精準(zhǔn)調(diào)控CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)研究進(jìn)展

曹俊霞，王友亮，王征旭,3

精準(zhǔn)調(diào)控CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)研究進(jìn)展

曹俊霞1，王友亮2，王征旭1,3

1. 解放軍總醫(yī)院第七醫(yī)學(xué)中心生物治療中心，北京 100700 2. 軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院生物工程研究所，北京 100071 3. 解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心肝膽胰外科學(xué)部，北京 100853

基因編輯(gene editing)是一種能對(duì)細(xì)胞和生物體基因組一小段DNA進(jìn)行定點(diǎn)修飾或者刪除、插入的基因工程技術(shù)?；蚓庉嫾夹g(shù)在疾病治療、基因功能調(diào)控、基因檢測(cè)、藥物研發(fā)和作物育種等方面具有廣闊的應(yīng)用前景，但在應(yīng)用中也逐漸顯現(xiàn)出脫靶、基因毒性等副作用問(wèn)題。CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)系統(tǒng)中核酸酶Cas9蛋白能通過(guò)與gRNA (guide RNA)結(jié)合特異性識(shí)別靶DNA并進(jìn)行酶切反應(yīng)，由于Cas9蛋白和gRNA在其自身活性、識(shí)別位點(diǎn)及結(jié)合能力等方面具有不同的特性，因此在應(yīng)用中可以通過(guò)對(duì)Cas9蛋白酶的活性以及與靶DNA在時(shí)間和空間上的結(jié)合進(jìn)行精準(zhǔn)調(diào)控，主要調(diào)控方法包括使用光、溫度和藥物等調(diào)節(jié)Cas9融合蛋白、抗CRISPR蛋白、核酸類和小分子類化合物抑制劑的使用等，從而能有效地防范基因編輯技術(shù)的風(fēng)險(xiǎn)和增強(qiáng)精準(zhǔn)調(diào)控基因編輯技術(shù)的實(shí)際應(yīng)用性。本文就目前如何精準(zhǔn)調(diào)控基因編輯技術(shù)，尤其是精準(zhǔn)調(diào)控CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的方法進(jìn)行了綜述，以期為人類疾病治療、作物育種、家畜遺傳改良和防范生物技術(shù)繆用等提供借鑒和研究思路。

基因編輯；基因編輯調(diào)控；抗CRISPR蛋白；小分子抑制劑

每年年底評(píng)選年度世界十大科學(xué)進(jìn)展，其中基因編輯技術(shù)分別于2012、2013和2015年3次登上年度十大科學(xué)突破，對(duì)此編輯部表示“前所未有”[1,2]。2019年12月，列出近10年最具影響力的5個(gè)重大科學(xué)事件，其中CRISPR基因編輯技術(shù)入選，可見(jiàn)基因編輯技術(shù)對(duì)人類生活的巨大影響力[3]。2020年10月7日，諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)授予法國(guó)生物化學(xué)家?，敿~埃爾·沙爾龐捷(Emmanuelle Charpentier)和美國(guó)生物化學(xué)家珍妮弗·道德納(Jennifer Doudna)，以表彰她們對(duì)新一代基因編輯技術(shù)CRISPR的貢獻(xiàn)。盡管如此，基因編輯技術(shù)目前在應(yīng)用中還存在脫靶、基因毒性等副作用，Cas9蛋白具有潛在致癌性[4]，以及基因編輯技術(shù)繆用等問(wèn)題[5,6]，因此需要對(duì)基因編輯技術(shù)進(jìn)行精準(zhǔn)調(diào)控，減少潛在的治療風(fēng)險(xiǎn)。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)自然界中存在一些基因編輯抑制蛋白[7]，能夠抑制Cas9蛋白酶的活性；另外，也可以通過(guò)人工合成的方法，通過(guò)融合蛋白、小分子等調(diào)控Cas9酶的活性；此外還有光、核酸小分子抑制劑等。本文就目前如何精準(zhǔn)調(diào)控基因編輯技術(shù)，尤其是精準(zhǔn)調(diào)控CRISPR/ Cas9基因編輯技術(shù)的方法[8]進(jìn)行回顧及分析，以期對(duì)基因編輯技術(shù)的防控策略提供借鑒和參考。

