Cu2+對序批式反應器中活性污泥胞外聚合物產(chǎn)量及其組分的影響?

李姍姍， 朱四富， 馬丙瑞， 于娜玲， 趙長坤， 信帥帥， 潘云浩， 吳淑妍， 武原原， 高孟春??

(1. 中國海洋大學海洋環(huán)境與生態(tài)教育部重點實驗室，山東 青島 266100； 2. 青島市海泊河污水處理廠，山東 青島 266021；3. 中國海洋大學環(huán)境科學與工程學院，山東 青島 266100)

Cu2+廣泛存在于電鍍、印刷、電子制造、金屬加工工業(yè)及養(yǎng)殖業(yè)廢水中。銅是微生物生長必不可少的微量元素，但濃度過高會對微生物造成危害，干擾細胞的新陳代謝[1]，同時引起脂質(zhì)過氧化、蛋白質(zhì)破壞和酶活性抑制[2]。由于污水生物處理系統(tǒng)主要依靠微生物對污水進行處理，因此廢水中的Cu2+可能通過抑制微生物活性而改變廢水生物處理系統(tǒng)中活性污泥(或生物膜)的生化特性，引起微生物群落結(jié)構(gòu)變化，從而影響污水生物處理系統(tǒng)對廢水中有機物和氮等污染物的去除效果。序批式反應器(Sequencing Batch Reactor，簡稱SBR)對極端條件具有較強的耐受性，SBR常用來處理含銅廢水[3]。許多學者研究了Cu2+對SBR去除有機物和脫氮性能的影響[4-7]。Wang等[3]研究發(fā)現(xiàn)長期暴露條件下，濃度為10～50 mg·L-1的Cu2+能抑制SBR的脫氮性能，且抑制程度隨Cu2+濃度升高而增加。Liu等[8]研究發(fā)現(xiàn)長期運行條件下濃度為5 mg·L-1的Cu2+能導致SBR對COD和氨氮的去除率下降。

在污水生物處理過程中，微生物分泌的胞外聚合物(Extracellular Polymeric Substances，簡稱EPS)能夠影響活性污泥表面電荷、絮體結(jié)構(gòu)、絮凝性、沉降性及脫水性[9-10]。EPS的化學成分主要包括多糖、蛋白質(zhì)、腐殖質(zhì)和DNA等，其中存在大量的羧基、磷酸基、胺基和羥基等帶電官能團，這些官能團具有吸附和粘附性能。活性污泥可以通過增加EPS的分泌有效吸附廢水中的重金屬，從而減少重金屬對活性污泥中功能菌的潛在毒性[11-15]。已有文獻報道，廢水中Cu2+的存在能夠影響活性污泥中EPS的產(chǎn)量。Wang等[3]和Ma等[16]發(fā)現(xiàn)Cu2+濃度范圍分別為10～50 mg·L-1和1～10 mg·L-1時，隨Cu2+濃度升高活性污泥和生物膜中EPS含量逐漸升高。而Liu等[8]發(fā)現(xiàn)5 mg·L-1Cu2+長期作用下活性污泥EPS含量逐漸降低。然而，目前關(guān)于Cu2+對活性污泥EPS結(jié)構(gòu)、組分、官能團及化學組成影響的研究鮮有報道。本文研究了在長期暴露條件下10 mg·L-1Cu2+對SBR活性污泥中松散附著EPS(LB-EPS)和緊密附著EPS(TB-EPS)產(chǎn)量的影響，通過傅里葉紅外光譜(FTIR)和X射線光電子能譜(XPS)分析LB-EPS和TB-EPS主要官能團及化學組成的變化。

