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    海灣扇貝促性腺激素釋放激素基因克隆及表達分析?

    2020-12-18 03:40:42李婉茹張玲玲張美溦李若佼李仰平郭振義包振民
    關(guān)鍵詞:扇貝性腺海灣

    李婉茹, 張玲玲,2??, 張美溦, 李若佼, 李仰平, 郭振義, 包振民,2

    (1.中國海洋大學海洋海洋生物遺傳學與育種教育部重點實驗室,山東 青島 266003;2.青島海洋科學與技術(shù)試點國家實驗室海洋漁業(yè)科學與食物產(chǎn)出過程功能實驗室,山東 青島 266237)

    促性腺激素釋放激素(GnRH)是哺乳動物下丘腦分泌合成的多肽類激素,是“下丘腦-垂體-性腺”軸的關(guān)鍵信號分子,其主要功能是通過控制垂體下葉釋放卵泡刺激素(FSH)和黃體生成素(LH)的釋放,調(diào)節(jié)動物性別分化、性腺發(fā)育和生殖過程。Okubo等[1]的研究表明,在大多數(shù)脊椎動物中,GnRH有兩種形式,即GnRH I(mammalian-GnRH)和GnRH II(chicken GnRH),部分硬骨魚除了GnRH I和GnRH II,還有GnRH III(salmon GnRH)。其中,GnRH I的作用是刺激促性腺激素釋放,從而調(diào)節(jié)動物生殖繁育,而其他兩種GnRH則在外側(cè)下丘腦發(fā)揮神經(jīng)調(diào)節(jié)作用。

    近年來,研究者們陸續(xù)發(fā)現(xiàn)GnRH并非脊椎動物所特有,在軟體動物中也廣泛存在[2]。目前研究者們已克隆獲得真蛸(Octopusvulgaris)[3]、劍尖槍烏賊(Uroteuthisedulis)[4]、曼氏無針烏賊(Sepiellajaponica)[5]、海兔(Aplysiacalifornica)[6]、帽貝(Lottiagigantea)[7]、耳鮑(Haliotisasinine)[8]、長牡蠣(Crassostreagigas)[9]、菲律賓蛤仔(Ruditapesphilippinarum)[10]等物種的GnRH基因??茖W家還通過質(zhì)譜獲得了長牡蠣[11]和蝦夷扇貝[12]的GnRH活性肽序列。關(guān)于軟體動物GnRH的功能已在多個物種中報道:在腹足綱動物海兔中,GnRH可通過調(diào)節(jié)肌肉收縮控制末梢組織的運動,但其不具有調(diào)節(jié)生殖的功能[13-14];在同是腹足綱動物的耳鮑中,GnRH則分布在成熟卵巢中,可能參與卵母細胞的發(fā)育[15];在頭足綱動物真蛸中,GnRH除了參與調(diào)節(jié)動物的攝食、記憶和運動外[16],還能促進孕酮、睪酮和雌二醇等激素合成,調(diào)節(jié)卵巢和精巢發(fā)育[17];在貽貝(Mytilusedulis)、長牡蠣、蝦夷扇貝等雙殼類動物中,GnRH能促進性原細胞增殖,加速性腺發(fā)育[18-19],而且注射GnRH活性肽還可以使雌性蝦夷扇貝發(fā)生性轉(zhuǎn),影響性別分化[20]。以上研究表明,GnRH參與調(diào)控軟體動物多種生理過程,包括生殖調(diào)節(jié)。

    目前,軟體動物GnRH生殖調(diào)控機制的研究已取得初步進展。Nuurai等[15]研究發(fā)現(xiàn),耳鮑中GnRH在耳鮑的腦神經(jīng)節(jié)、足神經(jīng)節(jié)和卵巢中均有分布,推測其可能通過自分泌或旁分泌調(diào)控卵巢的發(fā)育;但在蝦夷扇貝中,GnRH主要分布在臟神經(jīng)節(jié),在性腺中并沒有陽性信號,推測主要通過血液轉(zhuǎn)運到精巢,調(diào)控精巢發(fā)育進程,促進精原細胞增殖[12,19]。因而,在不同種類的軟體動物中,GnRH的生殖調(diào)節(jié)功能有明顯差異,而此前對GnRH生殖調(diào)節(jié)機制的研究也主要集中在雌雄異體生物。