1 基因編輯技術(shù)及應(yīng)用

基因編輯技術(shù)主要包括3種：鋅指核酸內(nèi)切酶(zinc finger endonuclease, ZFN)技術(shù)，類轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶(transcription activator-like effectornucleases, TALEN)技術(shù)，RNA引導(dǎo)的CRISPR/Cas核酸酶技術(shù)(clustered regularly interspaced short palin-dromic repeats/CRISPR-associated proteins, CRISPR/ Cas)[9,10]。因ZFN和TALEN技術(shù)存在脫靶效應(yīng)或組裝復(fù)雜性等缺陷，限制了這類技術(shù)在基因編輯領(lǐng)域中的廣泛應(yīng)用[9]。近年來(lái)，以CRISPR/Cas9系統(tǒng)為代表的基因編輯技術(shù)迅速發(fā)展，并已經(jīng)在生命科學(xué)諸多領(lǐng)域中得到廣泛應(yīng)用[11]?；蚓庉嫾夹g(shù)在疾病治療、基因功能調(diào)控、基因檢測(cè)、藥物研發(fā)和作物育種等方面有著廣闊的應(yīng)用前景[11~13]，目前已經(jīng)應(yīng)用到多種人類疾病治療的臨床試驗(yàn)中，如HIV治療[14]、遺傳性疾病治療[15]、腫瘤免疫治療[16]等。Xu等[14]通過(guò)CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，使CD34+造血干細(xì)胞表面HIV-1病毒進(jìn)入細(xì)胞的輔助受體基因功能性失活，進(jìn)而阻止HIV病毒進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。用經(jīng)基因改造的造血干細(xì)胞移植治療HIV感染的急性淋巴細(xì)胞白血病患者，可見(jiàn)功能缺失的造血干細(xì)胞在患者體內(nèi)形成嵌合體，能存活19個(gè)月以上，患者白血病癥狀得到緩解，未見(jiàn)明顯治療相關(guān)的并發(fā)癥。Wu等[15]使用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)改造造血干細(xì)胞，使基因幼紅細(xì)胞增強(qiáng)子核蛋白結(jié)合位點(diǎn)突變，進(jìn)而減少BCL11A蛋白的表達(dá)和誘導(dǎo)胎兒γ球蛋白的表達(dá)。該研究表明經(jīng)基因改造的鐮狀細(xì)胞貧血和β地中海貧血患者的造血干細(xì)胞能表達(dá)內(nèi)源性治療水平的胎兒血紅蛋白(fetal hemoglobin，HbF)，提示基因編輯造血干細(xì)胞具有臨床治療鐮狀細(xì)胞貧血和β地中海貧血的潛在應(yīng)用前景。Qasim等[16]使用TALEN技術(shù)功能性敲除靶向CD19嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor, CAR)基因修飾T細(xì)胞(CAR-T)的和T細(xì)胞受體(T cell receptor,)基因，使用這些經(jīng)基因改造異體來(lái)源的通用型CAR-T細(xì)胞治療急性淋巴細(xì)胞白血病(acute lymphoblastic leukaemia, ALL)，結(jié)果顯示患兒體內(nèi)的白血病腫瘤細(xì)胞消退，提示該異體來(lái)源的通用型CAR-T細(xì)胞可用于臨床治療ALL。

基因編輯技術(shù)在應(yīng)用中也存在一些急需解決的問(wèn)題[5,17]，如脫靶效應(yīng)[18]、染色體易位、基因毒性等，同時(shí)存在生物技術(shù)繆用的風(fēng)險(xiǎn)[5]，甚至可能被恐怖分子所利用，用于制備新型生物戰(zhàn)劑[19,20]。CRISPR/Cas9系統(tǒng)作為目前最主要的基因編輯技術(shù)被廣泛應(yīng)用到生物、醫(yī)療等領(lǐng)域，本文重點(diǎn)介紹了CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，針對(duì)精準(zhǔn)調(diào)控CRISPR/ Cas9技術(shù)進(jìn)展進(jìn)行了總結(jié)。鑒于基因編輯技術(shù)在應(yīng)用中尚存在的一些缺陷，有必要在CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的應(yīng)用中，通過(guò)對(duì)Cas9酶活性的劑量、發(fā)揮作用的時(shí)間等進(jìn)行精確控制[21]，減少脫靶效應(yīng)[6,22]等毒副作用，甚至用于阻止生物技術(shù)繆用等問(wèn)題。另外，也可以通過(guò)天然和人工合成的多種蛋白、小分子化合物等Cas9蛋白抑制劑，進(jìn)行基因編輯的精準(zhǔn)調(diào)控(圖1)。精準(zhǔn)調(diào)控基因編輯技術(shù)具有重要的生物學(xué)意義：(1)在生殖系統(tǒng)基因編輯時(shí)，將Cas9酶活性限制在一個(gè)非常窄的時(shí)空窗口非常重要，可以降低分裂細(xì)胞中嵌合體的產(chǎn)生；(2)通過(guò)抑制Cas9蛋白的活性來(lái)暫時(shí)開(kāi)關(guān)某些基因的驅(qū)動(dòng)功能，將在林業(yè)、畜牧業(yè)等領(lǐng)域發(fā)揮重要作用；(3)小分子抑制劑可以以器官特異性的方式給予，以抑制組織中的脫靶效應(yīng)；(4) Cas9抑制劑有助于從生物安全的角度考慮阻止基因編輯技術(shù)的雙重用途問(wèn)題；(5) Cas9抑制劑將促進(jìn)對(duì)內(nèi)源性Cas9抑制蛋白生物學(xué)功能的理解，為精確的抗感染治療奠定基礎(chǔ)[6,21,23~27]。

圖1 精準(zhǔn)調(diào)控CRISPR/Cas9策略

tracrRNA: transactivating CRISPR RNA (轉(zhuǎn)錄激活crRNA)；PAM: protospacer adjacent motif (前間區(qū)序列鄰近基序)；gRNA: guide RNA (向?qū)NA)。

2 CRISPR/Cas9基因編輯調(diào)控技術(shù)

2.1 精準(zhǔn)調(diào)控Cas9蛋白活性

Cas9酶活性大小能導(dǎo)致毒性的產(chǎn)生，伴隨著Cas9酶活性的升高可以觀察到明顯的脫靶效應(yīng)、染色體易位和基因毒性等。由于脫靶效應(yīng)的發(fā)生率通常低于靶效應(yīng)，因此人們希望將核酸酶活性限制在一個(gè)狹窄的時(shí)間窗內(nèi)。同時(shí)，為了逃避宿主對(duì)這種來(lái)源于細(xì)菌Cas9蛋白的免疫監(jiān)視，在編輯目標(biāo)基因時(shí)也需要能快速地降解Cas9蛋白。調(diào)控Cas9通常有兩種方法：通過(guò)人工改造的Cas9蛋白的方法，如通過(guò)融合小分子藥物、光等結(jié)合元件，可以條件性激活Cas9蛋白；或者通過(guò)抑制或降解Cas9蛋白，運(yùn)用小分子調(diào)控翻譯后Cas9蛋白的功能等[6,21,23~27]，能夠在劑量、時(shí)間和空間上精確調(diào)控Cas9蛋白的功能。