1 材料與方法

1.1 實驗裝置及運行條件

實驗所用SBR材質(zhì)為有機玻璃，其容積、有效高度、內(nèi)徑和容積交換率分別為7.7 L、50 cm、14 cm和50%。SBR進水通過蠕動泵控制從反應器底部進入，其出水由電磁閥控制從反應器中間排出。SBR每日運行4個周期，每個周期6 h，工作程序如下：進水階段5 min；缺氧階段60 min；好氧階段180 min；缺氧階段60 min；沉淀階段30 min；排水階段5 min；閑置階段20 min。SBR運行過程中，各階段通過時間控制器進行自動調(diào)控；在缺氧階段，通過磁力攪拌器確保污泥和污水充分混合，反應器中溶解氧濃度小于0.5 mg·L-1。SBR采用底部曝氣方式，其曝氣量通過氣體轉(zhuǎn)子流量計調(diào)節(jié)，以保持好氧階段的溶解氧濃度大于2 mg·L-1。定期排放污泥，使污泥齡保持在20 d左右。SBR的運行階段如表1所示。

表1 運行階段Table 1 Operation phase

1.2 接種污泥和進水水質(zhì)

1.3 分析方法

1.4 胞外聚合物提取和分析方法

1.4.1 胞外聚合物提取和測定 EPS的提取采用熱提取法[18]，具體步驟如下：在攪拌階段，從SBR中取40 mL污泥懸浮液，在4 ℃、4 000g條件下離心15 min后棄去上清液，得到濃縮的活性污泥樣品；向活性污泥樣品中加入70 ℃的NaCl溶液(0.05%)定容至40 mL，快速振蕩搖勻1 min，然后在4 ℃、4 000 r·min-1條件下離心15 min，將上清液經(jīng)0.45 μm醋酸纖維素膜過濾得到LB-EPS；再用60 ℃的NaCl溶液(0.05%)補至原體積，快速振蕩搖勻1 min，并將其置于60 ℃條件下水浴30 min，然后在4 ℃、4 000 r·min-1條件下離心15 min，將上清液經(jīng)0.45 μm醋酸纖維素膜過濾得到TB-EPS。PS含量采用蒽酮比色法測定[18]，PN含量采用改進的Folin-酚試劑法測定[19]。

1.4.2 傅里葉變換紅外光譜分析 LB-EPS和TB-EPS樣品的紅外光譜(FTIR)采用傅里葉變換紅外光譜儀(Tensor 27，Bruker Optics，德國)測定。LB-EPS和TB-EPS提取液經(jīng)過冷凍干燥處理后與干燥的光譜純KBr按照1∶100研磨混合，并于一定壓力下保持若干分鐘制成半透明薄片，在400～4 000 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)掃描，檢測器分辨率為4 cm-1。

1.4.3 X射線光電子能譜分析 采用X射線光電子能譜儀(K-Alpha，Thermo Scientific，美國)分析樣品中C、N、O、P及重金屬Cu，激發(fā)源為Al Kα線，功率為150 W，工作時的基礎(chǔ)真空為2.0×10-7Pa，電子結(jié)合能用污染碳的C ls峰(284.6 eV)校正。采用XPS peak 4.1軟件進行譜峰擬合。

2 結(jié)果與討論

2.1 Cu2+對SBR性能的影響

表2 Cu2+的長期暴露對SBR性能的影響Table 2 Effect of Cu2+ on the SBR performance under long-term exposure

2.2 Cu2+對活性污泥EPS產(chǎn)量的影響

圖1為長期暴露條件下Cu2+對活性污泥EPS、LB-EPS和TB-EPS產(chǎn)量的影響。在進水Cu2+濃度為0 mg·L-1的第15天，SBR中活性污泥EPS、LB-EPS和TB-EPS含量分別為(58.95±1.76)、(12.80±0.16)和(46.16±1.91) mg·(g MLVSS)-1。向反應器中加入Cu2+后，當SBR運行至第35天時EPS、LB-EPS和TB-EPS含量與第15天相比無明顯變化；而隨著運行時間的延長，活性污泥中EPS、LB-EPS和TB-EPS含量增加，當SBR運行至第75天時，EPS、LB-EPS和TB-EPS含量分別增加至(76.65±4.05)、(16.34±0.45)和(60.31±4.43) mg·(g MLVSS)-1，與第15天相比，分別增加了27.71%、30.67%和30.03%。上述實驗結(jié)果表明，10 mg·L-1Cu2+的長期作用能夠刺激SBR中活性污泥產(chǎn)生更多EPS、LB-EPS和TB-EPS。隨著運行時間的延長，活性污泥對Cu2+的吸附量逐漸增多。高濃度的Cu2+能干擾細胞的新陳代謝[1]，進而對活性污泥產(chǎn)生毒性，微生物可以通過分泌更多EPS減少重金屬對活性污泥中微生物的毒性[13-15]。Wang等[3]研究發(fā)現(xiàn)隨著進水Cu2+濃度由10 mg·L-1逐漸升高至50 mg·L-1，SBR中活性污泥EPS產(chǎn)量逐漸升高；而Liu等[8]發(fā)現(xiàn)向進水中持續(xù)添加5 mg·L-1Cu2+，SBR中活性污泥EPS產(chǎn)量隨運行時間延長而降低，可能是二者反應器運行方式和實驗條件不同導致研究結(jié)果不同。

