HPV mRNA、DNA檢測對宮頸細(xì)胞學(xué)ASCUS分流診斷價(jià)值的Meta分析

陸璐，余慧萍，成建

宮頸癌是常見的婦科惡性腫瘤之一。宮頸脫落細(xì)胞的細(xì)胞學(xué)檢查在宮頸癌篩查中至關(guān)重要，是目前國內(nèi)外宮頸癌篩查指南中不可或缺的方法。未明確診斷意義的非典型鱗狀上皮細(xì)胞（ASCUS）是伯塞斯達(dá)系統(tǒng)（TBS）分類法中最常見的細(xì)胞學(xué)病變描述，其細(xì)胞改變程度較反應(yīng)性改變細(xì)胞明顯，且有進(jìn)展為宮頸上皮內(nèi)瘤變（CIN）Ⅱ級或Ⅲ級等高度鱗狀上皮內(nèi)病變的可能［1］,故對ASCUS 患者進(jìn)行及時(shí)有效地評價(jià)和分流管理，有利于患者的診治和預(yù)后。

2016 年美國婦產(chǎn)科醫(yī)師學(xué)會推薦的宮頸癌篩查及預(yù)防指南建議將高危型人乳頭瘤病毒（HPV）DNA檢測結(jié)果作為ASCUS人群主要的分流依據(jù)，即HPV DNA 陽性者行陰道鏡檢查［2］。但是，由于HPV感染具有一過性的特點(diǎn)，單純HPV DNA檢測可能出現(xiàn)假陽性結(jié)果，造成長期過密的隨訪和不必要的陰道鏡檢查。HPV E6/E7 mRNA檢測是近年來興起的一種新型檢測技術(shù)，可以檢測高危型HPV E6/E7 癌基因的mRNA表達(dá)情況。該檢測方法能較好地反映癌基因的活動(dòng)度，更好地預(yù)測宮頸病變的風(fēng)險(xiǎn)［3］，因此逐漸應(yīng)用于臨床宮頸癌篩查。目前已有較多研究對HPV E6/E7 mRNA 與HPV DNA 檢測技術(shù)在宮頸癌篩查中的診斷準(zhǔn)確性進(jìn)行對比分析，但針對兩者在ASCUS人群分流中應(yīng)用價(jià)值的比較研究尚少見。本研究對關(guān)于HPV E6/E7 mRNA 與HPV DNA 檢測對ASCUS人群分流價(jià)值的診斷研究進(jìn)行Meta分析，以期為臨床優(yōu)化ASCUS 患者的分流處理提供循證醫(yī)學(xué)證據(jù)。

1 資料與方法

1.1 納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）國內(nèi)外公開發(fā)表的關(guān)于HPV E6/E7 mRNA與HPV DNA檢測對ASCUS人群分流價(jià)值的診斷研究。（2）研究中有宮頸HPV E6/E7 mRNA 與HPV DNA 檢測的結(jié)果。（3）以病理組織學(xué)診斷為金標(biāo)準(zhǔn)。（4）有完整的原始數(shù)據(jù)，能直接或間接獲得篩查試驗(yàn)的真陽性值（TP）、假陽性值（FP）、假陰性值（FN）、真陰性值（TN）。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）樣本量≤60例。（2）無病理結(jié)果。（3）數(shù)據(jù)不完整、不能獲得完整資料的文獻(xiàn)。（4）綜述、重復(fù)報(bào)道、會議內(nèi)容等。

1.2 文獻(xiàn)檢索策略 采用主題詞和自由詞相結(jié)合的方式，分別以宮頸、人乳頭瘤病毒、未明確診斷意義的非典型鱗狀上皮 細(xì) 胞、HPV、mRNA 為 中 文 檢 索詞，以cervical、human papillomavirus、HPV、mRNA、E6/E7、ASCUS為英文檢索詞，檢索MEDLINE、EMbase、Cochrane Library、Web of Science、萬方數(shù)據(jù)庫、維普數(shù)據(jù)庫和中國知網(wǎng)（CNKI）等數(shù)據(jù)庫，并采用文獻(xiàn)追溯等方法搜集關(guān)于HPV E6/E7 mRNA 與HPV DNA 檢測對ASCUS 人群分流診斷價(jià)值的研究。語言限制為中、英文。檢索時(shí)限為2010年1月1日—2019年12月31日。