2.1.1 藥物調(diào)控Cas9蛋白活性

科研人員已開(kāi)發(fā)出多種化學(xué)誘導(dǎo)的小分子開(kāi)關(guān)系統(tǒng)來(lái)調(diào)控Cas9蛋白的活性[21,28]。Davis等[28]在Cas9 特定位點(diǎn)插入4-羥基他莫昔芬(4-hydroxyta-moxifen, 4-HT)內(nèi)含肽，在4-HT存在的情況下可以調(diào)控Cas9酶的活性，且Cas9酶的活性依賴4-HT的劑量。盡管這種經(jīng)人工改造的Cas9酶的活性比野生型Cas9酶低，但是能明顯提高靶基因的編輯效率。通過(guò)使用雌激素受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(hormone-binding domain of the estrogen receptor, ERT2)融合Cas9開(kāi)發(fā)的小分子誘導(dǎo)的CRISPR/Cas9系統(tǒng)(iCas9)[28]，4-HT能夠有效地在時(shí)間和空間上調(diào)控Cas9酶的活性。在4-HT缺乏的情況下，ERT2將Cas9蛋白固定在細(xì)胞質(zhì)中，一旦加入4-HT，融合蛋白能快速地轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，4 h后就能觀察到iCas9的酶切活性，且具備較高的DNA酶切效率。同時(shí)，iCas9系統(tǒng)的活性狀態(tài)是可逆的，Cas9酶的活性可以在移除4-HT 72 h內(nèi)被逆轉(zhuǎn)，但是人工改造的iCas9系統(tǒng)僅保留了野生型Cas9酶活性的60%。

2017年，Maji等[29]利用小分子調(diào)節(jié)的蛋白降解子實(shí)現(xiàn)了對(duì)不同Cas9系統(tǒng)進(jìn)行多維調(diào)控。通過(guò)在小分子不穩(wěn)定區(qū)域融合二氫葉酸還原酶(dihydrofolate reductase, DHFR)、雌激素受體(estrogen receptor, ER)，分別加入甲氧芐啶(trimethoprim, TMP)、4-HT后，能在劑量、時(shí)間、基因目標(biāo)和特異性等方面多維度調(diào)控Cas9酶的活性，實(shí)現(xiàn)了對(duì)全基因組的調(diào)控，極大地改善了基因編輯的酶切效率。這類小分子具有價(jià)廉、無(wú)毒等特征，能比較容易地在其他細(xì)胞和復(fù)雜的有機(jī)體中使用[29]。

通過(guò)植物激素相關(guān)蛋白質(zhì)降解信號(hào)途徑，制備融合蛋白來(lái)調(diào)控Cas9蛋白的表達(dá)。例如：脫落酸(abscisic acid, ABA)信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)通路ABI蛋白和ABA受體蛋白PYL1信號(hào)通路、以及赤霉素(gib-berellin, GA)受體GID1 (gibberellin insensitive Dwarf 1)通路、GID1底物DELLA蛋白家族成員之一的GAI蛋白通路，分別通過(guò)ABA、GA誘導(dǎo)的ABI-PYL1、GID1-GAI結(jié)構(gòu)域異二聚體化[21,30]，也能產(chǎn)生小分子藥物的劑量依賴效應(yīng)，進(jìn)而調(diào)控Cas9蛋白的轉(zhuǎn)錄激活和抑制。失活Cas9蛋白的兩個(gè)位點(diǎn)D10AH和H840A，能導(dǎo)致Cas9蛋白不具有核酸酶活性，成為dCas9 (dead Cas9)。2016年，Gao等[30]在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中采用ABA和GA可以實(shí)現(xiàn)對(duì)Cas9的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。分別將異二聚體結(jié)構(gòu)域克隆到表達(dá)載體PiggyBac中，分別與dCas9和3種激活因子(VP64-p65-Rta, VPR)融合，這些異二聚體結(jié)構(gòu)域包括 ABI-PYL1、GID1-GAI、FKBP–FRB、PHYB–PIF、CRY2PHR– CIBN和FKF1–GI六種，在HEK293T細(xì)胞中經(jīng)過(guò)ABA和GA誘導(dǎo)，篩選獲得了化學(xué)誘導(dǎo)的dCas9系統(tǒng)，該調(diào)控具有劑量依賴效應(yīng)和逆轉(zhuǎn)錄激活、轉(zhuǎn)錄抑制等功能[30]。