(“*”表示該樣品與進水Cu2+濃度為0 mg·L-1時的EPS含量差異性顯著(p<0.05)。Asterisks indicate statistical differences (p<0.05) from the EPS content at 0 mg·L-1Cu2+.)

圖1 長期暴露條件下Cu2+對活性污泥EPS，LB-EPS和TB-EPS產(chǎn)量的影響
Fig.1 Effect of Cu2+on the EPS, LB-EPS and TB-EPS contents of activated sludge under long-term exposure

2.3 Cu2+對LB-EPS和TB-EPS中PN和PS含量的影響

在長期暴露條件下10 mg·L-1Cu2+對活性污泥LB-EPS和TB-EPS中PN和PS含量的影響如圖2所示。在進水Cu2+濃度為0 mg·L-1的第15天，LB-EPS和TB-EPS中PN含量分別為(8.44±0.30)和(30.11±1.80) mg·(g MLVSS)-1。SBR進水中加入Cu2+后，當SBR運行至第35天時，LB-EPS和TB-EPS中PN含量與第15天相比無明顯變化；隨SBR運行時間延長PN含量逐漸上升，當SBR運行至75天時，LB-EPS和TB-EPS中PN含量與第15天相比分別上升了33.14%和41.75% (p<0.05)。在進水Cu2+濃度為0 mg·L-1時，LB-EPS和TB-EPS中PS含量分別為(3.01±0.24)和(13.49±0.59)mg·(g MLVSS)-1，隨運行時間的延長LB-EPS和TB-EPS中PS含量輕微升高。SBR中添加Cu2+后，LB-EPS和TB-EPS中PN/PS均隨SBR運行時間的延長而上升，分別由第15天時的2.81和2.23升高至第75天時的3.19和2.7。由上述結(jié)果可知，在長期暴露條件下10 mg·L-1Cu2+促進活性污泥分泌蛋白質(zhì)和多糖，并且蛋白質(zhì)的增長量高于多糖的增長量。蛋白質(zhì)的部分官能團可以和重金屬離子絡(luò)合以降低重金屬對微生物的毒害作用，隨著持續(xù)向進水中投加Cu2+，SBR中Cu2+濃度的積累可以刺激微生物通過調(diào)整自身的生理代謝活動分泌出更多的蛋白質(zhì)與Cu2+絡(luò)合[14, 20-21]，這導致LB-EPS和TB-EPS中PN含量的增加。

(“*”表示該樣品與進水Cu2+濃度為0 mg·L-1時的樣品差異性顯著(p<0.05)。 Asterisks indicate statistical differences (p<0.05) from the PN or PS content at 0 mg·L-1Cu2+.)