1.3 文獻(xiàn)篩選及數(shù)據(jù)提取 由2 位研究者分別獨(dú)立根據(jù)納入與排除標(biāo)準(zhǔn)篩選文獻(xiàn)。首先，閱讀文題和摘要，剔除重復(fù)、不符合納入與排除標(biāo)準(zhǔn)的文獻(xiàn)，對于部分重復(fù)發(fā)表或數(shù)據(jù)有重疊現(xiàn)象的文獻(xiàn)，選取樣本量最大、最近發(fā)表或信息最詳細(xì)者；其次，對可能納入的文獻(xiàn)進(jìn)一步閱讀全文并交叉核對結(jié)果；最后，對存在異議的文獻(xiàn)，則研究小組討論決定是否納入。對納入文獻(xiàn)提取以下數(shù)據(jù)資料：（1）研究的基本信息，包括第一作者、發(fā)表時(shí)間、國家等。（2）研究對象的基本特征，包括樣本量、年齡等；HPV mRNA和HPV DNA檢測選用試劑盒的檢測原理，如HPV mRNA 檢測選用PreTect HPV-Proofer、APTIMATM等試劑盒檢測原理；HPV DNA 檢測選用第二代雜交捕獲法（Hybrid Capture 2，HCⅡ）或PCR 反向雜交等原理。（3）偏倚風(fēng)險(xiǎn)評價(jià)的關(guān)鍵要素，包括病例選擇（Patient Selection）、待評價(jià)試驗(yàn)（Index Test）、金標(biāo)準(zhǔn)（Reference Standard）及病例流程和進(jìn)展情況（Flow and Timing）4個(gè)部分。（4）實(shí)驗(yàn)原始數(shù)據(jù)，直接獲取或計(jì)算得出TP、FP、FN、TN。

1.4 納入研究的偏倚風(fēng)險(xiǎn)評價(jià) 采用RevMan 5.3 軟件中的診斷性試驗(yàn)準(zhǔn)確性質(zhì)量評價(jià)工具-2（QUADAS-2）對納入研究進(jìn)行偏倚風(fēng)險(xiǎn)評價(jià)。由2名評價(jià)者根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)獨(dú)立評價(jià)，如遇分歧，則研究小組討論協(xié)商。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Meta-Disc 1.4軟件檢測異質(zhì)性，包括閾值效應(yīng)和非閾值效應(yīng)引起的異質(zhì)性及異質(zhì)性來源。采用敏感度對數(shù)與（1-特異度）對數(shù)的Spearman 相關(guān)系數(shù)檢驗(yàn)是否存在閾值效應(yīng)，P≥0.05表示不存在閾值效應(yīng)。以診斷比值比（DOR）為效應(yīng)量，對不同檢測方法的DOR 進(jìn)行Cochrane-Q 檢驗(yàn)，檢測水準(zhǔn)α=0.1，同時(shí)結(jié)合I2判斷異質(zhì)性大小。當(dāng)P＞0.1和I2≤50%，無異質(zhì)性，采用固定效應(yīng)模型進(jìn)行Meta 分析；當(dāng)P≤0.1或I2＞50%，存在異質(zhì)性，則進(jìn)一步分析異質(zhì)性來源，采用隨機(jī)效應(yīng)模型進(jìn)行Meta 分析。計(jì)算HPV E6/E7 mRNA和HPV DNA檢測合并的敏感度（SEN）、特異度（SPE）、陽性似然比（PLR）、陰性似然比（NLR）及其95%CI。采用線性模型擬合受試者工作特征（SROC）曲線，計(jì)算曲線下面積（AUC），AUC 越接近1，認(rèn)為診斷價(jià)值越高。采用Stata 12.1軟件，以Egger線性回歸法對納入文獻(xiàn)進(jìn)行偏倚檢測，采用標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)離差（standard normal deviate，SND）對效應(yīng)估計(jì)值的精確度（precision）作回歸分析。SND 的定義為OR與其標(biāo)準(zhǔn)誤（SE）的比值，精確度的定義為SE的倒數(shù)。P＞0.05提示不存在發(fā)表偏倚。