根據(jù)雷帕霉素(Rapamycin)能夠調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物靶點(diǎn)(mTOR) FK506結(jié)合蛋白12 (FK506-binding protein, FKBP)，以及FKBP雷帕霉素結(jié)合域(FRB)二聚化的特性，設(shè)計(jì)在缺乏雷帕霉素時(shí)能夠使Cas9產(chǎn)生較低水平酶活性的基因編輯系統(tǒng)，當(dāng)加入雷帕霉素時(shí)其活性可以被逆轉(zhuǎn)激活，并且該系統(tǒng)沒(méi)有明顯的脫靶現(xiàn)象[31]。2020年，Chiarella等[32]使用化學(xué)表觀遺傳修飾劑(chemical epigenetic modifiers, CEMs)，通過(guò)招募內(nèi)源染色體激活的特異組分，調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)。在復(fù)合物中用FKBP催化dCas9，CEMs可以提高靶基因表達(dá)20倍以上，同時(shí)提示CEM具有轉(zhuǎn)錄激活的劑量依賴性特性，可以作用于多種靶基因，具有可逆轉(zhuǎn)的特性，并且具有基因修飾的特異性[32]。2018年，Shrimp等[33]使用dCas9-p300 (包含KAT結(jié)構(gòu)域)融合蛋白作為賴氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶(lysine acetyltransferases，KATs)活性報(bào)告分子，篩選可以調(diào)控基因表達(dá)的小分子，發(fā)現(xiàn)3個(gè)具有明顯作用的抑制分子KATi、CBP30和JQ1，能夠影響CRISPR/Cas9乙酰轉(zhuǎn)移酶的活性。2017年，Rose等[21,34]通過(guò)BCL-xL和BH3肽段之間的相互作用，破壞蛋白結(jié)構(gòu)域的二聚化，制備出一種快速誘導(dǎo)的Cas9 (inducible Cas9, ciCas9)系統(tǒng)。Cas9結(jié)構(gòu)域REC2 (recognition lobe, 螺旋狀的識(shí)別瓣葉)被BCL-xL所替代而產(chǎn)生Cas9·BCL，并且BH3肽段被粘附到Cas9·BCL的N-端和C-端。BCL-xL和BH3肽段之間的分子內(nèi)相互作用使Cas9保持在一個(gè)非激活狀態(tài)，當(dāng)加入BCL-xL的小分子抑制劑(A-385358, A3)時(shí)，因破壞了BH3和BCL-xL之間的相互作用，因此Cas9酶被激活。這種ciCas9系統(tǒng)顯示出比4-HT誘導(dǎo)的intein-Cas9和iCas9系統(tǒng)更好的劑量依賴的核酸酶活性。ciCas9系統(tǒng)還顯示了比較低的脫靶效應(yīng)，但蛋白酶活性仍比野生型Cas9低。2019年，Kang等[35]通過(guò)Tet-on系統(tǒng)來(lái)調(diào)控Cas9蛋白，使用優(yōu)化的Tet-on載體構(gòu)建可誘導(dǎo)Cas9系統(tǒng)，當(dāng)加入不同劑量的Dox時(shí)，能調(diào)控Cas9蛋白的表達(dá)水平。

2.1.2 光調(diào)控Cas9蛋白活性

近年來(lái)，光作為調(diào)控蛋白活性的研究已取得較大的進(jìn)展，能夠提供時(shí)空調(diào)控和非侵入性調(diào)控，因此具有明顯的調(diào)控優(yōu)勢(shì)。目前已有幾種使用光調(diào)控Cas9的表達(dá)系統(tǒng)調(diào)控Cas9蛋白的活性。Nihongaki等[36]發(fā)明了一種光調(diào)控CRISPR/Cas9系統(tǒng)，該系 統(tǒng)依賴于擬南芥()隱花色素2 (cryptochrome 2, CRY2)和其結(jié)合蛋白鈣整合素結(jié)合蛋白1 (calcium and integrin binding protein, CIB1)，在藍(lán)光的照射下可以異二聚化。通過(guò)將dCas9與CIB1融合，CRY2結(jié)構(gòu)域與轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(VP64或p65)融合，結(jié)果顯示可以用光進(jìn)行時(shí)空調(diào)控和多重調(diào)控內(nèi)源基因的表達(dá)，藍(lán)光照射1 h既可檢測(cè)到報(bào)告基因的表達(dá)。Nihongaki等[36]也設(shè)計(jì)了一種光激活分離Cas9 (photo-activatable split Cas9, paCas9)策略。Cas9 蛋白的N端和C端分別融合光應(yīng)答結(jié)構(gòu)域陽(yáng)性磁鐵(positive magnet, pMag)和陰性磁鐵(negative magnet, nMag)，當(dāng)藍(lán)光照射時(shí)，pMag和nMag二聚化，從而誘導(dǎo)更高活性的Cas9。光調(diào)控Cas9系統(tǒng)，也可以通過(guò)基因gRNA調(diào)控Cas9蛋白的活性來(lái)實(shí)現(xiàn)[37]。Jain等[38]研究顯示，使用光降解保護(hù)寡核苷酸與gRNA雜交以阻止gRNA: DNA的結(jié)合，在光照的條件下能保護(hù)寡核苷酸降解產(chǎn)生短片段，從而降低與gRNA的親和力。因此，光可以通過(guò)gRNA調(diào)控Cas9蛋白的活性，但是這種調(diào)控方式是不可逆的。

2.1.3 gRNA調(diào)控Cas9蛋白活性

CRISPR/Cas9系統(tǒng)也可以通過(guò)gRNA調(diào)控Cas9酶的活性，如通過(guò)將適體(aptamers)和適體酶(apta-zymes)融合到gRNA上進(jìn)行配體依賴的控制。適體酶是一種人工合成的寡核苷酸，既具有適體與靶物質(zhì)結(jié)合的高特異性和高親和力，又有核酸或脫氧核酶的催化活性，適體酶與目標(biāo)配體結(jié)合從而發(fā)生結(jié)構(gòu)改變，激活相關(guān)核酸酶結(jié)構(gòu)域，啟動(dòng)RNA 剪切活性。2017年，美國(guó)哈佛大學(xué)Tang等[39]將aptazymes融合到gRNAs中開(kāi)發(fā)了一套適體酶嵌入的agRNAs (aptazyme-embedded guide RNAs)系統(tǒng)，通過(guò)在體外和體內(nèi)篩選和優(yōu)化不同的gRNA，設(shè)計(jì)出氨茶堿調(diào)控的agRNAs系統(tǒng)，調(diào)控Cas9蛋白的活性。2018年，美國(guó)芝加哥大學(xué)Pu等[40]開(kāi)發(fā)出一種依賴于RNA聚合酶(RNA polymerase, RNAP)的生物感應(yīng)器來(lái)調(diào)控gRNA。研究顯示RNAP生物感應(yīng)器可以檢測(cè)到相關(guān)蛋白的相互作用，激發(fā)相關(guān)基因的敲除，能多維度對(duì)Cas9蛋白進(jìn)行調(diào)控。