圖2 Cu2+對LB-EPS(a)和TB-EPS(b)中蛋白質(zhì)和多糖含量及蛋白質(zhì)與多糖質(zhì)量比的影響
Fig.2 Effect of Cu2+on the PN and PS contents and PN/PS in LB-EPS (a) and TB-EPS (b)

2.4 Cu2+對LB-EPS和TB-EPS官能團的影響

為了揭示Cu2+對活性污泥LB-EPS和TB-EPS官能團的影響，本研究考察了在第15天和75天時SBR中活性污泥LB-EPS和TB-EPS的FTIR光譜圖變化情況(見圖3)。活性污泥LB-EPS和TB-EPS的FTIR光譜在3 392～3 433 cm-1處的譜峰可歸屬為蛋白質(zhì)N-H鍵的伸縮振動和碳水化合物中O-H鍵的伸縮振動[22-23]。1 622～1 624 cm-1處的譜峰是由蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)中β-折疊的C=O伸縮振動形成的[24]。1 406～1 412 cm-1處的譜峰由蛋白類物質(zhì)羧基中的C-O鍵伸縮振動造成[25]。1 037～1 117 cm-1處的譜峰由多糖類物質(zhì)中的C-O鍵伸縮振動造成[26]。TB-EPS在吸附Cu2+后蛋白質(zhì)中N-H鍵和碳水化合物中O-H鍵的伸縮振動向低波數(shù)移動31 cm-1，說明TB-EPS中蛋白質(zhì)和多糖參與Cu2+的吸附，PN中N-H鍵和PS中O-H鍵的相當對含量減少。在加入Cu2+后，LB-EPS和TB-EPS中C=O鍵的吸收峰變鈍，說明蛋白質(zhì)吸附了大量的Cu2+，C=O鍵的相對含量減少；TB-EPS蛋白類物質(zhì)羧基中C-O鍵吸收峰變?nèi)酰嗵穷愇镔|(zhì)中的C-O鍵的吸收峰發(fā)生紅移，說明Cu2+導致TB-EPS蛋白質(zhì)和多糖中C-O鍵的相對含量減少。波長小于1 000 cm-1為指紋區(qū)，此吸附帶的吸收峰與核酸中的磷酸鹽有關(guān)[27]。進水中未加入Cu2+時，LB-EPS和TB-EPS分別在567和536 cm-1處出現(xiàn)吸收峰，而進水中加入Cu2+后，LB-EPS和TB-EPS在此處的吸收峰均發(fā)生藍移。

圖3 Cu2+對LB-EPS(a)和TB-EPS(b)紅外光譜的影響Fig.3 Effect of Cu2+ on the FTIR spectra of LB-EPS (a) and TB-EPS (b)

2.5 Cu2+作用下活性污泥LB-EPS和TB-EPS的XPS能譜分析

通過XPS測定了LB-EPS和TB-EPS的原子組成和百分含量。圖4為SBR運行至第15天和第75天時LB-EPS和TB-EPS的XPS全譜掃描圖和Cu 2p1高分辨譜圖。表3為Cu2+作用下活性污泥LB-EPS和TB-EPS的XPS能譜參數(shù)。LB-EPS和TB-EPS在284.8、399.4～400、531.1～531.3和132.2～133.6 eV處均有峰，分別對應C 1s、N 1s、O 1s和P 2p。LB-EPS中總C百分含量由第15天時的47.7%下降至第75天時的24.0%，TB-EPS中總C百分含量無明顯變化；LB-EPS和TB-EPS中N百分含量分別由第15天時的7.4%和10.2%下降至第75天時的2.6%和4.7%；LB-EPS和TB-EPS中O百分含量分別由第15天時的36.8%和30.3%增加至55.8%和36.2%；LB-EPS中P百分含量由第15天時的0.7%升高至第75天時的1.0%，TB-EPS中P百分含量變化不明顯。根據(jù)已有報道可知，元素N與蛋白質(zhì)中含氮基團相關(guān)，例如胺基(或酰胺基)[28-30]，這與EPS紅外光譜中相應的吸附帶變化情況一致。與進水中未加入Cu2+時相比，進水中添加Cu2+后的LB-EPS和TB-EPS分別在932.3和932.3 eV處出現(xiàn)明顯峰(見圖4(b))，且Cu的百分含量分別由第15天時的0.2%和0.2%增加至第75天時的0.6%和0.5%。相關(guān)報道指出EPS能吸附重金屬[13-14]，因此加入Cu2+后LB-EPS和TB-EPS中Cu百分含量升高。由表3可知，在進水中未加入Cu2+時，LB-EPS中元素百分含量大小順序為C>O>N。與未加Cu2+相比，進水中加入Cu2+后，LB-EPS中元素百分含量大小順序為O>C>N。