    海灣扇貝(Argopectenirradians)為暖水性貝類,原產(chǎn)于美國東海岸,于1980年代初引入中國,現(xiàn)已成為中國扇貝養(yǎng)殖的主要品種之一[21]。海灣扇貝有春、秋兩個繁殖季節(jié),以春季質(zhì)量較好。作為一種雌雄同體的扇貝,海灣扇貝的性別穩(wěn)定,其性腺由位于腹嵴外周緣的精巢和位于內(nèi)側(cè)的卵巢組成。但迄今為止,尚缺乏對海灣扇貝性腺發(fā)育過程中GnRH功能的系統(tǒng)研究。本研究將以海灣扇貝為研究對象,利用RACE技術(shù)克隆其GnRH基因cDNA全長,分析序列結(jié)構(gòu)特征,并跟蹤海灣扇貝生殖周期中GnRH基因在臟神經(jīng)節(jié)及腦足神經(jīng)節(jié)中的動態(tài)表達變化過程,以期深入理解GnRH在雌雄同體動物生殖中的作用。

    1 材料與方法

    1.1 海灣扇貝樣品的獲取

    實驗用海灣扇貝為2015年春季繁育,于2015年8月—2016年3月,取自山東省青島市沙子口養(yǎng)殖區(qū),每月取回1次,每次取樣約50只。將海灣扇貝置于實驗室過濾海水中暫養(yǎng)1天后,挑選15~20只活性良好的扇貝,獲取同一個體的腦足神經(jīng)節(jié)(PGCG)及臟神經(jīng)節(jié)(PVG),于液氮中速凍后,保存于-80℃冰箱備用。

    1.2 海灣扇貝GnRH基因的克隆

    采用傳統(tǒng)酚氯仿抽提法提取海灣扇貝神經(jīng)節(jié)總RNA,用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量,并用NanoDrop2000 (Thermo Scientific) 檢測RNA濃度。參考海灣扇貝轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)以及NCBI數(shù)據(jù)庫中其他物種GnRH基因的全長序列,設(shè)計基因特異引物GSP及相應(yīng)巢式引物NGSP(見表1)。使用SMARTer?RACE 5’/3’試劑盒(Clontech),合成cDNA的第一鏈,并進行5’-RACE和3’-RACE 的PCR擴增。PCR產(chǎn)物經(jīng)QIAquick Gel Extraction Kit 純化后連接到pMD18T 載體(TaKaRa),轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞,涂平板,37 ℃培養(yǎng)過夜。次日,挑取陽性克隆,經(jīng)菌落PCR檢測后,交由生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

    1.3 GnRH基因序列特征分析及系統(tǒng)發(fā)生樹構(gòu)建

    根據(jù)得到的海灣扇貝GnRH基因cDNA全長,翻譯出蛋白質(zhì)全長序列。利用SignalP 4.1及Signal-3L軟件預(yù)測其信號肽,并預(yù)測酶切位點(KR或R),酰胺化修飾位點(G)及活性肽。

    參照文獻[3-5,7-9,22-32],從NCBI下載脊椎動物和無脊椎動物GnRH蛋白序列。利用GeneDoc軟件,對不同物種的蛋白進行多序列比對分析;利用MEGAX軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹,建樹方法選擇NJ鄰接法(Neighbor-Joining),遺傳距離的計算采用p-distance法,bootstrap值設(shè)為1 000。

    1.4 反轉(zhuǎn)錄與實時熒光定量PCR檢測基因表達量

    取1.5 μg RNA,加入1 μL Oligo dT(100 μmol/L)后,將體系用水補至12.5 μL?;靹蚝螅?5 ℃溫育5 min。加入4 μL 5×Buffer、0.5 μL Recombinant RNase Inhibitor (40 U/μL)、2 μL dNTP(10 mmol/L)、1 μL反轉(zhuǎn)錄酶(200 U/μL)?;靹蚝?,42 ℃90 min,72 ℃10 min。

    根據(jù)海灣扇貝GnRH基因序列設(shè)計熒光定量PCR引物,內(nèi)參基因選擇EF1a,熒光定量PCR引物見表1。

    表1 RACE引物及滎光定量PCR引物列表

    實時熒光定量PCR反應(yīng)體系如下:將cDNA稀釋15倍后取2 μL作為模板,加入10 μL SYBR Green I Real-time PCR Master Mix,上、下游引物(2 μmol/L)各4 μL。使用LightCycler480 實時熒光定量PCR 儀(Roche)進行擴增。PCR反應(yīng)條件為94 ℃ 10 min;94 ℃ 15 s,60 ℃1 min,40個循環(huán);94 ℃ 15 s,1個循環(huán)。分析產(chǎn)物的熔解曲線,檢驗引物特異性,并采用2-ΔΔCt方法計算目的基因的相對表達量。使用SPSS 20.0軟件,通過單因素方差分析(one-way ANOVA,Duncan)分析各月份GnRH表達量差異顯著性;使用獨立樣本t檢驗,分析同一月份兩神經(jīng)節(jié)GnRH表達量差異。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 海灣扇貝GnRH基因的cDNA全長克隆