2.1.4 降解Cas9蛋白

進(jìn)行基因編輯時(shí)，及時(shí)降解Cas9蛋白可能比完全抑制其活性更有效、更便捷?？蒲腥藛T已經(jīng)開(kāi)發(fā)出一些小分子進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后蛋白水平的調(diào)控。將Cas9蛋白融合到一個(gè)或多個(gè)降解結(jié)構(gòu)域中，并在加入相應(yīng)的小分子或光后Cas9蛋白被降解。Cas9的小分子抑制劑也可以轉(zhuǎn)換成含有泛素連接酶的降解劑，這些小分子降解劑與Cas9抑制劑相比具有催化作用，并且分子量相對(duì)較小[41]。其他的策略包括將一個(gè)降解因子融合到目標(biāo)蛋白中，在加入小分子或暴露在光等條件時(shí)就會(huì)引起蛋白降解。如細(xì)胞蛋白快速降解及可逆調(diào)控技術(shù)(Degron技術(shù))，通過(guò)在Cas9蛋白中融合條件性蛋白降解子(degrons)，degrons可以通過(guò)小分子配體、光、溫度等變化，使Cas9蛋白激活或者失活[42]。2018年，美國(guó)丹娜法伯癌癥研究院Nabet等[43]報(bào)道了一種降解劑dTAG系統(tǒng)(the degradation tag, dTAG)，該系統(tǒng)能對(duì)特異性靶蛋白進(jìn)行降解。研究人員將靶蛋白與降解劑FKBP12F36V(FK506- and rapamycin-binding protein)突變體融合在一起表達(dá)，F(xiàn)KBP12F36V可以招募CRBN (Cereblon)配體進(jìn)一步形成E3泛素化連接酶復(fù)合體，其中CRBN配體可以與化學(xué)小分子dTAG-7、dTAG-13、dTAG-48和dTAG-51等識(shí)別，篩選可以使靶蛋白降解的小分子。利用類似的策略可以降解Cas9蛋白，其中包括生長(zhǎng)素誘導(dǎo)的降解系統(tǒng)、配體誘導(dǎo)(ligand-induced degradation, LID)結(jié)構(gòu)域、B-LID結(jié)構(gòu)域和小分子輔助關(guān)閉(small molecule-assisted shutoff, SMASh)系統(tǒng)[44,45]。LID結(jié)構(gòu)域通過(guò)在FKBP12的C端融合19個(gè)氨基酸degron，化學(xué)小分子Shield-1用來(lái)調(diào)控蛋白降解。在鳥氨酸脫羧酶(ornithine decarboxylase, ODC)和抗酶(antizyme, AZ)中鑒定出另一個(gè)泛素非依賴的蛋白酶降解技術(shù)，目的蛋白與ODC融合后可以以一種泛素非依賴形式，在共表達(dá)抗酶存在的情況下被降解[46]。

2017年，中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所李曉江團(tuán)隊(duì)在猴子()胚胎中通過(guò)泛素破壞降解(split ubiquitin for the rescue of function, SURF)，調(diào)控Cas9蛋白的半衰期，從而減少嵌合體的突變。該研究將泛素化蛋白酶降解信號(hào)(Ubiquitin- RGKEQKLISEEDL-CAS9, UPS)連接到Cas9的N端(Ubi-Cas)，在猴子胚胎中該降解信號(hào)不影響Cas9酶切割DNA的效率，縮短Cas9半衰期確實(shí)可以降低胚胎嵌合體突變的形成[47]。2019年，美國(guó)斯坦福大學(xué)Charlesworth等[48]發(fā)表的一項(xiàng)研究顯示，在人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)存在Cas9的抗體，Cas9的特異性免疫應(yīng)答在應(yīng)用Cas9進(jìn)行人體治療時(shí)，可能會(huì)成為一個(gè)主要的治療障礙，通過(guò)降低Cas9的半衰期可以減輕免疫應(yīng)答反應(yīng)。Cas9降解分子也對(duì)降低Cas9基因編輯所導(dǎo)致的基因毒性反應(yīng)有益。異源雙功能分子(heterobifunctional molecules)也稱之為降解劑(deg-raders)，可以使靶蛋白和特異性泛素連接酶共定位，從而參與蛋白酶體降解途徑。