2 結(jié)果

2.1 文獻(xiàn)篩選流程及結(jié)果 初檢出相關(guān)文獻(xiàn)1 536篇。經(jīng)剔除重復(fù)文獻(xiàn)，閱讀摘要及全文后，按照納入、排除標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)一步篩選，最終納入文獻(xiàn)15篇，包括ASCUS患者4 019例。文獻(xiàn)篩選流程及結(jié)果見圖1。納入研究的基本特征見表1。

Fig.1 Flow diagram of screening articles圖1 文獻(xiàn)篩選流程圖

2.2 所納入的研究偏倚風(fēng)險(xiǎn)評價(jià)結(jié)果 15 項(xiàng)研究均說明了納入研究對象的條件，其中5 項(xiàng)未能避免不恰當(dāng)?shù)呐懦?5項(xiàng)研究均對研究對象進(jìn)行宮頸活檢，7項(xiàng)研究采用了盲法，具有可靠的金標(biāo)準(zhǔn)；6項(xiàng)研究描述了初步篩查與陰道鏡活檢的時(shí)間間隔。各研究的偏倚風(fēng)險(xiǎn)評價(jià)結(jié)果見圖2。

2.3 異質(zhì)性分析結(jié)果 HPV E6/E7 mRNA 與HPV DNA 檢測的Spearman 相關(guān)系數(shù)rs分別為0.222（P=0.427）和0.466（P=0.080），提示不存在閾值效應(yīng)。Q檢驗(yàn)顯示，研究人群中HPV mRNA檢測的Cochrane-Q 為23.610，P=0.051，I2=40.7%；HPV DNA 檢測的Cochrane-Q 為28.570，P=0.012，I2=51.0%，提示各研究結(jié)果間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)異質(zhì)性。

Fig.2 Risk assessment of bias in included studies圖2 納入研究的偏倚風(fēng)險(xiǎn)評價(jià)

Tab.1 The basic characteristics of included studies表1 納入文獻(xiàn)的的基本研究特征

2.4 亞組分析與Meta 回歸分析結(jié)果 將HPV E6/E7 mRNA 檢測和HPV DNA 檢測分別按樣本量、檢測原理進(jìn)行亞組分析。結(jié)果顯示，HPV E6/E7 mRNA 檢測研究間的異質(zhì)性可能與檢測原理有關(guān)，HPV E6/E7 mRNA 檢測和HPV DNA 檢測研究間的異質(zhì)性可能與樣本量有關(guān)，見表2。Meta 回歸分析結(jié)果顯示，2種檢測方法異質(zhì)性來源與以上2種變量無明顯相關(guān)性（均P＞0.05），見表3。

2.5 Meta 分析結(jié)果 異質(zhì)性分析結(jié)果顯示，HPV E6/E7 mRNA、HPV DNA 各研究結(jié)果間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)異質(zhì)性（I2分別為40.7%、51.0%，均P≤0.01），經(jīng)異質(zhì)性分析處理后，仍無法消除，故選擇隨機(jī)效應(yīng)模型合并統(tǒng)計(jì)量。HPV E6/E7 mRNA、HPV DNA 在ASCUS人群檢出CINⅡ+合并的SEN、SPE、PLR、NLR 及其95%CI見表4，其診斷比值比的Meta 分析結(jié)果見圖3、4。建立匯總受試者SROC 曲線，2 種檢測方法檢出CINⅡ+的AUC 分別為0.847 和0.760，見圖5、6。結(jié)果顯示，除SEN 外，HPV E6/E7 mRNA 檢測在ASCUS 人群檢出CINⅡ+的宮頸病變的診斷效能優(yōu)于HPV DNA檢測。

