養(yǎng)，噴濕營(yíng)養(yǎng)液確保其茁壯成長(zhǎng)（圖1f）。

3 討論

3.1 外植體的選擇

植物利用花藥或花粉、胚培養(yǎng)（幼胚、胚乳和幼胚小盾片）和外植體（種子、幼穗和幼葉）建立組織培養(yǎng)快繁體系。目前來(lái)看，有關(guān)高丹草組織培養(yǎng)的研究報(bào)道并不多，其親本高粱和蘇丹草組培的研究較多，所選外植體中有成熟胚、幼穗和種子。譚化等[14]將不同基因型的高粱幼穗接種于4個(gè)誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，發(fā)現(xiàn)最適的基本培養(yǎng)基是MS1（MS+2，4-D 2 mg/L+3% 蔗糖，pH值5.8），選取幼穗為外植體，誘導(dǎo)產(chǎn)生易于分化的愈傷組織類型，其誘導(dǎo)率高、生長(zhǎng)快，6個(gè)基因型都獲得了再生植株，建立了再生體系。艾克拜爾·毛拉等[15]以新疆地區(qū)重要伴生種韃靼忍冬和疏花薔薇帶芽莖段為外植體，研究不同培養(yǎng)基及植物激素配比對(duì)芽分化、增殖及植株再生的影響。劉志華等[16]以種子為外植體，在培養(yǎng)基MS 的基礎(chǔ)上，添加不同濃度的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑（NAA、6-BA和IBA）對(duì)羅布麻愈傷組織進(jìn)行誘導(dǎo)的研究獲得了再生植株。

表2 不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑處理組合對(duì)高丹草芽分化的影響

表3 不同濃度的IBA 對(duì)高丹草幼苗生根率的影響

高丹草成熟種子有較強(qiáng)的再生能力，種子易獲得，來(lái)源豐富且遺傳穩(wěn)定，容易滅菌，可減少操作中的污染，因此選取高丹草成熟種子作為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)。

3.2 不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)幼苗分化的影響

高丹草愈傷組織的培養(yǎng)是在植物細(xì)胞全能性基礎(chǔ)上建立的，在培養(yǎng)過(guò)程中植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑起促進(jìn)植物生長(zhǎng)和根系分化的作用[17]。程泉等[18]利用不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)新疆油用向日葵主栽品種早矮大頭誘導(dǎo)愈傷組織、不定芽及不定根，確定最適培養(yǎng)基。羅芃睿等[19]以帶柄葉片為外植體，6-BA、NAA、IBA等外源激素對(duì)迷你巖桐愈傷組織和不定芽的誘導(dǎo)、增殖和生根的影響。本研究采用不同濃度的2，4-D（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/L）對(duì)高丹草愈傷組織進(jìn)行誘導(dǎo)，結(jié)果表明，2，4-D 濃度為1.5 mg/L 時(shí)出愈率最高、褐化率最低。在幼苗分化培養(yǎng)試驗(yàn)中，不添加NAA時(shí)，幼苗分化率隨6-BA 濃度增加而降低；當(dāng)NAA 濃度為0.5 mg/L和1.0 mg/L時(shí)，幼苗分化率均隨著6-BA 濃度的增加而呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)；當(dāng)NAA 濃度為1.5 mg/L時(shí)，6-BA對(duì)芽分化的影響不是很大，且分化率整體下降。在生根培養(yǎng)試驗(yàn)中，添加低濃度生長(zhǎng)素IBA 有利于根系的產(chǎn)生，且根系和幼苗生長(zhǎng)速度較快，能生長(zhǎng)出健壯的根系；根系數(shù)量不斷增加；高濃度的IBA（2.5 mg/L）抑制高丹草幼苗的生根。因此，適宜的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)植物組培和再生體系建立起到促進(jìn)作用。

4 結(jié)論

試驗(yàn)最終確定高丹草適宜的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+2，4-D（1.5 mg/L），誘導(dǎo)率達(dá)到65.63%；適宜的分化培養(yǎng)基為MS+NAA（0.5 mg/L）+6-BA（1.5 mg/L），分化率80.21%；適宜生根培養(yǎng)基為MS+IBA（1.0 mg/L），生根率達(dá)75%。成功建立組培體系是組織培養(yǎng)技術(shù)中較為關(guān)鍵的一步，這為高丹草遠(yuǎn)緣雜交育種和轉(zhuǎn)基因育種開(kāi)辟了新途徑。