2.2 抑制Cas9蛋白活性

2.2.1 抗CRISPR蛋白

隨著CRISPR天然遺傳編碼拮抗劑(抗CRISPR蛋白)不斷被發(fā)現(xiàn)，人們對(duì)選擇這些蛋白質(zhì)來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)Cas9蛋白的抑制產(chǎn)生了極大的興趣。目前，已在細(xì)菌噬菌體基因組中發(fā)現(xiàn)可以結(jié)合和抑制CRISPR- Cas9活性的多種抗CRISPR蛋白，這類蛋白質(zhì)大多在200 aa左右，能允許噬菌體在細(xì)菌內(nèi)繁殖和逃避細(xì)菌的免疫監(jiān)視[21]。2019年，南昌大學(xué)劉瓊等[49]對(duì)目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的40多種抗CRISPR蛋白(anti-CRISPRs, Acr)進(jìn)行總結(jié)分析，將其分為I型(I-E、I-F、I-D、I-C)、II型(AcrIIA1-10、AcrIIC1-5)、III型(III-B)和V型(AcrVA1、AcrVA4、AcrVA5)。早在2013年人們已發(fā)現(xiàn)5種Acr蛋白(AcrIF1-5)，隨后又發(fā)現(xiàn)4種AcrIE1-4蛋白，這些都屬于I型抗CRISPR蛋白。I-E型和I-F型Acr基因在5′端存在一個(gè)保守的啟動(dòng)子序列，在3′端存在一個(gè)保守基因，但是抗CRISPR蛋白之間幾乎無(wú)序列同源性。抗CRISPR蛋白可以以多種方式干擾CRISPR/Cas系統(tǒng)，例如通過(guò)結(jié)合到gRNA負(fù)載的CRISPR/-Cas復(fù)合物并且阻止與DNA的結(jié)合；結(jié)合到Cas效應(yīng)蛋白阻止它們招募到活性級(jí)聯(lián)復(fù)合物(active cascade complexes)(I型系統(tǒng))；直接抑制Cas9蛋白核酸酶的活性，等等。雖然抗CRISPR蛋白之間幾乎沒(méi)有同源性，但通常在抗CRISPR位點(diǎn)(稱之為anti-CRISPR associated protein, ACA)中存在HTH(helix?turn?helix)調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域，因此可以通過(guò)關(guān)聯(lián)分析推斷新的ACA同源蛋白。鑒于抗CRISPR蛋白對(duì)于噬菌體抵抗細(xì)菌防御的重要作用，可以通過(guò)生物信息學(xué)策略來(lái)發(fā)現(xiàn)其余未知的抗CRISPR蛋白，包括靶向RNA的VI CRISPR核酸酶Cas13[6,21,23~27]?？笴RISPR蛋白提供了一種天然的策略來(lái)減輕CRISPR基因編輯所引起的脫靶效應(yīng)和基因毒性等問(wèn)題，另外一些抗CRISPR蛋白也可能起到抑制某些轉(zhuǎn)錄因子活性的作用。但哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的抗CRISPR蛋白的特異性還需要進(jìn)一步地評(píng)價(jià)和研究[6,21,23~27]。隨著越來(lái)越多的抗CRISPR蛋白被發(fā)現(xiàn)，科研人員已建立一個(gè)不斷更新的數(shù)據(jù)庫(kù)，該數(shù)據(jù)庫(kù)包含抗CRISPR蛋白名稱、蛋白亞型、參考文獻(xiàn)和氨基酸序列等信息[50]。2019年，中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所高璞團(tuán)隊(duì)[51]研究結(jié)果顯示，抗CRISPR蛋白AcrIIC2和AcrIIC3能通過(guò)多種機(jī)制抑制CRISPR/Cas9的活性，AcrIIC2二聚體與Cas9蛋白相互作用可以干擾其與RNA的結(jié)合，并且阻止DNA組裝到Cas9蛋白質(zhì)內(nèi)。AcrIIC3能結(jié)合到Cas9蛋白HNH結(jié)構(gòu)域的一個(gè)非保守區(qū)，也可以與Cas9的REC葉形成相互作用，并導(dǎo)致AcrIIC3-Cas9復(fù)合物的二聚化，也能特異性地抑制NmeCas9的活性。2019年，美國(guó)加利福尼亞大學(xué)Jiang等[52]報(bào)道了溫度可以調(diào)節(jié)抗CRISPR蛋白的活性。該研究表明在室溫22℃和人體溫度37℃條件下，AcrIIA2和其同源物AcrIIA2b，由于其蛋白結(jié)構(gòu)和蛋白相互結(jié)合環(huán)境的變化，導(dǎo)致其在不同溫度下顯示出不同的抗CRISPR蛋白活性，可以通過(guò)條件變化來(lái)調(diào)節(jié)抗CRISPR蛋白的活性。