2.6 發(fā)表偏倚評估 HPV E6/E7 mRNA、HPV DNA各研究均不存在明顯的發(fā)表偏倚（P分別為0.134和0.163），見圖7。

Tab.2 Subgroup analysis results of included studies表2 納入研究異質(zhì)性的亞組分析結(jié)果

Tab.3 Meta regression analysis results of two detection methods表3 2種檢測方法的Meta回歸分析結(jié)果

Tab.4 Combined results of the two test methods表4 2種檢測方法的合并診斷效能

3 討論

美國癌癥學(xué)會（ACS）發(fā)布的“全球癌癥統(tǒng)計(jì)2018”顯示，在全球185 個(gè)國家的860 萬例女性癌癥新發(fā)病例及420 萬癌癥死亡病例中，宮頸癌的發(fā)病率（6.6%）、死亡率（7.5%）均排名第4 位［19］。2019 年中國國家癌癥中心發(fā)布的全國癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，2015 年我國宮頸癌發(fā)病率位居女性惡性腫瘤第6位，死亡率位居女性惡性腫瘤第8 位。普及防癌知識，開展宮頸癌篩查，做到早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療可以有效降低宮頸癌的發(fā)病率、死亡率，尤其是在經(jīng)濟(jì)衛(wèi)生條件相對落后的農(nóng)村地區(qū)。宮頸脫落細(xì)胞的細(xì)胞學(xué)檢測是目前宮頸癌篩查策略的基礎(chǔ)，按照現(xiàn)有的篩查策略，臨床醫(yī)師會建議細(xì)胞病理診斷為ASCUS的患者進(jìn)一步接受HPV檢測。

目前研究一致認(rèn)為，宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展與高危型HPV 的感染有關(guān)［20］。但女性一生中感染HPV 的概率高達(dá)80%，其中絕大部分感染是一過性的，2～3年可被自身免疫清除，超過91%的ASCUS及低度鱗狀上皮內(nèi)病變（LSIL）患者HPV 感染在6～24 個(gè)月自動(dòng)清除［21］。在宮頸上皮細(xì)胞癌變過程中，HPV 需將其E6/E7 DNA 整合入宮頸上皮細(xì)胞基因組中，轉(zhuǎn)錄生成E6/E7癌蛋白，兩者分別與抑癌蛋白p53和pRb結(jié)合，干擾細(xì)胞周期調(diào)節(jié)，導(dǎo)致細(xì)胞無限分裂最終引起癌變［22］。E6/E7 mRNA 正是病毒癌基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，其在宮頸上皮細(xì)胞的過度表達(dá)是導(dǎo)致宮頸癌的關(guān)鍵因素［23］。

Fig.3 Meta analysis of diagnostic ratio of HPV E6/E7 mRNA test圖3 HPV E6/E7 mRNA檢測診斷比值比的Meta分析

Fig.4 Meta analysis of diagnostic ratio of HPV DNA test圖4 HPV DNA檢測診斷比值比的Meta分析

Fig.5 SROC curve of HPV E6/E7 mRNA diagnosis for CINⅡ+in research objects圖5 研究對象中HPV E6/E7 mRNA檢測診斷CINⅡ+的SROC曲線

Fig.6 SROC curve of HPV DNA diagnosis for CINⅡ+in research objects圖6 研究對象中HPV DNA檢測診斷CINⅡ+的SROC曲線