    海灣扇貝GnRH基因的cDNA序列全長1 335 bp,其中5’ UTR614 bp,3’ UTR415 bp,ORF306 bp,編碼101個氨基酸。預(yù)測GnRH前體蛋白分子量為11 kDa,等電點為9.06。SignalP預(yù)測發(fā)現(xiàn)在GnRH前體的5’端存在24個氨基酸的信號肽,結(jié)合酶切位點和酰胺化修飾位點分析推測,活性肽緊隨信號肽之后,是具有酰胺化修飾的11個氨基酸的短肽(QNFHYSNGWQP-amide)(見圖1)。

    (圖中黃色部分為信號肽,紫色為GnRH活性肽,綠色為酰胺化位點,紅色為活性肽的酶切位點。Signal peptide is highlighted in yellow, GnRH-like bioactive peptides in purple, amidation site in green, cleavage sites in red.)

    圖1 海灣扇貝GnRH全長cDNA序列及編碼氨基酸序列
    Fig.1 The full-length cDNA and predicted protein sequence of GnRH fromArgopectenirradians

    2.2 同源分析和系統(tǒng)發(fā)生樹構(gòu)建

    將海灣扇貝GnRH活性肽與人、小鼠等物種的活性肽進行序列比對,結(jié)果表明脊椎動物與軟體動物的GnRH活性肽長度不同,前者為十肽,后者為十一肽和十二肽;但活性肽區(qū)域的保守性較高,N端均為Gln(Q),C端均為酰胺化位點Gly(G)。脊椎動物GnRH活性肽更為相似,相似度介于85%~100%;軟體動物GnRH活性肽序列更為相似,相似度在60%~100%。海灣扇貝GnRH活性肽與蝦夷扇貝一致性最高,為100%;與頭足類和硬骨魚GnRH活性肽的序列一致性分別下降至73%和67%(見表2)。

    利用GnRH蛋白全長序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹,結(jié)果見圖2。所有GnRH蛋白分成兩大進化支:一支由脊椎動物GnRH蛋白組成,其中哺乳動物(人,小鼠)、鳥類(雞,番鴨)和兩棲類(爪蟾,牛蛙)聚在一起,硬骨魚類(斑馬魚,青鳉,虹鱒,櫻鱒)GnRH單獨聚在一起;另一支由軟體動物GnRH蛋白組成,其中海灣扇貝與同為雙殼類的蝦夷扇貝、長牡蠣GnRH聚在一起,頭足類(真蛸,兩種烏賊)和腹足類(帽貝,皺紋盤鮑,綠唇鮑)分別聚為單獨的小支。

    表2 海灣扇貝GnRH活性肽與其他物種GnRH活性肽一致性Table 2 Identities of GnRH-like bioactive peptides of Argopectenirradians with that of other species

    2.3 海灣扇貝GnRH在神經(jīng)節(jié)中的動態(tài)表達變化

    為研究GnRH基因在海灣扇貝生殖調(diào)控中的作用,本文利用實時熒光定量PCR跟蹤了2015年8月—2016年3月期間,GnRH基因在海灣扇貝腦足神經(jīng)節(jié)(PGCG)及臟神經(jīng)節(jié)(PVG)的表達,結(jié)果如圖3所示。GnRH基因在PGCG和PVG中均有表達且均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,峰值出現(xiàn)在11月份。在2015年10月—2016年1月期間,PGCG中GnRH的表達量顯著高于PVG(P<0.05)。

    (人HomosapiensNM_000825.3, 小鼠MusmusculusNM_008145.2, 雞GallusgallusAEZ51861.1, 番雞CairinamoschataAGW18221.1, 爪蟾XenopuslaevisAAA49728.1, 牛蛙RanacatesbeianaAAL05972.1, 斑馬魚DaniorerioCAC18539.1, 青鳉OryziaslatipesBAB16302.1, 虹鱒OncorhynchusmykissAAD43462.1,櫻鱒OncorhynchusmasouAAB63599.1,真蛸OctopusvulgarisBAB86782.1, 薊尖槍烏賊UroteuthisedulisBAH09303.1, 曼式無針烏賊SepiellajaponicaALS92801.1,帽貝LottiagiganteanFC805607.1,皺紋盤鮑HaliotisdiscushannaiBBH51367.1,綠唇鮑HaliotislaevigataAKR13997.1, 長牡蠣CrassostreagigasHQ712119.1, 蝦夷扇貝PatinopectenyessoensisBAH47639.1.)