2.2.2 小分子化合物抑制劑

Cas9小分子化合物抑制劑可以通過(guò)被動(dòng)擴(kuò)散較容易地進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，對(duì)蛋白酶穩(wěn)定，沒(méi)有免疫原性，可以批量生產(chǎn)制備成為性質(zhì)均一穩(wěn)定的化合物，具有劑量依賴和時(shí)空調(diào)控等特性，能夠克服上述抗CRISPR蛋白可能存在的一些問(wèn)題，因此具有更加廣闊的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用前景。但是，由于目前此類小分子化合物篩選方法等條件限制，開(kāi)發(fā)出具有抑制Cas9酶活性的小分子化合物還十分困難，原因包括：(1) Cas9具有新的蛋白質(zhì)折疊結(jié)構(gòu)，限制了目前已知的設(shè)計(jì)方法的應(yīng)用；(2) Cas9小分子抑制劑的鑒定需要多種敏感、特異性、高通量的分析方法，這些篩選方法目前尚不成熟和穩(wěn)定；(3) Cas9是一種單一的轉(zhuǎn)換酶，它以皮摩爾(picomolar)親和力固定在底物上，使高通量分析變得更加復(fù)雜；(4)抑制Cas9酶的活性需要兩種核酸酶結(jié)構(gòu)域同時(shí)失活；(5) Cas9屬于DNA結(jié)合蛋白類，通常認(rèn)為在化學(xué)上難以被處理。2019年，美國(guó)哈佛大學(xué)Maji等[22]通過(guò)高通量篩選平臺(tái)獲得一個(gè)能抑制化膿性鏈球菌Cas9 (SpCas9)活性的小分子化合物，其分子量小于500 Da，具有細(xì)胞可滲透性、可逆性結(jié)合和性質(zhì)穩(wěn)定等特性。研究人員使用兩種方法對(duì)CRISPR/Cas9的活性進(jìn)行高通量篩選：第一種方法首先監(jiān)測(cè)SpCas9蛋白能否與熒光標(biāo)記DNA相互結(jié)合；第二種方法是通過(guò)評(píng)估熒光強(qiáng)度發(fā)生的變化，來(lái)說(shuō)明SpCas9完成了對(duì)DNA的剪切作用。若某種小分子能干擾SpCas9與DNA的結(jié)合或?qū)δ繕?biāo)DNA的剪切，則說(shuō)明這種小分子對(duì)CRISPR/Cas9系統(tǒng)產(chǎn)生了有效的抑制作用。研究人員通過(guò)篩選大約1.5萬(wàn)種化合物，成功地篩選出兩種對(duì)SpCas9有抑制活性的化合物，并確定了一個(gè)具有SpCas9抑制作用的藥效團(tuán)結(jié)構(gòu)。根據(jù)藥效團(tuán)結(jié)構(gòu)人工合成的小分子化合物，也具有與天然化合物類似的功能[22]。

2.2.3 核酸小分子抑制劑

2019年，美國(guó)南伊利諾伊大學(xué)Barkau等[53]報(bào)道了他們?cè)O(shè)計(jì)的SpCas9核酸小分子抑制劑(small nucleic acid-based inhibitors, SNuBs)。根據(jù)CRISPR/ Cas9的作用機(jī)理，設(shè)計(jì)特異性2-O-甲基修飾的寡核苷酸，通過(guò)寡核苷酸特異性結(jié)合到CRISPR的RNA引導(dǎo)序列(anti-guide)、重復(fù)序列(anti-tracr)或者spCas9間隔基序(PAM) (anti-PAM)，抑制Cas9的生物學(xué)活性。該研究顯示，當(dāng)使用核酸小分子同時(shí)結(jié)合到anti-PAM和anti-tracr分子時(shí)，具有更好的協(xié)同抑制作用，能夠以較高的親和力、有效地抑制Cas9酶對(duì)靶DNA的切割活性。在anti-tracr分子中摻入2′F-RNA和鎖定特異性核苷酸，會(huì)產(chǎn)生更大的抑制活性，并且能夠在人類細(xì)胞中以劑量依賴的方式抑制基因編輯效率?？笴RISPR核酸代表了一類新的CRISPR/Cas9抑制劑，有助于CRISPR依賴的基因編輯技術(shù)的安全應(yīng)用。美國(guó)加利福尼亞大學(xué)Dowdy[54]對(duì)該項(xiàng)研究給予高度評(píng)價(jià)，將其與RNA治療中的siRNA相比較，認(rèn)為反義寡核苷酸可以結(jié)合和抑制CRISPR-Cas9 sgRNA，是一種提高基因編輯安全性使用的有效方法，也是使Cas9蛋白失活最為簡(jiǎn)單的方法，具有較好的應(yīng)用前景[54]。

2.2.4 組織特異性microRNA

為了使CRISPR/Cas9能在靶器官中發(fā)揮其基因編輯活性，在非靶組織和細(xì)胞中不能編輯目的基因，科研人員嘗試使用特異性啟動(dòng)子、具有靶器官特異性血清型的腺相關(guān)病毒載體(adenovirus associated virus, AAV)進(jìn)行組織和細(xì)胞的靶向性基因編輯。但是目前已知的細(xì)胞特異性啟動(dòng)子還十分有限，不同血清型的AAV的器官特異性也不強(qiáng)，因此不能解決基因編輯技術(shù)在靶細(xì)胞和靶器官中發(fā)揮其基因編輯活性的問(wèn)題。2019年，美國(guó)馬薩諸塞大學(xué)研究人員通過(guò)組織特異性microRNA(miRNA)的方法來(lái)嘗試解決組織特異性問(wèn)題[55]。該研究構(gòu)建了重組AAV載體，含引導(dǎo)RNA、Cas9酶和Cas9酶抑制蛋白(anti- CRISPR protein, Acr) AcrIIC3，但是在Acr的3′UTR區(qū)插入內(nèi)源性的組織特異性miRNA結(jié)合序列，當(dāng)靶細(xì)胞表達(dá)特異性miRNA時(shí)，能夠抑制該重組AAV載體中Acr的表達(dá)，因此Cas9蛋白表達(dá)和發(fā)揮基因編輯活性，從而達(dá)到組織特異性編輯靶基因的目的。早在2002年人們就發(fā)現(xiàn)了在特定組織中特異性表達(dá)的miRNAs，例如在肝臟組織中特異性表達(dá)miR-122，將miR-122結(jié)合序列插入含Acr基因的CRISPR/Cas9系統(tǒng)后，只能在肝臟組織中發(fā)揮基因編輯功能，在其他組織和細(xì)胞中無(wú)Cas9活性[55]。2019年，Hoffmann等[56]也通過(guò)miRNA調(diào)控CRISPR/ Cas9基因編輯活性。該研究將兩個(gè)分別在肝臟和心臟表達(dá)的miR-122或miR-1調(diào)控序列，分別插入到Acr基因的3′UTR，將其與含Cas9和sgRNAs的載體共轉(zhuǎn)染到肝臟或心肌細(xì)胞，觀察到在肝細(xì)胞和心肌細(xì)胞中Cas9酶的活性，從而發(fā)揮基因編輯作用，以解決組織特異性及脫靶問(wèn)題。同時(shí)，該研究在含AcrIIA4、AcrIIC1和AcrIIC3等多種抗CRISPR系統(tǒng)中驗(yàn)證了該組織特異性基因編輯系統(tǒng)的有效性。