Fig.7 Funnel plots for assessment in published literature圖7 發(fā)表偏倚評估漏斗圖

近年來，文獻(xiàn)報(bào)道了HPV E6/E7 mRNA 檢測在ASCUS人群中的分流診斷價(jià)值，但與HPV DNA檢測相比，其診斷效能仍存爭議。本研究共納入15項(xiàng)研究，共計(jì)4 019 例患者，系統(tǒng)比較2 種檢測方法對ASCUS 人群的分流診斷價(jià)值。Meta 分析結(jié)果顯示，與HPV DNA 檢測相比，HPV E6/E7 mRNA 檢測的合并敏感度低、特異度高，提示其在ASCUS 人群中檢出CINⅡ+的價(jià)值優(yōu)于HPV DNA檢測，這與國外一篇薈萃分析［24］結(jié)論一致，分析其原因可能與2 種檢測方法的檢測原理有關(guān)。HPV DNA 檢測是對宿主細(xì)胞內(nèi)游離狀態(tài)與整合狀態(tài)的HPV DNA進(jìn)行檢測，無法判斷HPV感染階段和病毒癌基因的活性情況；而HPV mRNA檢測僅檢測整合狀態(tài)的病毒RNA片段，大大降低了假陽性出現(xiàn)的概率。同時(shí)，根據(jù)SROC曲線，2種檢測方法的AUC 分別為0.847和0.760，提示HPV E6/E7 mRNA 檢測的診斷效能優(yōu)于HPV DNA檢測，有望成為ASCUS患者分流的一種更為有效的檢測方法。此外，HPV E6/E7 mRNA 檢測的陽性似然比高于HPV DNA 檢測，分別為2.40 和1.59，提示E6/E7 mRNA 陽性的ASCUS 患者較HPV DNA陽性者更易出現(xiàn)CINⅡ+病變。因此，對于HPV E6/E7 mRNA 陽性的ASCUS 患者，應(yīng)引起警惕，并采取更積極的治療方案，從而改善患者的臨床結(jié)局；但HPV E6/E7 mRNA檢測敏感度低可能會引起一定的漏診，并且國內(nèi)外對其定量檢測的最佳診斷臨界點(diǎn)尚存爭議［25］。因此，在細(xì)胞學(xué)檢查的基礎(chǔ)上，開展HPV E6/E7 mRNA 檢測對ASCUS 人群進(jìn)行分流，尚需高質(zhì)量、大樣本的臨床數(shù)據(jù)支持。臨床上應(yīng)對各項(xiàng)HPV 檢測技術(shù)進(jìn)行客觀、科學(xué)的評價(jià)，并結(jié)合中國醫(yī)療現(xiàn)狀，制定出適應(yīng)我國國情的宮頸癌篩查策略。

在異質(zhì)性分析時(shí)，亞組分析結(jié)果顯示，HPV E6/E7 mRNA 檢測研究間的異質(zhì)性可能與檢測原理的差異有關(guān)；而HPV DNA檢測研究間的異質(zhì)性可能與研究樣本量有關(guān)。通常小樣本研究可能會呈現(xiàn)更好的診斷準(zhǔn)確性，納入研究的檢測原理不同、選擇試劑盒的差異甚至檢測儀器的不同，均會引起測量偏倚，導(dǎo)致異質(zhì)性的出現(xiàn)。由于本研究進(jìn)行Meta 回歸時(shí)未能找出異質(zhì)性的主要來源，故影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。本研究尚有一定局限性：（1）納入的研究僅為中、英文文獻(xiàn)，其他語種文獻(xiàn)未能納入。（2）部分納入的研究質(zhì)量不高，未提及是否使用盲法。（3）納入的研究檢測原理不盡相同，雖進(jìn)行了亞組分析，但異質(zhì)性仍無法消除，可能與研究設(shè)計(jì)不同、研究對象的種族年齡存在差異有關(guān)。

綜上所述，對于ASCUS患者，HPV E6/E7 mRNA和HPV DNA檢測在診斷CINⅡ+的宮頸病變中，均具有一定的診斷價(jià)值，HPV E6/E7 mRNA 檢測的診斷效能優(yōu)于HPV DNA 檢測，尤其是其檢測特異度較高。由于納入研究的對象和質(zhì)量有限，上述結(jié)論仍有待進(jìn)一步研究驗(yàn)證。