    圖2 GnRH氨基酸序列系統(tǒng)進化分析及活性肽序列比對
    Fig.2 Phylogenetic tree of GnRH protein and multiple alignments of GnRH-like bioactive peptides

    圖3 2015年8月—2016年3月GnRH基因在海灣扇貝腦足神經(jīng)節(jié)(PGCG)和臟神經(jīng)節(jié)(PVG)中的表達情況
    Fig.3 Relative expression levels ofGnRHin PGCG and PVG ofArgopectenirradiansfrom August 2015 to March 2016

    3 討論

    GnRH在脊椎動物中僅具有保守的生殖功能,而在軟體動物中GnRH的功能則較為多樣化。通過對脊椎動物和軟體動物GnRH活性肽的分析,本研究發(fā)現(xiàn)兩個類群GnRH活性肽在1、4、6、8位具有保守的氨基酸,分別為Gln(Q)、His(H)、Ser(S)和Gly(G),在活性肽N-末端存在焦谷氨酸化修飾(p-Q),在C-末端存在酰胺化修飾(-amide)。而兩個類群GnRH活性肽在長度及某些位置的氨基酸存在差異:脊椎動物GnRH活性肽均為十肽,軟體動物則在2和3位有2個額外的氨基酸(NY或NF),且脊椎動物和頭足類GnRH活性肽在C-末端比雙殼類和腹足類的多出一個Gly,導致軟體動物的活性肽為十一或十二肽。這些序列差異可能是導致兩個類群生物的GnRH功能不同的重要因素。此外,GnRH在脊椎動物和軟體動物中的功能差異還可能與垂體的起源有關(guān)[33]:脊椎動物保守的生殖功能可能依賴于下丘腦-垂體-性腺(HPG)軸的調(diào)控[34],而軟體動物尚未進化出垂體,GnRH可能直接作用于靶器官[33],導致其GnRH具有多種功能。

    GnRH作為一種神經(jīng)肽,主要由神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生。在脊椎動物中,GnRH是由下丘腦分泌產(chǎn)生的[35-38];在無脊椎動物雙齒圍沙蠶(Perinereisaibuhitensis)中,GnRH已被證實是在腦神經(jīng)節(jié)中合成的[39]。雙殼類雖然沒有腦,但有腦足神經(jīng)節(jié)和臟神經(jīng)節(jié)。本研究中,海灣扇貝GnRH基因在兩個神經(jīng)節(jié)中均有表達,這與蝦夷扇貝中的研究結(jié)果相似[12];而在腹足綱動物皺紋盤鮑(Haliotisdiscushannai)中,GnRH也主要在神經(jīng)節(jié)(腦神經(jīng)節(jié)、足神經(jīng)節(jié))中表達[32]。此外,海灣扇貝腦足神經(jīng)節(jié)中GnRH的表達量高于臟神經(jīng)節(jié),但在蝦夷扇貝中GnRH活性肽則被認為主要來自臟神經(jīng)節(jié)[12]。導致這種差異的原因可能有兩種:其一,GnRH基因?qū)Υ菩郛愺w動物和雌雄同體動物的生殖調(diào)控存在差異,蝦夷扇貝為雌雄異體,海灣扇貝則是雌雄同體;其二,本試驗海灣扇貝GnRH表達情況是通過檢測其前體mRNA的表達量進行的,而蝦夷扇貝GnRH的表達情況則是檢測活性肽,不排除腦足神經(jīng)節(jié)中GnRH前體mRNA雖然表達量較高,但由于后續(xù)翻譯及翻譯后加工的效率較差,反而導致其活性肽含量較低。

    為了研究海灣扇貝神經(jīng)節(jié)GnRH在性腺發(fā)育的作用,本研究分析了2015年8月—2016年3月期間青島沙子口海區(qū)的養(yǎng)殖海灣扇貝GnRH基因的表達情況,逐月獲取其神經(jīng)節(jié)和性腺材料,通過對性腺進行石蠟切片確定性腺發(fā)育時期。遺憾的是,可能由于當年海區(qū)營養(yǎng)、水溫等環(huán)境問題,在檢測的所有樣品中性腺均未發(fā)育。但結(jié)合實驗室對養(yǎng)殖蝦夷扇貝和海灣扇貝生殖周期研究的經(jīng)驗,海灣扇貝性腺發(fā)育略晚于蝦夷扇貝。同年9、10月所取臨近海區(qū)蝦夷扇貝處于性腺發(fā)育的增殖期,因此推測海灣扇貝性腺發(fā)育應(yīng)在10月之后。由于海灣扇貝GnRH活性肽與蝦夷扇貝質(zhì)譜鑒定的GnRH活性肽序列完全相同,而蝦夷扇貝GnRH活性肽可調(diào)控精原細胞增殖[34,40],推測海灣扇貝神經(jīng)節(jié)中GnRH在11月份出現(xiàn)的表達高峰,可能跟性腺發(fā)育啟動有關(guān)。

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