3 結(jié)語(yǔ)與展望

精準(zhǔn)調(diào)控Cas9蛋白活性的方法主要包括：通過(guò)藥物、光等調(diào)控Cas9蛋白活性和降解Cas9蛋白；通過(guò)抗CRISPR蛋白、小分子化合物抑制劑、核酸小分子抑制劑及組織特異性microRNA等，抑制Cas9蛋白酶的活性。其中抗CRISPR蛋白應(yīng)用前景非常廣闊。自2013年發(fā)現(xiàn)第一個(gè)抗CRISPR蛋白以來(lái)，目前已發(fā)現(xiàn)40多個(gè)抗CRISPR蛋白，其中11個(gè)已知其作用機(jī)制[6]。但是大多數(shù)CRISPR系統(tǒng)目前沒(méi)有明確其抗CRISPR蛋白，有待進(jìn)一步被發(fā)現(xiàn)?？笴RISPR蛋白的作用機(jī)制也需要進(jìn)一步被解析，多數(shù)已知的抗CRISPR蛋白的作用機(jī)制仍不清楚?？梢愿鶕?jù)抗CRISPR蛋白的作用機(jī)制，設(shè)計(jì)出新的調(diào)控CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的策略及方法?？笴RISPR/Cas9小分子化合物具有易精準(zhǔn)控制、使用方便等特點(diǎn)，因此也具有非常廣闊的應(yīng)用前景，但是，目前由于缺乏高通量、敏感、低成本的篩選方法，以及Cas9蛋白酶與底物的親和力較低、酶催化效率低等原因，尋找這樣的小分子化合物還非常困難[22]。隨著篩選方法的不斷完善，尋找新的能抑制Cas9酶活性的小分子化合物，設(shè)計(jì)出能同時(shí)靶向多個(gè)靶點(diǎn)的小分子化合物，是調(diào)控基因編輯技術(shù)的主要發(fā)展方向之一[57]。隨著基因編輯技術(shù)的快速發(fā)展，新的基因編輯技術(shù)也在不斷涌現(xiàn)，因此需要不斷面對(duì)新的基因編輯技術(shù)所帶來(lái)的挑戰(zhàn)，需要不斷設(shè)計(jì)出低免疫原性、靶向多種作用機(jī)制的合成分子，以及能在時(shí)間和空間上精準(zhǔn)調(diào)控基因編輯技術(shù)的多種抗CRISPR技術(shù)和手段[8,57]。精準(zhǔn)、高效調(diào)控CRISPR/ Cas9系統(tǒng)也需要多種調(diào)控方法的聯(lián)合應(yīng)用，通過(guò)不同的作用機(jī)制，在不同層面上進(jìn)行精準(zhǔn)調(diào)控CRISPR/ Cas9的生物學(xué)作用?？傊?，隨著CRISPR/Cas9調(diào)控技術(shù)的不斷成熟和完善，可以有效地保證基因編輯技術(shù)的合理應(yīng)用和防范基因編輯技術(shù)繆用，為解決生物恐怖威脅等生物安全問(wèn)題提供技術(shù)方法。

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Advances in precise regulation of CRISPR/Cas9 gene editing technology

Junxia Cao1, Youliang Wang2, Zhengxu Wang1,3

Gene editing is a genetic engineering technology that can modify, delete, or insert a small piece of DNA at a specific point in the genome of cells and organisms.Gene editing technology holds great promises in the fields of disease treatment, gene function regulation, gene detection, drug research and development, and crop breeding. However, side effects, such as off-target editing, genotoxicity and other issues, have gradually emerged in the application. In the CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) system, the Cas9 nuclease can specifically recognize the target DNA by the base pairing of a guide RNA (gRNA) with the target DNA. Upon target recognition, the two DNA strands are cleaved by distinct domains of the Cas9 nuclease. Since both Cas9 nuclease and gRNA possess different characteristics in their own activities, recognition sites and binding ability to specific target, it is essential to precisely regulate the activity of Cas9 nuclease and gRNA in both time and space manners, thus preventing the risk of side effects and enhancing the precise regulation of the CRISPR/Cas9 gene editing technology. In this review, we summarize the advances in the precise control of gene editing, especially CRISPR/cas9 over several dimensions using fusion Cas9 proteins regulated by light, temperature and drugs, exploiting and screening anti-CRISPRs proteins, synthesizing and identifying small molecules- inhibitors, and developing other therapeutic agents, thereby providing a reference and research ideas for human disease treatment, crop and livestock improvement and prevention of biotechnology misuse.

gene editing; control of gene editing; anti-CRISPR protein; small molecular inhibitors

2020-03-13;

2020-11-02

“十三五”科研計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào)：19LBJ1029C)資助[Supported by the 13th Five Year Research Project (No. 19LBJ1029C)]

曹俊霞，博士，助理研究員，研究方向：生物治療。E-mail: jxcao2080@139.com

王征旭，博士，副主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，研究方向：生物治療。E-mail: zhxuwang@qq.com

10.16288/j.yczz.20-069

2020/12/9 10:00:09

URI: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20201208.1112.001.html

(責(zé)任編委: 谷峰)