圖4 Cu2+作用下LB-EPS和TB-EPS的XPS全譜掃描圖(a)和Cu 2p1高分辨譜圖(b)Fig.4 XPS wide survey scans (a) and Cu 2p1 XPS spectra (b) of LB-EPS and TB-EPS under Cu2+ stress

表 3 Cu2+作用下活性污泥LB-EPS和TB-EPS的XPS能譜參數(shù)Table 3 Binding energies, atomic percentage and assignments of XPS spectral bands of LB-EPS and TB-EPS under Cu2+ stress

圖5和6分別為C和O兩種元素的XPS高分辨圖譜。由于不同的結(jié)合能對應著不同的化學信息，因此通過對高分辨圖譜的分析可以深入了解EPS的組成情況。由圖5和表3可知，在進水中未加入Cu2+時，LB-EPS和TB-EPS中C可以分為4個峰：284.4 eV處的峰是C-(C, H)峰，為脂類或者氨基酸側(cè)鏈；284.9～285.2 eV處的峰為C-(O, N)，為酰胺、醇或醚胺基；286.0～286.4 eV處的C=O或O-C-O峰，來自羧酸鹽、羰基、酰胺、縮醛或半縮醛；287.8～288.2 eV處的O=C-OH峰來自羧酸和尿酸的羧基或酯基[31-32]。與第15天相比，LB-EPS和TB-EPS中C-(C, H)峰的結(jié)合能均降低，其在總C中的百分含量分別降低了23.7%和9.2%；同樣，O=C-OH的百分含量分別降低了2.9%和1.1%；LB-EPS和TB-EPS中C-(O, N)的百分含量分別升高了14.4%和18.9%，而LB-EPS和TB-EPS中C=O或O-C-O百分含量分別升高了11.3%和下降了8.6%。由圖6和表3可知，LB-EPS和TB-EPS中O可以分為2個峰，C=O(530.8～530.9 eV)，O-C-O或O-C-H(531.9～532.2 eV)[30-31]。當進水中Cu2+濃度為10 mg·L-1后，與進水Cu2+濃度為0 mg·L-1時相比，LB-EPS和TB-EPS中C=O結(jié)合能均下降了0.4 eV，而LB-EPS和TB-EPS中O-C-O(或C-OH)的結(jié)合能分別下降0.3 eV和0.5 eV；LB-EPS和TB-EPS中C=O百分含量分別下降了21.6%和25.7%，而LB-EPS和TB-EPS中O-C-O(或C-OH)的百分含量則分別上升了21.6%和25.7%。C和O基團結(jié)合能的改變表明EPS與Cu2+相互作用伴隨著電荷轉(zhuǎn)移，說明羥基和羧基參與了與Cu2+的相互作用。基團百分含量的變化表明添加Cu2+后EPS的組成成分發(fā)生改變。

((a1) LB-EPS(第15天)；(a2) LB-EPS(第75天)；(b1) TB-EPS(15th day)；(b2) TB-EPS(75th day))

((a1) LB-EPS(第15天)；(a2) LB-EPS (第75天)；(b1) TB-EPS(15th day)；(b2) TB-EPS(75th day))

3 結(jié)論

(2)在10 mg·L-1Cu2+長期暴露條件下，活性污泥中EPS、LB-EPS和TB-EPS產(chǎn)量及LB-EPS和TB-EPS中PN均隨運行時間的延長而升高。

(3)FTIR分析表明，長期暴露條件下10 mg·L-1Cu2+導致TB-EPS中PN的C=O鍵、N-H鍵和C-O鍵相對含量降低。

(4)XPS能譜分析結(jié)果表明，在10 mg·L-1Cu2+長期作用下，LB-EPS和TB-EPS中元素Cu和O含量增加。